林丹櫻 牛敬敬 劉雄波 張瀟 張嬌 于斌 屈軍樂

(深圳大學(xué)物理與光電工程學(xué)院, 光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點實驗室, 深圳 518060)

1 引 言

隨著熒光標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展, 熒光顯微成像技術(shù)已成為生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域不可或缺的工具之一. 熒光壽命作為熒光的一個重要參量, 反映了熒光分子從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)的退激發(fā)速率, 是熒光分子的固有特性, 其變化能非常靈敏地反映熒光分子所處微環(huán)境(如細(xì)胞微環(huán)境中的溫度、黏度、pH 值、離子濃度等)的變化情況[1]. 同時由于熒光壽命的測量可不受熒光探針濃度、激發(fā)光強(qiáng)度、光漂白等因素的影響, 相比強(qiáng)度測量更有利于實現(xiàn)定量化, 因此探測樣品中熒光壽命的分布和變化的熒光壽命顯微成像技術(shù)(fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM)常常被應(yīng)用于定量測量細(xì)胞內(nèi)的一些生物物理和生物化學(xué)參數(shù)[2,3], 或氣溶膠的黏度測量等[4]. 另一方面, 許多熒光團(tuán)分子具有相似的熒光光譜, 假如利用它們對樣品中不同的結(jié)構(gòu)進(jìn)行特異性標(biāo)記, 直接從光譜上很難分離, 但利用它們熒光壽命不同的特點, 可借助FLIM 技術(shù)對其熒光進(jìn)行區(qū)分, 從而實現(xiàn)多結(jié)構(gòu)的同時標(biāo)記和成像. 這些特點使得FLIM 在生命科學(xué)研究中有著越來越廣泛的應(yīng)用.

一般而言, FLIM 中熒光壽命的測量方法有時域法與頻域法兩類, 其中頻域法使用周期調(diào)制的連續(xù)光激發(fā)樣品, 檢測熒光信號相對激發(fā)光的振幅和相位變化來計算樣品的熒光壽命; 時域法采用高重復(fù)頻率的飛秒脈沖激光激發(fā)樣品, 利用門控技術(shù)、掃描相機(jī)技術(shù)、時間相關(guān)單光子計數(shù)(timecorrelated single photon counting, TCSPC)技術(shù)等記錄脈沖過后熒光信號的衰減過程并擬合或計算熒光壽命. 因此, 不管對于哪種類型的FLIM, 熒光壽命數(shù)據(jù)的處理都是非常關(guān)鍵的一環(huán). 例如, 時域法熒光壽命數(shù)據(jù)最常用的處理方法是非線性最小二乘(nonlinear least-squares, NL-LS)擬合法,即選擇一種衰減模型(單指數(shù)、雙指數(shù)或多指數(shù)衰減)對每個像素點的測量數(shù)據(jù)進(jìn)行曲線擬合, 然后分析出各衰減組分的熒光壽命值. 但是這種方法要求衰減模型的選擇要合適, 同時要求每個像素點要采集足夠多的光子數(shù)(通常 >1000)才能夠進(jìn)行有效擬合[5]. 這就使得基于這種數(shù)據(jù)處理方法的FLIM 技術(shù)在應(yīng)用上受到了相應(yīng)的限制. 例如,TCSPC-FLIM 通常需要在激發(fā)光較弱的情況下進(jìn)行成像, 以避免相鄰兩個脈沖之間檢測到的光子數(shù)多于1 而導(dǎo)致的光子堆積問題, 因此要求每個像素點采集足夠多的光子數(shù)就需要延長采集時間, 由此帶來的問題就是獲得一幅熒光壽命圖像的時間相對較長, 成像速度受限, 無法應(yīng)用于一些熒光壽命變化速度較快的場合.

因此, 針對這些問題, 研究者們開發(fā)出了其他的算法, 例如相量分析(phasor analysis, PA)[6]、極大 似 然 估 計 (maximum likelihood estimate,MLE)[7]、一階矩(the first moment, M1)[8]、貝葉斯 分 析(Bayesian analysis, BA)[9]、壓 縮 感 知(compressed sensing, CS)[10]等, 這些方法可通過降低壽命分析對光子數(shù)的要求從而間接地提高FLIM 技術(shù)的成像速度[11]. 其中, PA 法通過將時域信息變換到頻域, 可直接計算得到熒光壽命值,簡單快速, 無需擬合, 且在低光子數(shù)情況下也能得到比較準(zhǔn)確的壽命值, 適合于快速FLIM 成像. 另一方面, PA 法生成的相量圖能將具有相似熒光衰減特性的熒光團(tuán)分子所對應(yīng)的像素點顯示在相鄰區(qū)域, 形成一定的簇狀分布, 這種特點使得利用該方法可以更方便地對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化和聚類分析,因此結(jié)合PA 法的FLIM 技術(shù)(phasor-FLIM)越來越受到科研人員的青睞, 在生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究中應(yīng)用越來越廣泛.

本文首先詳細(xì)闡述phasor-FLIM 的基本原理及使用方法, 并在此基礎(chǔ)上介紹該技術(shù)應(yīng)用于細(xì)胞代謝狀態(tài)測量、蛋白質(zhì)相互作用研究、細(xì)胞微環(huán)境測量以及輔助病理診斷和提高超分辨成像分辨率等方面的最新研究進(jìn)展, 最后對其發(fā)展前景進(jìn)行展望.

