王振猛，江曉，孫建安*，毛相朝

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院， 山東 青島 266003； 2. 青島濱海學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 山東 青島 266500)

隨著中國(guó)經(jīng)濟(jì)的進(jìn)步，捕撈業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)不斷發(fā)展，蝦類(lèi)產(chǎn)品的市場(chǎng)十分龐大，市場(chǎng)需求量呈逐漸上升趨勢(shì)。中國(guó)蝦類(lèi)產(chǎn)品種類(lèi)主要是蝦仁或者冷凍蝦，而在蝦類(lèi)產(chǎn)品的加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量蝦頭、蝦殼等副產(chǎn)物，幾乎占到原材料質(zhì)量的45%～60%[1]。這些副產(chǎn)物富含蛋白質(zhì)、甲殼素和蝦青素等營(yíng)養(yǎng)成分[2]，并富含不飽和脂肪酸、類(lèi)胡蘿卜素以及人體必需微量元素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[3]。

目前，這些副產(chǎn)物大多被直接丟棄，不僅浪費(fèi)了寶貴的資源，還易造成環(huán)境污染。由于蝦頭營(yíng)養(yǎng)價(jià)值十分豐富，目前許多國(guó)家正在著手開(kāi)發(fā)這一優(yōu)良的資源，如將蝦副產(chǎn)物通過(guò)酶解發(fā)酵等方法制成蝦調(diào)味品[4]，或從蝦頭中提取甲殼素、蝦青素等具有生物活性的物質(zhì)，也可將之用于生產(chǎn)水產(chǎn)飼料和生物肥料等[5]。因此，將這些蝦副產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為有用的產(chǎn)品對(duì)于對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要。目前對(duì)蝦頭的加工利用多采用化學(xué)酸堿法，但環(huán)境危害大，不符合綠色生產(chǎn)要求[6]。另一種加工方式是采用市售蛋白酶酶解蝦頭，但是酶對(duì)蛋白的降解有選擇性，不同市售酶對(duì)不同蝦頭的水解程度不同，并且價(jià)格昂貴，不利于大規(guī)模加工利用[7]。

米曲霉(Aspergillusoryzae)是目前微生物發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶最重要的菌株，其基因組中有135個(gè)胞外蛋白酶基因[8]。米曲霉的胞外蛋白酶系非常復(fù)雜[9]，主要通過(guò)頂端分泌的方式分泌至胞外[10-11]。米曲霉發(fā)酵過(guò)程中不產(chǎn)生毒素，是分解各類(lèi)蛋白用于飼料加工、生物肥料生產(chǎn)及食品加工等領(lǐng)域的最佳選擇。米曲霉產(chǎn)生的蛋白酶包括酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶，由于在發(fā)酵期間不同蛋白酶之間交替發(fā)生作用，能夠賦予產(chǎn)品獨(dú)特的風(fēng)味，因此，米曲霉目前在食品行業(yè)主要用于發(fā)酵分解大豆蛋白釀造醬油[12]，賦予醬油獨(dú)特風(fēng)味[13]。Su等[14]研究發(fā)現(xiàn)，米曲霉蛋白酶粗提物水解脫脂大豆的能力優(yōu)于堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和木瓜蛋白酶等商業(yè)蛋白酶。米曲霉產(chǎn)酶活力的高低影響到原料利用率及產(chǎn)品品質(zhì)，提高米曲霉產(chǎn)蛋白酶活力不僅可以提高原料利用率，而且可減少釀造工業(yè)的污染，對(duì)于實(shí)際生產(chǎn)具有十分重要的作用[15]。

為實(shí)現(xiàn)阿根廷紅蝦(Pleoticusmuelleri)蝦頭的綠色高值化利用，本研究利用米曲霉固態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)的蛋白酶酶解蝦頭，脫掉蛋白質(zhì)，以制備蛋白液與甲殼素。此工藝避免了環(huán)境污染，降低了生產(chǎn)成本，且米曲霉安全性高，酶解液可用于生物飼料的開(kāi)發(fā)利用，從而實(shí)現(xiàn)蝦頭的全面綜合利用。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

馬鈴薯、麩皮和豆粕，購(gòu)于青島市市南區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。阿根廷紅蝦蝦頭購(gòu)于青島市盛隆偉業(yè)科技有限公司，儲(chǔ)存在-20 ℃條件下。米曲霉由青島燈塔釀造有限公司提供，保藏在-80 ℃條件下20%甘油中，該菌在PDA培養(yǎng)基上于30 ℃下活化2 d，用無(wú)菌水將孢子刮下，得到孢子懸浮液。

