吳振起，任園園，王楠，王雪飛

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，遼寧 沈陽 110847)

有關(guān)哮喘，最早將其作為獨(dú)立病名的是朱丹溪的《丹溪心法·喘論》，其言“哮喘其證有二，不離痰火……”后沿用至今，哮喘病因復(fù)雜，中醫(yī)認(rèn)為其為多種致病因素共同作用而致，可概括為痰飲內(nèi)伏、邪氣侵襲、飲食不節(jié)、情志內(nèi)傷及體質(zhì)因素[1]。從西醫(yī)角度來看，哮喘是涉及多種細(xì)胞及細(xì)胞因子并伴隨有支氣管收縮、氣道高反應(yīng)性、氣道重塑的一種慢性炎癥性疾病，主要與氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥、遺傳基因及過敏等因素有關(guān)[2]。

定喘湯源于《攝生眾妙方》，由白果、麻黃、蘇子、甘草、款冬花、杏仁、桑白皮、黃芩、法半夏9味中藥組成，是治療風(fēng)寒外束、痰熱內(nèi)蘊(yùn)之哮喘的代表方。方中麻黃宣降肺氣以定喘、兼解表寒，白果斂肺止咳、化痰平喘，兩藥一收一散，既可增強(qiáng)平喘之功，又可防止麻黃過耗肺氣，共為君藥；杏仁、半夏、蘇子、款冬花降氣化痰，增強(qiáng)平喘之功，共為臣藥；桑白皮、黃芩共奏清瀉肺熱、止咳平喘之效，共為佐藥；甘草調(diào)和諸藥為使。本方諸藥合用，使得肺氣宣降，痰熱得清，風(fēng)寒得解，從而達(dá)到治療目的。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)概念于2007年由藥理學(xué)家Hopkins A L教授首次提出[3]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于藥物、基因、靶點(diǎn)以及疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上，經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析，系統(tǒng)了解藥物對(duì)疾病的影響，進(jìn)而揭示出多成分藥物作用于人體的奧秘，這與中醫(yī)治病的整體觀念原則以及中藥復(fù)方多成分、多途徑、多靶點(diǎn)相互作用特點(diǎn)相吻合，為中藥復(fù)方作用機(jī)制的研究提供了新的技術(shù)手段，有利于揭示中藥復(fù)方本質(zhì)、發(fā)現(xiàn)藥物作用靶標(biāo)、指導(dǎo)中藥新的研發(fā)，進(jìn)而為傳承和發(fā)展中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展提供新的支撐[4]。本研究將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究思路與中藥定喘湯相結(jié)合，進(jìn)而探討其治療哮喘的活性成分以及可能的分子作用機(jī)制，旨在為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 建立定喘湯化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫

通過Traditional Chinese Medicine Systems Pharma-cology Database and Analysis Platform 網(wǎng)站(TCMSP)查詢得到定喘湯中藥物(白果、麻黃、蘇子、甘草、款冬花、杏仁、桑白皮、黃芩、半夏)的化學(xué)成分。

1.2 藥物有效成分篩選

將口服生物利用度(OB)≥30%，藥物相似性(DL)≥0.18作為篩選藥物有效成分的標(biāo)準(zhǔn)[5]，并利用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建中藥-化學(xué)成分網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 查找藥物作用靶標(biāo)

在TCMSP網(wǎng)站中找出藥物有效成分所對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)。

1.4 建立疾病靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫

在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索關(guān)鍵詞“asthma”得到與哮喘相關(guān)靶點(diǎn)并通過相關(guān)性得分(relevance csore)進(jìn)行篩選，選取score≥1.5的數(shù)據(jù)構(gòu)建哮喘相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫[6]。

1.5 作用靶點(diǎn)與哮喘靶點(diǎn)的Venn分析

將定喘湯主要化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)與哮喘靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Venn分析，得到兩者共同基因，從而初步得到定喘湯治療哮喘的作用靶點(diǎn)。進(jìn)而將交集靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，限定其研究物種為人，將所有靶基因名稱校正為官方名稱。

1.6 蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將上述得到的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，蛋白種類設(shè)置為“Homo sapiens”(智人)，其余參數(shù)均保持默認(rèn)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，尋找靶點(diǎn)間相互作用關(guān)系；進(jìn)一步根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)理論篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)，其在網(wǎng)絡(luò)中作用尤為顯著。將所得數(shù)據(jù)結(jié)果保存為TSV格式，并導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，進(jìn)一步利用其“Network Analysis”功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治?。根?jù)節(jié)點(diǎn)度值分布(Node Degree Distribution)和介數(shù)中心(Betweenness Centrality)2個(gè)重要網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行篩選，選取兩者同時(shí)在平均值之上的靶點(diǎn)作為定喘湯的關(guān)鍵靶點(diǎn)。根據(jù)Degree值繪制出關(guān)鍵靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)的條形圖。