2 Phasor-FLIM 的基本原理

如前所述, FLIM 技術(shù)中熒光壽命的測量通常分為頻域法和時域法[1,6]. 這兩種方法在數(shù)學(xué)意義上互為傅里葉變換, 但它們獲取熒光壽命信息的方式不同, 得到的數(shù)據(jù)內(nèi)容和形式不同, 從而數(shù)據(jù)處理方法一般也不同. 頻域法一般使用正弦調(diào)制的連續(xù)光激發(fā)樣品, 測量得到的是具有相同頻率的熒光信號, 但由于熒光壽命的影響, 熒光信號的振幅和相位相比激發(fā)光均發(fā)生了變化, 因此通過計算熒光信號相對激發(fā)光的振幅調(diào)制度變化和相位延遲可計算得到熒光壽命. 而時域法則需要采用高重復(fù)頻率的飛秒脈沖激光激發(fā)樣品, 利用前面提到的門控技術(shù)、掃描相機(jī)或TCSPC 技術(shù)等直接或間接記錄脈沖過后的熒光衰減過程, 得到的是熒光強(qiáng)度(或光子數(shù))隨時間的變化關(guān)系, 因此一般可通過曲線擬合得到熒光壽命.

PA 法最先被用于處理頻域FLIM 技術(shù)得到的熒光壽命數(shù)據(jù), 其相量由頻域FLIM 測量得到的解調(diào)系數(shù)和相位延遲來構(gòu)建, 是原始數(shù)據(jù)的直接表達(dá)[12]. PA 法同樣適用于時域FLIM 數(shù)據(jù)的分析,但需要先將時域的熒光衰減變換到頻域. 由于時域FLIM 中的TCSPC-FLIM 目前應(yīng)用最為廣泛,因此PA 法在該技術(shù)中的應(yīng)用也是報道得最多的.以下分別介紹這兩類技術(shù)中PA 法分析熒光壽命的基本原理, 并結(jié)合熒光相量圖的特點闡述其典型的應(yīng)用思路.

2.1 頻域法FLIM 及其相量分析

在頻域FLIM 中, 激發(fā)光常采用正弦調(diào)制的連續(xù)光源, 如激光、氙燈、LED 燈等, 激發(fā)光強(qiáng)可描述為

其中E(0)和E(t)分別為起始時刻和t時刻的激發(fā)光強(qiáng)度,ME=a/A為激發(fā)光的強(qiáng)度調(diào)制度(a和A分別是激發(fā)光的振幅和平均強(qiáng)度, 如圖1(a)所示),w為調(diào)制的角頻率. 利用該激發(fā)光激發(fā)標(biāo)記有熒光團(tuán)的樣品后, 所檢測到的熒光也是正弦調(diào)制的, 且其頻率與激發(fā)光相同, 但強(qiáng)度調(diào)制度會降低,相位也有一定延遲. 如果熒光衰減符合單指數(shù)衰減規(guī)律, 則熒光光強(qiáng)可描述為

圖1 熒光壽命的測量方法及相量分析(PA)法示意圖 (a)頻域法測量原理示意圖; (b)單指數(shù)衰減的壽命相量示例圖; (c)雙指數(shù)衰減的壽命相量示例圖; (d)時間相關(guān)單光子計數(shù)(TCSPC)測量原理示意圖Fig. 1. Schematic diagram of fluorescence lifetime measurement and phasor analysis (PA): (a) Frequency domain method; (b) lifetime phasor of single-exponential decay; (c) lifetime phasor of bi-exponential decay; (d) time-correlated single photon counting (TCSPC) method.

相應(yīng)地,I(0)和I(t)分別為起始時刻和t時刻的熒光強(qiáng)度,MF=b/B為熒光的強(qiáng)度調(diào)制度(b和B分別是熒光的振幅和平均強(qiáng)度, 如圖1(a)所示),f為相位延遲或相移. 通過測量相移f和解調(diào)系數(shù)M=MF/ME, 即可計算出相應(yīng)的熒光壽命, 即:

可以證明[12,13], 當(dāng)熒光的衰減過程符合單指數(shù)衰減規(guī)律(即I(t) =I(0)e–t/t,t為壽命)時, (3)式和(4)式算得的壽命tf和tm是相等的, 理論上只需要計算其中一個即可. 但假如熒光的衰減過程是兩個或多個單指數(shù)衰減過程的組合(即雙指數(shù)衰減或多指數(shù)衰減), 則情況更加復(fù)雜, 通常需要先在不同調(diào)制頻率wi下重復(fù)測量多組fi和Mi, 并通過以下公式先計算出等效相移和解調(diào)系數(shù)再求解壽命, 即:

其中fi為第i個調(diào)制頻率測得的光強(qiáng)占總光強(qiáng)的比例.

1984 年, Jameson 等[13]利用相量的概念對頻域法FLIM 得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行幾何表示, 他們利用單個像素點對應(yīng)的解調(diào)系數(shù)M和相移f來構(gòu)建一個相量, 即以M作為該相量的模, 以f作為該相量的輻角, 則可以認(rèn)為相量與像素點是一一對應(yīng)的, 相量圖上一個相量的端點就代表了一個像素點的全部熒光壽命信息(如圖1(b)所示). 該相量在實軸和虛軸的分量可用Weber 符號表示[14], 即:

對于單指數(shù)衰減情形, 由(3)式和(4)式可得到cosf=M, 因此可以得到:

即以坐標(biāo)(G,S)表示的相量端點被約束在圓心位于(0.5, 0)處、半徑為0.5 的半圓上. 半圓上的每個點表示不同的壽命, 壽命值從左到右遞減, 其中(1, 0)表示接近零的壽命, (0, 0)表示無限長的壽命, 如圖1(b)所示.