PDA培養(yǎng)基：稱(chēng)取去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加1 000 mL蒸餾水煮沸30 min，用雙層紗布濾成清液。加入20 g葡萄糖至完全溶解，然后加蒸餾水至1 L， 自然pH(約7.5)，121 ℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20 g。

1.2 儀器與設(shè)備

主要包括：勻漿機(jī)(九陽(yáng)股份有限公司，JYL-C022E)；BCM-1000型超凈臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；SPX生化培養(yǎng)箱(新江南儀器有限公司)；水浴鍋(常州智博瑞儀儀器公司，HH-3A)；pH計(jì)(上海精科儀器有限公司，PHS-2F)；恒溫水浴搖床(常州萬(wàn)順儀器公司，SHZ-88)。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

蛋白酶活力的測(cè)定采用福林酚法，具體步驟參照GB/T 23527—2009。將一個(gè)酶活力單位(U)定義為：在特定的條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需要的酶量。氨基態(tài)氮的測(cè)定采用甲醛滴定法[16]?？扇苄缘鞍椎臏y(cè)定采用雙縮脲法[17]：取3.0 mL樣品溶液置于一試管中，先加入雙縮脲A試劑1.0 mL，再加入雙縮脲B試劑1.0 mL，于漩渦混合儀上混合均勻，靜置10 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液于540 nm下測(cè)定OD值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品溶液中的可溶性蛋白濃度(mg/mL)。

1.4 米曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶工藝條件的優(yōu)化

麩皮和豆粕為常見(jiàn)的米曲霉培養(yǎng)基構(gòu)成成分，能夠滿(mǎn)足米曲霉生長(zhǎng)繁殖所需的碳源和氮源。麩皮和豆粕的不同配比對(duì)米曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶有較大的影響。將不同配比的含水量均為60%的培養(yǎng)基(1號(hào)：麩皮10 g；2號(hào)：麩皮8 g+豆粕2 g；3號(hào)：麩皮6 g+豆粕4 g；4號(hào)：麩皮5 g+豆粕5 g；5號(hào)：麩皮4 g+豆粕6 g；6號(hào)：麩皮2 g+豆粕8 g；7號(hào)：豆粕10 g)滅菌后攪拌均勻，以10%的接種量接入米曲霉孢子懸浮液(孢子含量107個(gè)/mL)。30 ℃靜置培養(yǎng)3 d，之后向培養(yǎng)基中加入100 mL水，30 ℃、200 r/min條件下振蕩3 h，浸提蛋白酶，取上清液離心測(cè)定蛋白酶酶活?？疾炫囵B(yǎng)基組成對(duì)米曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶活力的影響。

在最佳培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)基含水量分別調(diào)整為20%、30%、40%、50%、60%和70%，其他條件不變，考察培養(yǎng)基含水量對(duì)米曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的影響。在最佳培養(yǎng)基和最佳含水量的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)溫度分別調(diào)整為25、30、35、40和45 ℃，考察培養(yǎng)溫度對(duì)米曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的影響。在已優(yōu)化的工藝條件基礎(chǔ)上，分別以1%、2%、4%、6%、8%和10%的接種量接入米曲霉孢子懸浮液，考察接種量對(duì)米曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的影響。在上述最佳條件基礎(chǔ)上，培養(yǎng)時(shí)間調(diào)整為24、36、48、60、72、84和96 h，浸提蛋白酶，取上清液離心測(cè)定蛋白酶活，考察培養(yǎng)時(shí)間對(duì)米曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的影響。在上述最佳條件下培養(yǎng)之后，浸提時(shí)間分別為1、2、3、4、5和6 h，考察浸提時(shí)間對(duì)米曲霉固態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)蛋白酶浸出效果的影響。

1.5 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)溫度、含水量和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)米曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶具有顯著影響，因此采用 Design-Expert 8.0.6.1 軟件，按照 Box-Benken設(shè)計(jì)原理，選取培養(yǎng)溫度、含水量和培養(yǎng)時(shí)間三因素，以蛋白酶活力作為響應(yīng)函數(shù)，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，通過(guò)響應(yīng)曲面分析得出自變量與響應(yīng)函數(shù)之間的統(tǒng)計(jì)模型，確定米曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的最佳工藝條件，實(shí)驗(yàn)因素水平編碼如表1所示。