1.7 “中藥-化學(xué)成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”圖繪制

通過 Cytoscape3.7.2 軟件將中藥、化學(xué)成分及關(guān)鍵靶點(diǎn)相連，繪制出“中藥-化學(xué)成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.8 進(jìn)行GO與KEGG通路富集分析

通過采用R-3.6.1及perl腳本對(duì) PPI 網(wǎng)絡(luò)中的蛋白質(zhì)進(jìn)行基因本體論(GO)生物學(xué)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。從而分析關(guān)鍵靶點(diǎn)參與的生物過程及研究出相關(guān)靶點(diǎn)可能作用的重要通路及藥理學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 定喘湯有效成分

通過在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索，獲得本方藥物成分共1 565個(gè)，將1 565個(gè)成分根據(jù)OB≥30%，DL≥0.18的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，經(jīng)過去重處理，除去45個(gè)重復(fù)成分，最終篩選出195個(gè)有效成分。將這195個(gè)有效成分與中藥構(gòu)建中藥-成分(Herbs-Compounds,H-C)網(wǎng)絡(luò)(圖1)，圖中各成分大小按度中心性(degree)顯示，其數(shù)值越高，圖形顯示越大，并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，根?jù)介數(shù)中心(betweenness centrality)排列，篩選出其中最高的前五位有效成分，其分別為β-谷甾醇(beta-sitosterol，MOL000358)、谷甾醇(sitosterol，MOL000359)、山柰酚(kaempferol，MOL000422)、槲皮素(quercetin，MOL000098)、豆甾醇(stigmasterol，MOL000449)。

圖1 中藥-成分(H-C)網(wǎng)絡(luò)Figure 1 Chinese medicine-ingredients (H-C) network

2.2 藥物與疾病靶點(diǎn)的Venn圖建立

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫收集定喘湯中有效成分的相關(guān)作用靶點(diǎn)，經(jīng)剔除無效及重復(fù)靶點(diǎn)，共收集到331個(gè)有效藥物靶點(diǎn)。此外，通過在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索哮喘相關(guān)靶點(diǎn)并經(jīng)過相關(guān)性得分篩選，共得到1 661個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)。通過對(duì)兩者有效靶點(diǎn)的Venn分析，共得到定喘湯潛在作用于哮喘疾病的164個(gè)靶點(diǎn)基因，如圖2所示。

圖2 Venn圖Figure 2 Venn diagram

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藥物與疾病共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，得到藥物-疾病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)；其中全部164個(gè)靶點(diǎn)皆參與了 PPI 網(wǎng)絡(luò)，無未參與蛋白互作的靶點(diǎn)，其中3 379條連線代表了靶點(diǎn)之間復(fù)雜的相互作用關(guān)系，線條越粗則表示作用越強(qiáng)，最后將其結(jié)果保存為 TSV 格式。

圖3 藥物-疾病靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)Figure 3 PPI network for drug-disease target

2.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

通過將上述PPI網(wǎng)絡(luò)的TSV格式文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，經(jīng)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治觯x取Degree和Betweenness同時(shí)在平均值之上的靶蛋白作為定喘湯的關(guān)鍵靶點(diǎn)。如圖 4、5 所示，其平均度值為41.2，平均介數(shù)值為 5.1×10-3，通過篩選度值、介數(shù)值均超過平均值的靶點(diǎn)，共得到34個(gè)靶點(diǎn)(見表1)，這些靶點(diǎn)在PPI網(wǎng)絡(luò)中處于關(guān)鍵位置，可能是定喘湯發(fā)揮作用的關(guān)鍵所在。將其篩選得到的關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)而得到關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，如圖6所示，在PPI網(wǎng)絡(luò)中，一個(gè)節(jié)點(diǎn)的度(Degree)表示網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點(diǎn)相連的路線條數(shù)。這些連接靶點(diǎn)較多的節(jié)點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中起到關(guān)鍵的作用，根據(jù)節(jié)點(diǎn)的Degree繪制出其關(guān)鍵靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)的條形圖(圖7)，其中排名前12位的關(guān)鍵靶點(diǎn)均與33個(gè)蛋白發(fā)生相互作用，分別為AKT1、ALB、CASP3、CXCL8、EGF、IL6、MAPK1、MAPK3、MAPK8、PTGS2、STAT3、VEGFA。

圖4 度值Figure 4 Degree

圖5 平均介數(shù)值Figure 5 Betweenness

圖6 關(guān)鍵靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)Figure 6 PPI network for key target

圖7 關(guān)鍵靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)的條形圖Figure 7 Bar graph for key target

表1 (續(xù))