幾何意義上, 多指數(shù)衰減過程對應(yīng)的相量端點應(yīng)位于其各個單指數(shù)衰減組分對應(yīng)的壽命相量端點連接組成的集合內(nèi). 如圖1(c)中, 雙指數(shù)衰減過程對應(yīng)的壽命相量端點(藍(lán)色)落在半圓以內(nèi), 位于兩個單指數(shù)衰減組分對應(yīng)的壽命相量端點(綠色)的連線上, 且與兩端點的距離(p1,p2)由兩個組分的占比(a1,a2)決定.

2.2 時域法FLIM 及其相量分析

PA 法同樣適用于時域法FLIM 數(shù)據(jù)的分析.這里以目前應(yīng)用最廣泛的TCSPC-FLIM 技術(shù)為例. 如圖1(d)所示, TCSPC 將每一次脈沖信號作為一個信號周期, 每個周期內(nèi)當(dāng)探測到第一個熒光光子時就在其到達(dá)時間對應(yīng)的時間通道中進(jìn)行計數(shù), 經(jīng)過多次累積即可建立一個反映熒光衰減過程的光子數(shù)-時間分布直方圖, 用于求解熒光壽命.

2008 年, Digman 等[16]將Weber[14]于1981年提出的熒光脈沖響應(yīng)的傅里葉分析方法用于TCSPC 技術(shù), 并使用以下關(guān)系式計算相量端點坐標(biāo), 也可以將每個像素的全部熒光衰減信息轉(zhuǎn)換為相量圖上的單個點, 即:

其中G(w)和S(w)分別是熒光脈沖響應(yīng)傅里葉頻譜的實部和虛部, 這里用作壽命相量的兩個分量;I(t)是脈沖過后t時刻的熒光光強(qiáng),w是脈沖激光的角頻率,T是周期長度(實際可取動態(tài)范圍),n是諧波的階次, 一般情況下取基頻分量, 即n=1. 因為TCSPC 是在N個離散的時間通道tk中記錄熒光衰減分布直方圖的, 因此上述積分運(yùn)算可轉(zhuǎn)化為求和計算:

其中Ck是第k個時間通道記錄的光子數(shù),是所有時間通道記錄的總光子數(shù).

如果熒光脈沖響應(yīng)呈單指數(shù)衰減規(guī)律, 則代入(11)式可得G(w)和S(w)與熒光壽命t的關(guān)系為:

可以驗證,G,S仍然滿足(8)式的關(guān)系, 即單指數(shù)衰減情形下以坐標(biāo)(G,S)表示的相量端點仍被約束在圓心位于(0.5, 0)處、半徑為0.5 的半圓上, 與頻域法得到的相量圖一致.

而如果熒光脈沖響應(yīng)是呈多指數(shù)衰減的, 則同樣根據(jù)線性疊加關(guān)系可知, 坐標(biāo)(G,S)表示的相量端點也位于半圓以內(nèi), 其中雙指數(shù)衰減過程對應(yīng)的相量端點也在其兩個單指數(shù)衰減組分對應(yīng)的相量端點連線上, 與頻域法得到的結(jié)論一致.

2.3 相量圖的特點及其典型應(yīng)用思路

如前所述, 對于滿足單指數(shù)衰減規(guī)律的情形,熒光壽命相量圖上以坐標(biāo)(G,S)表示的相量端點被約束在圓心位于(0.5, 0)處、半徑為0.5 的半圓上, 而多指數(shù)衰減過程的相量端點則位于半圓以內(nèi), 具體地說, 是位于各單指數(shù)衰減組分相量端點連接組成的集合內(nèi). 例如, 對于雙指數(shù)衰減情形,其壽命相量端點位于兩個單指數(shù)衰減組分相量端點的連線上, 且位置與兩個組分的占比有關(guān). 相量圖的這些特點, 使得其在熒光壽命數(shù)據(jù)的定量分析、可視化和聚類分析方面有很大優(yōu)勢.