表1 因素水平表Tab.1 Factors and levels in Box-Behnken

1.6 米曲霉所產(chǎn)蛋白酶酶解蝦頭工藝條件的優(yōu)化

最佳酶解溫度的確定：稱(chēng)取10 g勻漿后的蝦頭，按料液比1∶4加入米曲霉固態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)的蛋白酶液混勻，自然pH下，酶解溫度分別設(shè)置為30、35、40、45和50 ℃，酶解5 h，測(cè)定酶解液中氨基態(tài)氮和可溶性蛋白的含量。

最佳酶解pH的確定：在最佳溫度的基礎(chǔ)上，使用HCl和NaOH調(diào)節(jié)體系pH為6.0、6.5、7.0、7.5(自然pH)和8.0，酶解5 h，測(cè)定酶解液中氨基態(tài)氮和可溶性蛋白的含量。

最佳酶解時(shí)間的確定：在最佳pH、最佳溫度下分別酶解2、3、4、5、6和7 h，測(cè)定酶解液中氨基態(tài)氮和可溶性蛋白的含量。

1.7 蝦頭酶解液的風(fēng)味成分分析

1.7.1 揮發(fā)性成分分析

目前，固相微萃取技術(shù)是應(yīng)用最為廣泛的萃取揮發(fā)性物質(zhì)的方法，其主要是利用萃取頭上的萃取纖維對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行吸附。實(shí)驗(yàn)選用50/30 μm Car/PDMS/DVB萃取纖維頭對(duì)樣品進(jìn)行吸附提取，具體操作如下：準(zhǔn)確移取10 mL樣品裝入20 mL頂空萃取瓶中，放入轉(zhuǎn)子，同時(shí)加入1.5 g NaCl，蓋上瓶蓋，輕輕混勻，設(shè)置磁力攪拌轉(zhuǎn)數(shù)150 r/min，60 ℃水浴鍋中保持10 min，將固相微萃取纖維插入瓶中，調(diào)節(jié)萃取纖維與液面距離，頂空吸附30 min。吸附結(jié)束后，將萃取纖維迅速轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣口，進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析，將檢測(cè)到的揮發(fā)性物質(zhì)與NIST02.LIB數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，當(dāng)且僅當(dāng)匹配度大于80%時(shí)才予以采納。

1.7.2 電子鼻分析

電子鼻(E-nose)俗稱(chēng)機(jī)器嗅覺(jué)，通過(guò)模擬動(dòng)物和人的嗅覺(jué)功能，實(shí)現(xiàn)對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)的檢測(cè)與鑒定。將25 mL樣品溶液裝入50 mL樣品瓶中，密封放置于25 ℃水浴鍋中保持30 min。電子鼻儀器使用前要先自清洗，當(dāng)響應(yīng)信號(hào)恢復(fù)到基線時(shí)，方可進(jìn)行樣品測(cè)定。將樣品收集針頭插入樣品瓶中，開(kāi)始收集數(shù)據(jù)，電腦記錄每秒鐘相對(duì)電導(dǎo)率比值變化，最后生成相對(duì)電導(dǎo)率比值曲線。設(shè)定測(cè)試參數(shù)：自清洗時(shí)間200 s，基線收集10 s，樣品收集時(shí)間100 s，載氣流速300 mL/min。當(dāng)電導(dǎo)率比值信號(hào)穩(wěn)定時(shí)，采用Winmuster軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行采集與處理。電子鼻傳感器性能描述見(jiàn)表2。

表2 電子鼻傳感器性能描述Tab.2 Sensor performance description in E-nose

1.7.3 電子舌分析

電子舌(E-tongue)俗稱(chēng)機(jī)器味覺(jué)，本實(shí)驗(yàn)選取TS-5000Z味覺(jué)分析系統(tǒng)對(duì)酶解液進(jìn)行分析，該系統(tǒng)不僅可以分析樣品的鮮、咸、酸、苦、澀和甜味，還可以客觀地分析苦、澀和鮮的回味，具有很高的靈敏度。具體操作如下：清洗液中清洗90 s，參比液清洗120 s，接著用第二參比液，繼續(xù)清洗，時(shí)間仍為120 s，傳感器歸零30 s，平衡后，取80 mL樣品開(kāi)始進(jìn)行測(cè)定。首先進(jìn)行前味測(cè)定，即將傳感器放入樣品中，測(cè)試時(shí)間為30 s；清洗傳感器3 s，接著進(jìn)行回味測(cè)定，即將傳感器再次放入?yún)⒈纫褐羞M(jìn)行測(cè)試，時(shí)間仍為30 s。測(cè)試結(jié)束后，及時(shí)用潔凈溶液清洗傳感器。當(dāng)電導(dǎo)率比值信號(hào)穩(wěn)定時(shí)，采用TS-5000Z軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行采集與處理。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，采用Design-Expert 8.0.6.1進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析處理，組間差異顯著性分析采用ANOVA方差分析，P<0.05為有顯著差異。