表1 定喘湯關(guān)鍵靶點(diǎn)Table 1 Key target for Dingchuan decoction

2.5 “中藥-化學(xué)成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”圖繪制

通過 Cytoscape3.7.2 軟件將中藥、化學(xué)成分及關(guān)鍵靶點(diǎn)相連，繪制出“中藥-化學(xué)成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，見圖8。其中藍(lán)色代表關(guān)鍵靶點(diǎn)，紫色代表各中藥簡稱，黃色代表化學(xué)成分，通過分析發(fā)現(xiàn)，該網(wǎng)絡(luò)圖由238個(gè)節(jié)點(diǎn)和691個(gè)邊組成。其中節(jié)點(diǎn)代表中藥、化學(xué)成分和關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，邊代表三者之間的相互作用關(guān)系。在中藥與關(guān)鍵靶點(diǎn)的對(duì)應(yīng)關(guān)系中，普遍存在多種中藥共有多個(gè)靶點(diǎn)。在化學(xué)成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的對(duì)應(yīng)關(guān)系中，普遍存在一個(gè)化學(xué)成分有多個(gè)靶點(diǎn)及多個(gè)化學(xué)成分對(duì)應(yīng)同一靶點(diǎn)的特點(diǎn)，從而證實(shí)了定喘湯是通過多途徑、多靶點(diǎn)相互作用來發(fā)揮治療效果的。

圖8 “中藥-化學(xué)成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Figure 8 "Chinese medicine-chemical composition-key target" interaction network

2.6 GO富集與KEGG通路富集分析

將34個(gè)關(guān)鍵靶基因通過采用R-3.6.1及perl腳本進(jìn)行 GO 和 KEGG 富集分析。該富集分析過程中，共獲取65個(gè)GO條目，根據(jù)P值<0.05，取排名前20的條目建立條形圖(見圖9)。其過程主要涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、受體配體活性、生長因子受體結(jié)合、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、趨化因子受體結(jié)合、MAPK激酶活性、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性等方面?；谝陨蠋讉€(gè)主要方面，可以推測(cè)定喘湯的平喘作用可能是一個(gè)復(fù)雜的多途徑協(xié)同作用的結(jié)果。此外共獲取151個(gè)KEGG通路，根據(jù)P值<0.05，取排名前 20 的通路建立氣泡圖(見圖 10)，其主要涉及IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化、PI3K-Akt信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Th1和Th2細(xì)胞分化、NF-κB信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、癌癥通路等，說明該方化學(xué)成分可干預(yù)部分通路來達(dá)到治療哮喘的目的。

圖9 GO富集條形圖Figure 9 Bar graph for GO enrichment analysis

圖10 KEGG通路富集氣泡圖Figure 10 Bubble chart for KEGG enrichment analysis

3 討論

本研究得出定喘湯有效化學(xué)成分195 種，并根據(jù)介數(shù)中心值排列，其中β-谷甾醇、豆甾醇為甾醇類物質(zhì)，山柰酚、槲皮素為黃酮類物質(zhì)。已知β-谷甾醇在抗炎、免疫調(diào)節(jié)等方面具有顯著效果，其在某些方面可提高抗炎因子IL-10的活性，減小趨化因子和促炎因子活性，同時(shí)可抑制核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)遷移，其抗炎機(jī)制是通過減少NO的合成，抑制IL-6活性，減少IL-1、TNF-α等炎性因子的分泌[7]。豆甾醇具有顯著抗炎作用，可顯著降低炎癥因子IL-1、IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白1以及環(huán)氧合酶2的mRNA表達(dá)[8]，還具有抗過敏療效[9]。山柰酚、槲皮素具有很好的抗過敏、抗菌消炎作用[10],此外還有止咳平喘祛痰等功效[11]。

通過對(duì)藥物與疾病164個(gè)共有靶點(diǎn)篩選，得到34個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，其中VEGFA為VEGF基因家族的一員，VEGF是一種多功能細(xì)胞因子，能有效舒張血管，增加血管內(nèi)皮的通透性和促進(jìn)細(xì)胞遷移，在哮喘呼吸道炎癥和重塑中起著十分重要的作用[12]。白介素作為一類細(xì)胞因子，在哮喘發(fā)病中具有重要意義[13]，其中IL-2對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞具有趨化作用；IL-4是IgE合成過程中最重要的調(diào)節(jié)因子；IL-6與其他因子共同作用，促進(jìn)炎癥和免疫反應(yīng)，參與哮喘發(fā)病過程；IL-10能夠抑制細(xì)胞因子合成，對(duì)哮喘治療及其轉(zhuǎn)歸具有重要意義。STAT3是STAT家族的一員，能夠調(diào)控Th17分化的因子，在哮喘發(fā)病中起著關(guān)鍵作用[14]。MMP9作為細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行降解反應(yīng)的限速酶，在呼吸道炎癥反應(yīng)及氣道重塑過程中起著重要作用，在重癥哮喘患者氣道上皮細(xì)胞中具有高水平表達(dá)[15]。MAPK通過多種介質(zhì)參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及免疫防御等過程[16]。以上研究表明定喘湯是多靶點(diǎn)共同作用來發(fā)揮療效的。