如前所述, 熒光壽命反映的是熒光分子從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)的退激發(fā)速率, 因此當(dāng)處于激發(fā)態(tài)的熒光分子所處的微環(huán)境不同, 或者熒光分子與其他分子發(fā)生相互作用和能量轉(zhuǎn)移時, 熒光壽命會發(fā)生靈敏的變化. 所以, 許多熒光團(tuán)存在兩個甚至兩個以上的衰減速率, 分別對應(yīng)于熒光團(tuán)的不同狀態(tài), 例如細(xì)胞內(nèi)的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)處于自由態(tài)時(主要位于細(xì)胞質(zhì)中)的熒光壽命為幾百皮秒(t1), 與蛋白質(zhì)綁定后處于結(jié)合態(tài)時(主要位于線粒體中)的熒光壽命則達(dá)到幾納秒(t2)[6].2005 年Brid 等[17]利用干擾NADH/NAD+比例的代謝藥物氰化鉀(Potassium cyanide, KCN)阻斷細(xì)胞的呼吸作用, 證明了細(xì)胞中自由態(tài)和結(jié)合態(tài)NADH 的占比與NADH / NAD+比例有關(guān), 從而提出利用FLIM 測量自由態(tài)和結(jié)合態(tài)NADH 的比例, 來間接獲得活細(xì)胞內(nèi)的NADH/NAD+比例.NADH 與其氧化形式NAD+作為生物體內(nèi)許多氧化還原反應(yīng)的輔酶參與生命活動并相互轉(zhuǎn)化, 它們之間的平衡反映了氧化磷酸化和糖酵解的比率, 因此NADH/NAD+比例及其變化可用于監(jiān)測細(xì)胞代謝方式的變化. 對于細(xì)胞內(nèi)NADH/NAD+比例的探測, 傳統(tǒng)的方法有酶循環(huán)法、毛細(xì)管電泳法、質(zhì)譜分析法等, 但這些方法只適用于對細(xì)胞提取物進(jìn)行檢測. 直接對細(xì)胞內(nèi)NADH/NAD+比例進(jìn)行探測也可以采用熒光強(qiáng)度成像的方法, 這是因為NADH 發(fā)熒光而NAD+不發(fā)熒光. 但由于熒光團(tuán)濃度的不均一性以及自由態(tài)和結(jié)合態(tài)NADH 熒光量子產(chǎn)率的不同, 基于強(qiáng)度成像的NADH/NAD+測量結(jié)果通常存在較大誤差. Brid 等[17]的工作為定量監(jiān)測活細(xì)胞內(nèi)NADH/NAD+的比例提供了一種新的思路, 即通過FLIM 定量測量自由態(tài)和結(jié)合態(tài)NADH 的比例來間接獲得NADH/NAD+比例. 他們的研究還表明, 當(dāng)NADH/NAD+比例發(fā)生變化時, 自由態(tài)和結(jié)合態(tài)NADH 的熒光壽命值(即t1和t2)幾乎保持恒定, 變化的是它們各自的占比(即a1和a2). 多指數(shù)衰減情形的壽命相量與其各個單指數(shù)衰減組分壽命相量之間的線性關(guān)系,使得采用了PA 法分析熒光壽命的phasor-FLIM 特別適合于在已知單指數(shù)衰減組分壽命的前提下, 對多組分尤其是雙組分中不同組分的占比進(jìn)行定量分析. 所以, phasor-FLIM 的典型應(yīng)用之一, 就是根據(jù)壽命相量端點的位置對NADH 兩種壽命組分的占比進(jìn)行定量分析, 從而用于細(xì)胞代謝狀態(tài)的測量[18?27].

此外, 在利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)對蛋白質(zhì)相互作用進(jìn)行研究的FLIM-FRET 實驗, 以及一些利用FLIM 研究細(xì)胞微環(huán)境參量變化的場合, 也會涉及到雙指數(shù)衰減甚至多指數(shù)衰減及其組分占比的變化, 因此phasor-FLIM 在這些應(yīng)用中的報道近幾年也多了起來[28?34].

其次, PA 法生成的相量圖中, 具有相似熒光衰減特征的像素點所對應(yīng)的相量端點會顯示在相近的位置, 因而形成一定的簇狀分布(如圖2(a)和圖2(b)所示), 稱為“相量簇”. 同一個相量簇對應(yīng)于具有相似熒光衰減特性的多個像素點, 但這些像素點在樣品中的分布可以是不連續(xù)的, 和它們的空間分布并沒有直接聯(lián)系. 利用該特點, 可在相量圖上選取感興趣的相量簇, 并通過其對應(yīng)關(guān)系找到相量簇中各相量端點所對應(yīng)的像素點在樣品上的位置, 就可以方便地將樣品中具有相似熒光壽命特征的區(qū)域標(biāo)記出來(如圖2(c)所示), 還可以進(jìn)一步對這些熒光壽命特征相似的區(qū)域進(jìn)行聚類分析, 從而為研究一些生物醫(yī)學(xué)問題帶來極大的便利[18?20].倘若對不同的相量簇對應(yīng)的像素點賦以不同的偽彩色, 則利用該方法還可以方便地實現(xiàn)熒光壽命圖像的多色顯示(如圖2(d)所示), 從而起到輔助病理判斷等作用[35?37]. 最近, 這種利用PA 法對熒光壽命的分布進(jìn)行聚類分析的方法還被應(yīng)用于輔助提高基于受激輻射耗盡(stimulated emission depletion, STED)的超分辨成像的分辨率[38?40].

圖2 Phasor-FLIM 的應(yīng)用思路示意圖 (a)包含未處理壽命信息的熒光強(qiáng)度圖; (b)經(jīng)PA 法分析得到的壽命相量圖; (c)對壽命相量直接進(jìn)行分析; (d)通過相量聚類分析和偽彩色標(biāo)記得到的熒光壽命圖Fig. 2. Schematic diagram of phasor-FLIM application:(a) Fluorescence intensity image with untreated lifetime information; (b) lifetime phasor plot obtained by PA analysis;(c) direct analysis of lifetime phasors; (d) phasor-mapped FLIM image based on phasor clustering analysis and pseudo-color assignment.

綜上, 目前phasor-FLIM 的應(yīng)用可以用圖3來表示. 以下將舉例說明phasor-FLIM 的應(yīng)用研究進(jìn)展.

圖3 Phasor-FLIM 的應(yīng)用分類示意圖Fig. 3. Application classification diagram of phasor-FLIM.