2結(jié)果與分析

2.1米曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的單因素優(yōu)化試驗(yàn)

2.1.1 不同固態(tài)培養(yǎng)基對(duì)米曲霉產(chǎn)蛋白酶的影響

由圖1可知，隨著固態(tài)培養(yǎng)基中豆粕含量的不斷增加，米曲霉所產(chǎn)蛋白酶的酶活逐漸下降。麩皮和豆粕均是米曲霉生長(zhǎng)過(guò)程中所需的碳源、氮源，麩皮質(zhì)地疏松、透氣性良好，而豆粕質(zhì)地緊密，會(huì)影響培養(yǎng)基的透氣性，不利于微生物的生長(zhǎng)繁殖。當(dāng)培養(yǎng)基中只含有麩皮時(shí)，不僅能夠滿(mǎn)足該米曲霉生長(zhǎng)繁殖分泌蛋白酶的基本營(yíng)養(yǎng)需求，且能保證培養(yǎng)基良好的透氣性，因此確定米曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的最佳培養(yǎng)基為麩皮。

2.1.2 培養(yǎng)基含水量對(duì)米曲霉產(chǎn)蛋白酶的影響

水分是微生物發(fā)酵過(guò)程中生長(zhǎng)及代謝的必要成分，適宜的初始含水量，一方面使發(fā)酵基質(zhì)具有一定的水分活度，而水分活度決定了微生物的萌發(fā)時(shí)間、生長(zhǎng)速率及死亡率，另一方面使得發(fā)酵基質(zhì)的疏松度適宜，顆粒間存在一定間隙，對(duì)菌體獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及氧的傳遞起到重要作用。含水量過(guò)低不利于米曲霉的生長(zhǎng)繁殖及蛋白酶的分泌，含水量過(guò)高又會(huì)導(dǎo)致整個(gè)固態(tài)培養(yǎng)體系透氣性差，供氧不足。由圖2可知，隨著培養(yǎng)基含水量的增加，米曲霉所產(chǎn)蛋白酶酶活呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，在含水量為60%時(shí)，蛋白酶活力達(dá)到最大值。因此確定米曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基最佳含水量為60%。

2.1.3 培養(yǎng)溫度對(duì)米曲霉產(chǎn)蛋白酶的影響

溫度作為影響固態(tài)發(fā)酵的關(guān)鍵因素，首先會(huì)影響米曲霉的生長(zhǎng)和繁殖，其次由于固態(tài)培養(yǎng)過(guò)程中，基質(zhì)的傳熱性差，初始溫度過(guò)高，不利于發(fā)酵熱的散出，進(jìn)而使發(fā)酵反應(yīng)無(wú)法進(jìn)行，會(huì)嚴(yán)重影響蛋白酶的分泌，因此溫度對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響比較大。米曲霉在40 ℃和45 ℃時(shí)，幾乎沒(méi)有生長(zhǎng)跡象，37 ℃米曲霉能夠生長(zhǎng)，但白色菌絲體較多，綠色孢子生長(zhǎng)較少。由圖3可知，培養(yǎng)溫度在30 ℃時(shí)，米曲霉所產(chǎn)蛋白酶活力最高，因此確定米曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基最佳培養(yǎng)溫度為30 ℃。