通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)，定喘湯治療哮喘的基因功能主要體現(xiàn)在細(xì)胞因子、生長因子、趨化因子、轉(zhuǎn)錄因子的活性及受體結(jié)合等方面。通過KEGG通路富集分析，可知定喘湯通過作用于多種通路達(dá)到治療哮喘的目的。其中IL-17在氣道炎癥及氣道重塑方面具有重要作用，與支氣管哮喘的發(fā)生、進(jìn)展及康復(fù)有顯著聯(lián)系[17]。PI3K信號(hào)通路在哮喘發(fā)病機(jī)制中體現(xiàn)在影響氣道平滑肌細(xì)胞増殖和嗜酸性粒細(xì)胞聚集以及通過調(diào)節(jié)其聚集、活化、凋亡而影響氣道炎癥反應(yīng)方面[18]，PI3K信號(hào)通路的蛋白表達(dá)水平與支氣管哮喘的病理進(jìn)程有著緊密聯(lián)系[19]。此外PI3K/Akt信號(hào)通路在哮喘氣道重塑方面具有重要影響，臨床試驗(yàn)提示阻斷該通路可通過多種機(jī)制抑制小鼠氣道重塑[20]。研究發(fā)現(xiàn)哮喘兒童血液中TNF水平高于正常兒童，TNF參與哮喘發(fā)作期氣道炎癥的形成，可作為哮喘緩解期患兒炎癥持續(xù)的重要指標(biāo)[21]。其中TNF-α可誘發(fā)和加重哮喘，還可引起神經(jīng)源性炎癥及誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子產(chǎn)生，從而引起發(fā)病過程中多種炎性細(xì)胞及炎癥組分的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步引起氣道重建[22]。Toll樣受體作為固有免疫家庭中的模式識(shí)別受體，參與人體抵御病原入侵的第一道屏障，通過分布于細(xì)胞表面識(shí)別某些微生物進(jìn)而激發(fā)哮喘發(fā)作或惡化病情[23]。當(dāng)不同誘因刺激導(dǎo)致哮喘發(fā)作時(shí)，機(jī)體能夠激活不同損傷性和(或)保護(hù)性Toll樣受體相關(guān)通路，通過啟動(dòng)氣道炎癥反應(yīng)、過敏性免疫反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)等與其他通路共同調(diào)節(jié)哮喘的轉(zhuǎn)歸[24]。Harrington等[25]于2005年首次發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞，其具有很強(qiáng)的促炎作用。已知Th17分化受多種細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子的多重調(diào)節(jié)，包括IL-1β、IL-6、IL-21等均參與促進(jìn)T細(xì)胞向Th17分化的過程[26]。此外STAT3能夠在IL-6刺激下活化，進(jìn)一步激活RORγt，從而促進(jìn)Th17分化，IKKα作為NF-κB家族中的成員，也參與調(diào)節(jié)Th17分化[27]。普遍認(rèn)為Th2優(yōu)勢(shì)分化的Th1/Th2 比例失衡是哮喘主要的發(fā)病機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例失衡也是其發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)[28]。MAPK在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在ERK、JNK、p38MAPK等14條信號(hào)通路[29]，MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通過調(diào)控免疫/炎癥細(xì)胞以及氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞誘發(fā)哮喘，引發(fā)氣道高反應(yīng)和氣道重塑，造成Th1/Th2免疫應(yīng)答失衡[30]。JAK-STAT信號(hào)通路普遍存在于脊椎動(dòng)物中，白介素等細(xì)胞因子通過該通路傳導(dǎo)信號(hào)，此外還協(xié)同P13K/AKT/mTOR及MAPK/ERK信號(hào)通路共同參與調(diào)節(jié)多項(xiàng)生物活動(dòng)，該通路紊亂則導(dǎo)致多種免疫相關(guān)疾病的發(fā)生[31]。研究發(fā)現(xiàn)NF-κB信號(hào)通路在氣道中被過度活化而導(dǎo)致哮喘患者發(fā)病，激活后的NF-κB不僅在炎癥反應(yīng)早期即發(fā)生作用，還能引起多種細(xì)胞因子的表達(dá)，加重氣道炎癥反應(yīng)和氣道重塑[32]。

綜上所述，本研究通過分析定喘湯藥理作用機(jī)制，推測(cè)其為多成分、多靶點(diǎn)、多通路共同作用發(fā)揮治療效果，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究的深入化提供了客觀理論依據(jù)，也為定喘湯在今后藥物研發(fā)等方面提供基礎(chǔ)理論支撐。