3 Phasor-FLIM 的應(yīng)用研究進(jìn)展

3.1 基于NADH 的細(xì)胞代謝應(yīng)用研究

細(xì)胞的能量主要來自細(xì)胞呼吸, 正常細(xì)胞或正常分化的細(xì)胞在有氧條件下采用糖酵解進(jìn)行代謝,缺氧條件下通過氧化磷酸化進(jìn)行代謝. 而高度增殖的細(xì)胞(如癌細(xì)胞或干細(xì)胞)即使在氧氣充足的條件下也多選擇糖酵解作為主要的產(chǎn)能方式, 這種現(xiàn)象被稱為“Warburg 效應(yīng)”[41]. 而這種細(xì)胞代謝方式的不同導(dǎo)致兩者所含NADH 的濃度和狀態(tài)存在差異. 因此基于前面提到的NADH 處于兩種不同狀態(tài)具有不同熒光壽命的特性, 以NADH 作為內(nèi)源熒光標(biāo)志物的雙光子FLIM 成像常被用于研究正常細(xì)胞、干細(xì)胞、癌細(xì)胞以及其他疾病發(fā)生時細(xì)胞的代謝差異, 而結(jié)合了PA 法的phasor-FLIM可方便地實現(xiàn)活組織中單細(xì)胞代謝表型的觀測, 在細(xì)胞分化和增殖、疾病的機(jī)理研究和診斷等方面均具有很好的應(yīng)用前景, 目前也取得了一些重要的應(yīng)用研究進(jìn)展.

細(xì)胞分化和增殖過程會改變糖酵解和氧化磷酸化之間的平衡, 所以代謝變化可用于研究細(xì)胞分化和增殖狀態(tài). Stringari 等[18?20]通過對細(xì)胞內(nèi)包括NADH 在內(nèi)的各種內(nèi)源性熒光標(biāo)志物進(jìn)行FLIM 成像, 并利用PA 法對FLIM 圖像進(jìn)行分割,可以區(qū)分膠原蛋白、視黃醇、視黃酸, 以及處于自由態(tài)和結(jié)合態(tài)的NADH. 他們對小腸進(jìn)行雙光子FLIM 成像并對利用PA 法得到的壽命相量簇進(jìn)行聚類分析, 用來識別高度增殖的小腸干細(xì)胞, 通過代謝狀態(tài)對小腸干細(xì)胞和分化的后代進(jìn)行分類分析, 以監(jiān)測與代謝變化相關(guān)的生理(病理)過程.Lee 等[21]對白細(xì)胞和白血病細(xì)胞進(jìn)行FLIM 成像,因為白血病細(xì)胞快速增殖, 糖酵解占主導(dǎo)地位, 壽命相量簇向短壽命方向移動, 利用PA 法定量分析自由態(tài)和結(jié)合態(tài)NADH 比例的變化, 可從血液中快速篩選和分離白血病細(xì)胞. 與傳統(tǒng)的生物分子診斷技術(shù)相比, 這種基于phasor-FLIM 的單細(xì)胞篩查方法對細(xì)胞友好, 具有臨床篩選血液細(xì)胞的潛力. 細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)是所有組織必不可少的動態(tài)組成部分, 并通過提供機(jī)械和生化信號來直接影響細(xì)胞行為. ECM 的變化可以改變組織的動態(tài)平衡, 從而潛在地促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生. Romero-Lopez 等[22]將正常細(xì)胞接種在提取自正常人結(jié)腸和轉(zhuǎn)移至肝臟的結(jié)腸腫瘤的ECM 中, 利用phasor-FLIM 技術(shù)定量分析了自由態(tài)和結(jié)合態(tài)NADH 的比例, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種在腫瘤ECM 中的細(xì)胞比接種在正常ECM 中的細(xì)胞具有更高的游離NADH 水平, 糖酵解速率較高, 表明ECM 在癌細(xì)胞及其相關(guān)脈管系統(tǒng)的生長中起到了重要作用.

圖4 Phasor-FLIM 用于分析細(xì)胞在缺氧和線粒體毒性藥物氰化鉀刺激下NADH/NAD+比例的變化, 研究代謝狀態(tài)的轉(zhuǎn)變[27]Fig. 4. Phasor-FLIM was used to analyze the change of NADH/NAD+ ratio under the stimulation of hypoxia and mitochondrial toxic drug potassium cyanide, for studying the change of metabolic state of cells[27].