2.1.4 接種量對(duì)米曲霉產(chǎn)蛋白酶的影響

由圖4可知，隨著米曲霉接種量由1%增加至2%，米曲霉所產(chǎn)蛋白酶活力有顯著上升(P<0.05)，之后隨接種量的進(jìn)一步增加，所產(chǎn)蛋白酶活力無(wú)明顯差異(P>0.05)。推測(cè)原因，10 g麩皮的固態(tài)培養(yǎng)基僅僅能夠滿(mǎn)足2%的接種量時(shí)米曲霉生長(zhǎng)繁殖所需的營(yíng)養(yǎng)成分，當(dāng)米曲霉孢子總數(shù)達(dá)到一定量時(shí)，10 g麩皮已經(jīng)不能滿(mǎn)足更多米曲霉生長(zhǎng)繁殖所需的營(yíng)養(yǎng)成分，因此隨著接種量的增大，米曲霉所產(chǎn)蛋白酶活力不會(huì)繼續(xù)增高。最終確定最佳接種量為2%。

2.1.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)米曲霉產(chǎn)蛋白酶的影響

由圖5可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，米曲霉所產(chǎn)蛋白酶活力不斷升高，在36～48 h呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)；48 ～84 h呈現(xiàn)緩慢增長(zhǎng)的趨勢(shì)；84 h時(shí)，米曲霉所產(chǎn)蛋白酶活力最高；超過(guò)84 h，米曲霉所產(chǎn)蛋白酶活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。觀察米曲霉的生長(zhǎng)狀況，在24 h，開(kāi)始生長(zhǎng)出白色菌絲體，在36 h，開(kāi)始生長(zhǎng)出綠色孢子，因此初步確定，在36 h后，開(kāi)始大量分泌蛋白酶，84 h蛋白酶分泌量達(dá)到最多。

2.1.6 浸提時(shí)間對(duì)米曲霉所產(chǎn)蛋白酶浸出效果的影響

加水振蕩是為了使米曲霉所產(chǎn)的蛋白酶更好的溶出，合適的浸提時(shí)間可使蛋白酶更好地完全溶出，并能節(jié)約時(shí)間成本。由圖6可知，隨著振蕩時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白酶逐漸溶出，在1 ～3 h內(nèi)蛋白酶快速溶出，在3～4 h仍有少量蛋白酶繼續(xù)溶出，4 h后蛋白酶活力無(wú)明顯差異(P>0.05)，說(shuō)明蛋白酶基本全部溶出，且3 h左右蛋白酶溶出效果浮動(dòng)較大，為保證蛋白酶能夠完全溶出，為后續(xù)試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)，保證后續(xù)酶解試驗(yàn)效果，因此確定4 h為合適的浸提時(shí)間。

2.2 響應(yīng)面結(jié)果與分析

在培養(yǎng)基組成為麩皮、接種量為2%、浸提時(shí)間為4 h的基礎(chǔ)上，根據(jù)模型的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，挑選出培養(yǎng)溫度、含水量和培養(yǎng)時(shí)間3個(gè)對(duì)米曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶效果影響較大的因素，以蛋白酶活力為指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)結(jié)果如表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 Design and result of response surface in Box-Behnken

對(duì)表2進(jìn)行多元化的回歸方程分析，得到二次響應(yīng)面回歸方程為：Y=10 762.30-2 352.46A+391.39B-137.30C-114.75AB+16.39AC+28.69BC-3 002.05A2-3 243.85B2-1 276.64C2。

該模型的方差分析見(jiàn)表4。由表4可知，該模型的F值為196.4，P<0.000 1，表示該二次回歸模型是極顯著的；擬合不足P值為0.053 2，說(shuō)明該模型失擬顯著；相關(guān)系數(shù)R2=0.996 1，說(shuō)明二次回歸模型預(yù)測(cè)性良好，能夠較好地反映響應(yīng)值的變化。該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合程度較好，預(yù)測(cè)值和實(shí)際值之間具有較高的相關(guān)性，可用于米曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的理論指導(dǎo)依據(jù)。信噪比Adeq Precision=40.587>4，表示模型可行。培養(yǎng)溫度、含水量、培養(yǎng)溫度的二次項(xiàng)、含水量的二次項(xiàng)及培養(yǎng)時(shí)間的二次項(xiàng)對(duì)米曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的影響達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。

表4 回歸系數(shù)模型及方差分析表Tab.4 Coefficient of regression model and variance analysis

各因素對(duì)米曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的2D等高線圖和3D響應(yīng)面圖如圖7所示。三維曲面圖是各因素相互作用的直觀反映，因素影響越大，則曲面圖的曲線越陡峭。從圖7中可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)溫度或培養(yǎng)時(shí)間一定時(shí)，隨著含水量的增加，蛋白酶活呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)(圖7b和圖7f)；當(dāng)含水量或培養(yǎng)時(shí)間一定時(shí)，隨著培養(yǎng)溫度的增加，蛋白酶活呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，下降坡度較大(圖7b和圖7d)；當(dāng)培養(yǎng)溫度或含水量一定時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，蛋白酶活變化趨勢(shì)不大(圖7d和圖7f)。這與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致，也進(jìn)一步說(shuō)明了培養(yǎng)時(shí)間的影響不顯著，3個(gè)因素的兩兩交互作用不顯著，與表4結(jié)果一致。

通過(guò)Design-Expert 8.0.6.1 軟件分析，得到米曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的的最佳工藝參數(shù)：培養(yǎng)溫度為28.05 ℃，含水量為60.7%，培養(yǎng)時(shí)間為83.28 h，此條件下，蛋白酶活力理論預(yù)測(cè)值為11 241.8 U/100 mL。驗(yàn)證試驗(yàn)過(guò)程中采取培養(yǎng)溫度為28 ℃，含水量為60.7%，培養(yǎng)時(shí)間為83.3 h，測(cè)得蛋白酶酶活實(shí)際值為11 139.35 U/100 mL。劉志偉等[18]研究發(fā)現(xiàn)，米曲霉在固態(tài)培養(yǎng)基為麩皮、含水量為50%、30 ℃培養(yǎng)72 h所產(chǎn)蛋白酶酶活最高。袁艷玲等[19]研究發(fā)現(xiàn)，米曲霉在固態(tài)培養(yǎng)基麩皮和豆粕的質(zhì)量比為4∶1、含水量為55%、30 ℃培養(yǎng)84 h條件下所產(chǎn)蛋白酶酶活最高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與劉志偉等的研究結(jié)果非常相似，均采用了麩皮做培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間基本一致，但本研究中的培養(yǎng)基含水量相對(duì)較高，推測(cè)原因可能為不同菌種之間存在一定的差異導(dǎo)致。總體來(lái)看，本研究結(jié)果具有非常高的普遍性，可為米曲霉的研究提供一定的理論支持。

2.3 米曲霉所產(chǎn)蛋白酶酶解蝦頭的單因素優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 酶解溫度對(duì)蝦頭酶解效果的影響

溫度對(duì)米曲霉所產(chǎn)蛋白酶酶解蝦頭效果的影響如圖8所示。在30～40 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的上升，可溶性蛋白和氨基態(tài)氮的含量均在不斷升高，酶解溫度為40 ℃時(shí)，可溶性蛋白和氨基態(tài)氮的含量達(dá)到最高，分別為7.79 mg/mL和1.82 mg/mL。在40～50 ℃范圍內(nèi)，可溶性蛋白含量呈明顯下降趨勢(shì)(P<0.05)，推測(cè)40 ℃可能更有利于蛋白酶發(fā)揮作用，溫度過(guò)低或過(guò)高，導(dǎo)致蛋白酶活性降低。因此確定40 ℃為米曲霉固態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)蛋白酶酶解阿根廷紅蝦蝦頭的最佳溫度條件。

2.3.2 酶解pH對(duì)蝦頭酶解效果的影響

pH對(duì)米曲霉所產(chǎn)蛋白酶酶解蝦頭效果的影響如圖9所示。從結(jié)果可知，氨基態(tài)氮隨著pH的增加而降低，這是因?yàn)榘被鶓B(tài)氮的測(cè)定是采用的甲醛滴定法，且總體來(lái)看，不同pH條件下，氨基態(tài)氮含量雖然有所降低，但是差異很小，因此主要從可溶性蛋白的含量進(jìn)行判斷。在pH為7.5即自然pH時(shí)，可溶性蛋白達(dá)到最高值7.93 mg/mL，且具有明顯優(yōu)勢(shì)，因此確定自然pH(7.5)為米曲霉固態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)蛋白酶酶解阿根廷紅蝦蝦頭的最佳pH。

2.3.3 酶解時(shí)間對(duì)蝦頭酶解效果的影響

酶解時(shí)間對(duì)米曲霉所產(chǎn)蛋白酶酶解蝦頭效果的影響如圖10所示。氨基態(tài)氮在3 h時(shí)，達(dá)到最大值1.91 mg/mL，之后有微弱下降趨勢(shì)，可溶性蛋白在5 h時(shí)達(dá)到最大值7.31 mg/mL，之后有微弱下降趨勢(shì)。二者總和在5 h時(shí)達(dá)到最大值9.15 mg/mL，效果較好。因此確定5 h為米曲霉固態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)蛋白酶酶解阿根廷紅蝦蝦頭的最佳時(shí)間。