由于許多疾病的發(fā)病機(jī)制與細(xì)胞代謝也有著密切的關(guān)聯(lián), phasor-FLIM 在疾病的機(jī)理研究及診斷方面也有不少應(yīng)用實例. 例如, 亨廷頓病(Huntington’s disease, HD)是一種常染色體神經(jīng)退行性疾病, 能量代謝障礙是HD 的主要發(fā)病機(jī)制. Sameni 等[23]使用phasor-FLIM 來定量測量HD 中自由態(tài)和結(jié)合態(tài)NADH 的比例變化, 作為活細(xì)胞代謝變化的間接測量, 用以研究HD 發(fā)病機(jī)制, 結(jié)果表明HD 的代謝障礙為糖酵解增加, 導(dǎo)致氧化應(yīng)激和細(xì)胞死亡. 這種定量分析的方法可用于篩選HD 組織并進(jìn)行潛在的藥物篩選, 對診斷和治療疾病具有重要意義. 阿茲海默癥(Alzheimer’s disease, AD)是一種老年人多發(fā)的神經(jīng)退行性疾病, 與抗氧化保護(hù)降低和線粒體功能障礙有關(guān).Dong 等[24,25]使用雙光子激發(fā)FLIM 技術(shù)結(jié)合PA 法定量分析了老年小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元游離NADH 的水平, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增加, 游離的NADH 濃度降低, 氧化磷酸化占據(jù)主導(dǎo)地位,AD 進(jìn)一步惡化, 而還原性治療可恢復(fù)老年小鼠及AD 小鼠神經(jīng)元中游離NADH 的水平. Hato 等[26]則采用類似的方法對活體小鼠腎臟進(jìn)行雙光子FLIM 成像, 使用PA 法分析腎臟中的代謝變化,提供了一種研究腎臟疾病代謝的方法. Datta 等[27]通過雙光子FLIM 對人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的心肌 細(xì) 胞(human induced pluripotent stem cellderived cardiomyocytes, hiPS-CMs)進(jìn)行成像, 檢測缺氧和線粒體毒性藥物氰化鉀病理刺激下代謝狀態(tài)的變化. 如圖4 所示, 缺氧狀態(tài)下和用藥物刺激時hiPS-CMs 的壽命相量分布向自由態(tài)NADH的方向移動, 代謝方式轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒? 這種非侵入性成像技術(shù)有助于研究心臟病的發(fā)病機(jī)理和治療方法[27].

3.2 基于FLIM-FRET 的蛋白互作研究

當(dāng)一個熒光分子(供體)的熒光發(fā)射光譜與另一個熒光分子(受體)的激發(fā)光譜相重疊, 且兩者間的距離合適(一般為6—10 nm)時, 供體的激發(fā)能誘發(fā)受體發(fā)出熒光, 同時其自身的熒光強(qiáng)度發(fā)生衰減, 稱為FRET 效應(yīng). 由于該效應(yīng)發(fā)生的程度(即FRET 效率)與供體和受體的距離緊密相關(guān),該效應(yīng)常被用于研究蛋白質(zhì)間的相互作用(簡稱“蛋白互作”). 具體的做法是將供體熒光分子和受體熒光分子分別標(biāo)記于兩個蛋白質(zhì)分子上, 通過測量FRET 效率來反映兩個蛋白質(zhì)之間的距離, 從而反映其是否發(fā)生相互作用以及相互作用的程度.從熒光壽命的角度看, 當(dāng)FRET 效應(yīng)發(fā)生時, 由于供體將能量轉(zhuǎn)移到受體上, 供體的熒光壽命將變短. 考慮到FLIM 測量不受光漂白等因素的影響,利用FLIM 進(jìn)行FRET 效率的測量比測量熒光強(qiáng)度變化的方法要更加準(zhǔn)確, 因此FLIM-FRET 已被廣泛應(yīng)用于蛋白互作的研究. 發(fā)生和不發(fā)生FRET(或者說FRET 效率很高和很低)兩種狀態(tài)下供體的壽命可認(rèn)為是不變的, 相當(dāng)于兩個單指數(shù)衰減組分, 因此根據(jù)PA 法的分析, 兩種狀態(tài)下得到的壽命相量應(yīng)位于半圓上. 而當(dāng)部分供體發(fā)生FRET 時, 總體的熒光衰減滿足雙指數(shù)衰減規(guī)律,壽命相量端點將位于上述兩個單組分壽命相量端點的連線上, 且到兩端的距離與兩種組分的占比有關(guān), 由此可方便地計算出FERT 效率. 2012 年和2013 年, Hinde 等[28,29]利 用 phasor-FLIM 和FRET 監(jiān)測了小G 蛋白與RBD 蛋白在溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)刺激下相互作用的變化, 結(jié)果表明, 在熒光強(qiáng)度圖像看不出明顯差異的情況下, FLIM 圖像和PA 定量分析均顯示小G 蛋白與RBD 蛋白的標(biāo)簽蛋白EPCF 和Critine在LPA 刺激下FRET 效率顯著增加(如圖5 所示). Lou 等[30]在 共 表 達(dá)H2B-eGFP 和H2BmCherryrry兩種熒光蛋白的Hela 細(xì)胞中利用phasor-FLIM 測得的FRET 效率對核小體的緊實度進(jìn)行了量化, 用于定量反應(yīng)DNA 的損傷情況.

圖5 Phasor-FLIM 用于定量測量RhoA-kRas 單鏈生物傳感器的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)效率, 研究蛋白互作[28]Fig. 5. Phasor-FLIM was used in quantitative FRET efficiency detection of a RhoA-kRas single chain biosensor, studying interaction between proteins[28].