2.4 蝦頭酶解液的風(fēng)味成分分析

2.4.1 揮發(fā)性成分分析

從表5中可以看出，酶解前檢測(cè)出醛類(lèi)、酮類(lèi)、醇類(lèi)及胺類(lèi)化合物共13種，其中醛類(lèi)物質(zhì)含量最高，占總的揮發(fā)性成分的61.56%，醇類(lèi)物質(zhì)次之，占總成分的28.40%，此外還檢測(cè)出三甲胺和少量的酮類(lèi)。酶解后檢測(cè)出醛類(lèi)、酮類(lèi)、醇類(lèi)、酯類(lèi)、芳香族化合物、酚類(lèi)、胺類(lèi)化合物及雜環(huán)化合物共28種。其中，醇類(lèi)物質(zhì)含量最高，占總的揮發(fā)性成分的51.25%，醛類(lèi)和酮類(lèi)次之，分別為28.16%和7.54%，此外，還檢測(cè)出少量的三甲胺、酯類(lèi)、酚類(lèi)、芳香族化合物以及雜環(huán)化合物。孟凌玉等[20]以南美白對(duì)蝦(Penaeusvannamei)風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物為原料制備蝦風(fēng)味基料，對(duì)酶解后產(chǎn)品進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，醛、酮和醇三類(lèi)物質(zhì)為主要成分，相對(duì)含量分別為20.45%、26.06%和8.16%，與本研究結(jié)果相似。

表5 蝦頭酶解前后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量比較Tab.5 Comparison of relative contents of volatile compounds before and after enzymatic hydrolysis of shrimp heads

醛類(lèi)物質(zhì)一般為脂質(zhì)降解的產(chǎn)物，且呈現(xiàn)出閾值較低的特點(diǎn)[21]，尤其是苯甲醛，作為蝦頭的重要風(fēng)味成分[22]，能給予清香、果香和堅(jiān)果香的芳香特質(zhì)[23]。豐富的酮類(lèi)化合物貢獻(xiàn)于蝦的甜香和果香風(fēng)味，通常由多不飽和脂肪酸的氧化或降解、氨基酸降解或微生物氧化產(chǎn)生[24]。醛酮類(lèi)通常具有濃郁的香味，醛類(lèi)物質(zhì)經(jīng)過(guò)脫氫酶的作用又可還原成相應(yīng)的醇類(lèi)物質(zhì)，因此酶解后醛類(lèi)物質(zhì)相對(duì)含量有所下降，而醇類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)和相對(duì)含量均有所增多。醇類(lèi)通常會(huì)產(chǎn)生比較清淡、柔和的氣味[25]，是蝦頭酶解產(chǎn)物中的主要成分。含量較高的醇類(lèi)化合物，特別是具有蘑菇風(fēng)味的1-辛烯-3-醇等，具有低閾值和高風(fēng)味活性的特點(diǎn)，同時(shí)帶有類(lèi)似于薰衣草、玫瑰和干草的香氣，一般存在于海產(chǎn)品的揮發(fā)性氣味物質(zhì)中，已有報(bào)道稱(chēng)1-辛烯-3-醇是大多數(shù)魚(yú)蝦類(lèi)動(dòng)物中共同具有的甜香和類(lèi)植物香的氣味成分，可能由脂肪的氧化分解或由羰基化合物還原生成，對(duì)蝦頭風(fēng)味也有較大的貢獻(xiàn)[26]。酯類(lèi)物質(zhì)常帶有水果香，使風(fēng)味更加濃郁[27]。含氮類(lèi)物質(zhì)的閾值較低，是水產(chǎn)品氣味的重要組成部分，三甲胺作為一種非常強(qiáng)的揮發(fā)性物質(zhì)廣泛存在魚(yú)、蝦及蟹體內(nèi)，產(chǎn)生魚(yú)腥味[28]。2-戊基呋喃是亞油酸的氧化產(chǎn)物，呈現(xiàn)出蘑菇味[29]。

分析酶解前后揮發(fā)性成分的變化，可以發(fā)現(xiàn)，阿根廷紅蝦蝦頭經(jīng)過(guò)米曲霉蛋白酶液酶解后，相比酶解前多檢測(cè)出酯類(lèi)、酚類(lèi)、芳香族化合物和雜環(huán)類(lèi)化合物，揮發(fā)性成分種類(lèi)變多，風(fēng)味程度變得更加多樣復(fù)雜；苯甲醛在酶解前后的高含量說(shuō)明酶解保留了蝦頭中優(yōu)良的蝦風(fēng)味；具有明顯魚(yú)腥味的三甲胺相對(duì)含量降低，酶解液魚(yú)腥味減輕；醛類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)未發(fā)生變化，相對(duì)含量有所降低。而酮類(lèi)和醇類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)更加多樣，相對(duì)含量有所升高，這也說(shuō)明酶解液的風(fēng)味成分更優(yōu)。在發(fā)酵過(guò)程中，米曲霉分泌了豐富的蛋白酶和脂肪酶，作用于蝦頭后，其中的蛋白質(zhì)和脂肪酸經(jīng)氧化降解產(chǎn)生更多的酮類(lèi)和醇類(lèi)等物質(zhì)；另外在蝦頭的酶解過(guò)程中，本身所富含的醛類(lèi)物質(zhì)經(jīng)過(guò)蛋白酶液的作用，被還原成大量的醇類(lèi)物質(zhì)，因此醛類(lèi)物質(zhì)的相對(duì)含量有所降低，而醇類(lèi)物質(zhì)相對(duì)含量顯著增加，這是酶解前后揮發(fā)性成分變化的原因。

2.4.2 電子鼻分析

總體來(lái)看，酶解前和酶解后響應(yīng)值有較明顯差異，酶解后的總響應(yīng)值略低于酶解前(圖11)，這說(shuō)明酶解液中的揮發(fā)性物質(zhì)含量略低。結(jié)合傳感器代表的取值(表2)分析可知，芳香物質(zhì)、醇類(lèi)物質(zhì)(傳感器1、8)的含量經(jīng)過(guò)酶解后稍微得到提高，氨類(lèi)物質(zhì)、硫化物及有機(jī)硫化物(傳感器3、7、9)等與蝦類(lèi)等水產(chǎn)品腥味有關(guān)的物質(zhì)有明顯降低。這與揮發(fā)性成分的測(cè)定結(jié)果相一致，說(shuō)明蝦頭經(jīng)過(guò)米曲霉蛋白酶液酶解后的風(fēng)味得到進(jìn)一步的改善。

2.4.3 電子舌分析

通過(guò)對(duì)電子舌味覺(jué)雷達(dá)圖的分析，可以發(fā)現(xiàn)酶解前和酶解后味覺(jué)差異不大，但是酶解液的鮮味有明顯的提升，鮮味回味也有一定程度的增加，且酸味有微弱降低(圖12)。這說(shuō)明蝦頭經(jīng)過(guò)米曲霉蛋白酶酶液酶解后的總體味覺(jué)有明顯改進(jìn)，該結(jié)果再一次證明經(jīng)過(guò)米曲霉所產(chǎn)蛋白酶酶解后的蝦頭的酶解液具有作為調(diào)味基料的潛能。

3 結(jié)論

本研究以阿根廷紅蝦蝦頭為原料，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定了米曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的優(yōu)化參數(shù)：培養(yǎng)基為麩皮、培養(yǎng)基含水量為60.7%、培養(yǎng)溫度為28 ℃、培養(yǎng)時(shí)間為83.3 h、接種量為2%及浸提時(shí)間為4 h。在此條件下，米曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶酶活為11 139.35 U/100 mL。應(yīng)用所產(chǎn)蛋白酶酶解阿根廷紅蝦蝦頭，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了酶解條件：酶解溫度為40 ℃、酶解pH為7.5(自然pH)、酶解時(shí)間為5 h。此條件下，酶解液中可溶性蛋白和氨基態(tài)氮含量最高，表明蝦頭脫蛋白效果好。對(duì)蝦頭酶解液進(jìn)行風(fēng)味評(píng)價(jià)結(jié)果表明，與酶解前相比，酶解后其風(fēng)味成分更加豐富，鮮味有所提高，腥味減弱，可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為調(diào)味品。本研究采用米曲霉產(chǎn)蛋白酶酶解蝦頭，該工藝條件較溫和，且綠色環(huán)保，產(chǎn)品質(zhì)量較好，可為蝦頭等廢棄物的高值化利用提供理論參考和實(shí)踐指導(dǎo)。