3.3 基于敏感探針的細(xì)胞微環(huán)境參量測量

由于熒光壽命與熒光分子所處的微環(huán)境密切相關(guān), 因此采用一些對細(xì)胞中某種微環(huán)境參量(如溫度、pH 值、離子濃度、黏度等)特別敏感的熒光探針對這些微環(huán)境參量及其變化進(jìn)行定量測量是FLIM 的常規(guī)應(yīng)用. Chen 等[31]將PA 法應(yīng)用于溫度的FLIM 測量, 通過熒光分子羅丹明B 的壽命相量圖定量分析比較了Hela 細(xì)胞在8 種不同溫度下壽命相量簇的分布變化. Battisti 等[32]采用具有pH 依賴性的熒光團(tuán)E2GFP, 利用phasor-FLIM 將所有的實驗圖像在同一個相量圖上進(jìn)行比較, 從而分析細(xì)胞在生理狀態(tài)和非生理狀態(tài)下pH 值的變化(如圖6 所示). 深圳大學(xué)Zhou 等[33]使用phasor-FLIM 分析監(jiān)測了pH 敏感的細(xì)胞間納米藥物的釋放. 他們合成聚合物納米顆粒PAHCit/DOX, 用于阿霉素(DOX)在癌細(xì)胞中的有效釋放, 并對其釋放過程進(jìn)行了監(jiān)測. 具體來說, 這種PAH-Cit/DOX 納米顆粒在生理pH 下穩(wěn)定, 但在弱酸性條件下能夠有效釋放DOX. 同時, 他們采用phasor-FLIM 對該納米粒子在癌細(xì)胞中釋放DOX 的熒光壽命進(jìn)行了監(jiān)測, 從而提供了一種評估納米載體藥物釋放效率的方法. Ferri 等[34]則開發(fā)了一種基于BODIPY 的黏度敏感熒光分子BoMe, 將BoMe 與phasor-FLIM 相結(jié)合用于評估早衰綜合癥(Hutchinson-Gilford progeria syndrome,HGPS)細(xì)胞內(nèi)的黏度.

3.4 輔助病理診斷

圖6 Phasor-FLIM 用于分析細(xì)胞在正常(靜止)狀態(tài)和氧化應(yīng)激狀態(tài)下pH 值的變化[32]Fig. 6. Phasor-FLIM was used to analyze the changes of pH value of cells in normal state (at rest) and under oxidative stress[32].

非黑色素瘤皮膚癌(non-melanoma skin cancers, NMSC)是白種人群體中最常見的腫瘤疾病, 光化性角病(actinic keratosis, AK)、博文病(Bowen disease, BD)、基 底 細(xì) 胞 癌(basal cell carcinoma, BCC)和浸潤性鱗狀細(xì)胞癌(invasive squamous cell carcinoma, SCC)都是其常見的亞型. 該類型皮膚疾病的臨床癥狀很不明顯, 因而采用活組織實現(xiàn)對NMSC 的診斷比較困難, 目前臨床上主要是通過對蘇木精和伊紅(hematoxylin and eosin, H&E)染色切片的形態(tài)學(xué)特征分析來進(jìn)行診斷. 但這種方法鑒別與診斷上述不同NMSC亞型的準(zhǔn)確性通常與病理學(xué)家的專業(yè)知識、技能和經(jīng)驗有關(guān), 可能會導(dǎo)致不同人員鑒別與診斷的結(jié)果存在巨大差異, 主觀性大, 出錯概率較高, 影響后續(xù)治療. 2017 年, 深圳大學(xué)的Luo 等[35]對H&E 染色的皮膚病理切片進(jìn)行了雙光子FLIM 成像, 并結(jié)合PA 法定量分析了AK, BD, BCC 這三種類型的皮膚腫瘤對應(yīng)的壽命相量簇分布情況, 結(jié)果表明不同皮膚腫瘤疾病的壽命相量簇其坐標(biāo)值、角斜率、相量面積分布均存在差異, 提示phasor-FLIM 技術(shù)可為鑒別診斷這些皮膚腫瘤疾病提供一種簡便可行的組織病理學(xué)分析方法, 其準(zhǔn)確性和客觀性相對于明場H&E 診斷將有顯著提高. 此外,他們還采用PA 法對H&E 染色的BCC 細(xì)胞切片的熒光壽命數(shù)據(jù)進(jìn)行了半定量分析[36], 并通過聚類分析對不同的相量簇賦以不同的偽彩色, 從而使FLIM 圖像上的病理學(xué)特征更加明顯, 可進(jìn)一步輔助病理診斷和促進(jìn)細(xì)胞病變及發(fā)展機(jī)理方面的深入研究(如圖7 所示).

輸尿管的阻塞會增加腎小管的壓力, 降低腎小球的濾過率, 并通過腎臟激活許多血管活性激素和細(xì)胞因子, 導(dǎo)致纖維化. 臨床上常用Picrosirius 紅或Masson Trichrome 染色的組織切片, 依靠病理學(xué)家專業(yè)的知識來診斷間質(zhì)纖維化. Ranjit 等[37]利用phasor-FLIM 研究了小鼠腎臟單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)纖維化的發(fā)展過程, 根據(jù)相量分布的平均位置、形狀、角度和數(shù)目, 區(qū)分了健康組織和病變的纖維化組織,同時可以從FLIM 圖像定量得到纖維化程度, 可用于監(jiān)測疾病發(fā)展或治療效果.

3.5 提升超分辨成像分辨率

圖7 Phasor-FLIM 聚類分析和偽彩色標(biāo)記用于增強(qiáng)H&E 染色基底細(xì)胞癌(BCC)切片病理學(xué)特征的可視化, 可輔助病理診斷[36]Fig. 7. Phasor-FLIM clustering analysis and pseudo-color assignment was used to enhance visualization of pathological features of basal cell carcinoma (BCC) sections stained with H&E, assisting pathological diagnosis[36].

圖8 Phasor-FLIM 聚類分析用于濾除受激輻射耗盡(STED)成像中環(huán)形擦除光區(qū)域的光子, 可輔助提升超分辨成像分辨率[39]Fig. 8. Phasor-FLIM cluster analysis was used to filter out the photons in the annular depletion region in stimulated radiation depletion (STED) imaging, improving the resolution of super-resolution imaging[39].

STED 技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種超分辨顯微成像技術(shù), 在“突破”分辨率極限和相關(guān)應(yīng)用方面都取得了顯著成果[42]. 該技術(shù)使用高強(qiáng)度環(huán)形擦除光使衍射極限范圍內(nèi)除中心點以外的熒光分子發(fā)生受激輻射而不產(chǎn)生熒光(稱為“擦除”), 從而有效減小系統(tǒng)的點擴(kuò)散函數(shù)獲得超分辨率. 提高擦除光功率可進(jìn)一步提高分辨率, 但代價是增加了光漂白、光毒性和反斯托克斯發(fā)射背景, 從而降低了信噪比, 并嚴(yán)重限制了STED 技術(shù)在活細(xì)胞成像中的應(yīng)用. STED 中擦除光的作用, 是使處于激發(fā)態(tài)的粒子發(fā)生受激輻射而迅速躍遷回基態(tài), 相當(dāng)于縮短了這部分熒光分子的壽命. 因此, 受到擦除光照射的熒光分子與未受到擦除光照射的熒光分子會分布在相量圖中的不同位置, 對壽命相量進(jìn)行聚類分析, 可將兩種狀態(tài)下的熒光分子分離. 2015年, Lanzanò等[38]利用該原理, 將phasor-FLIM與STED 結(jié)合, 在較低擦除光功率的條件下通過濾除掉環(huán)形區(qū)域的光子實現(xiàn)了與較高擦除功率相當(dāng)?shù)姆直媛? 2018 年, 深圳大學(xué)的Wang 等[39]也將phasor-FLIM 應(yīng)用于STED, 通過只選擇激發(fā)光斑中心未被擦除光照射的目標(biāo)光子進(jìn)行圖像重構(gòu), 從而在不增加擦除光能量的前提下成功將 光 子 進(jìn) 行 分 離, 將 分 辨 率 從150 nm 提 升到80 nm (如圖8 所示). 類似地, Tortarolo 等[40]也利用PA 法實現(xiàn)了光子分離, 提出了pSTEDSPLIT 方法, 在不增加擦除光功率的前提下可有效提高分辨率.

4 總結(jié)與展望

FLIM 技術(shù)通過采集熒光探針分子的壽命信息進(jìn)行成像, 具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、可定量測量的優(yōu)勢, 常用于探測細(xì)胞微環(huán)境參量分布、能量代謝狀態(tài), 表征材料內(nèi)部結(jié)構(gòu)及性質(zhì)等方面, 因而在生物醫(yī)學(xué)、材料學(xué)等諸多領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用. 為了從采集到的大通量壽命數(shù)據(jù)中快速精準(zhǔn)地獲取樣品內(nèi)部的結(jié)構(gòu)與功能信息, 發(fā)展一種簡單快速而且實用的壽命數(shù)據(jù)分析方法在實際生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中具有重要的意義. 近些年興起的PA 法在頻域計算壽命, 無需擬合, 分析簡便, 對科研人員的專業(yè)知識背景要求不高, 因此發(fā)展和應(yīng)用均非常迅速.相比傳統(tǒng)的NL-LS 擬合, 該方法不僅分析速度快,相同壽命精度下要求的采集光子數(shù)少, 間接縮短了數(shù)據(jù)采集時間, 有利于發(fā)展快速FLIM 成像技術(shù),而且能將具有相似衰減特征的像素點以“相量簇”的形式呈現(xiàn), 具有強(qiáng)大的數(shù)據(jù)可視化功能, 也便于對數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析等, 因而在基于NADH 的細(xì)胞代謝狀態(tài)測量、基于FLIM-FRET 的蛋白互作研究、基于敏感探針的細(xì)胞微環(huán)境參量測量和輔助病理診斷、提升超分辨成像分辨率等方面均取得了很好的應(yīng)用研究進(jìn)展. 基于此, 本文詳細(xì)闡述了PA 法的基本原理及其運(yùn)用方法, 并在此基礎(chǔ)上介紹了運(yùn)用PA 法的phasor-FLIM 在上述幾個方面的應(yīng)用實例, 著重討論了PA 法在這些FLIM 應(yīng)用實例中的優(yōu)勢所在, 為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供有益的參考.

然而, 盡管近年來phasor-FLIM 在實際應(yīng)用中已經(jīng)取得了許多重要的研究進(jìn)展, 但與此同時還存在一些局限性. 例如, 雖然PA 處理時對采集光子數(shù)的要求要比傳統(tǒng)擬合算法低很多, 但是在快速FLIM 成像時當(dāng)采集的光子數(shù)較少或信噪比較差時, 其相量簇的分布就會比較雜散, 據(jù)此分析得到的結(jié)果可靠性往往不夠高. 為了解決這一問題,目前已有報道將中值濾波、小波變換等圖像處理方法應(yīng)用于對低信噪比的壽命數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)降噪處理,以提高熒光壽命分析的精度. 此外, 為了獲取可靠的熒光壽命計算結(jié)果, PA 法處理前通常需要利用系統(tǒng)的儀器響應(yīng)函數(shù)加以校準(zhǔn), 相比無需校準(zhǔn)的衰減曲線尾部擬合的方法要多一個步驟, 對非專業(yè)人員而言有時候不夠便利. 但是即便如此, 相信隨著生命科學(xué)對快速定量成像需求的日益增加以及PA 法的進(jìn)一步發(fā)展完善, phasor-FLIM 一定會有越來越廣泛的應(yīng)用前景, 在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用.