王鵬，葛曉陽，李付廣

（中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室，河南安陽455000）

1983 年轉(zhuǎn)基因煙草首次獲得成功， 標志著植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的誕生。 1997 年我國開始種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花，并取得良好的抗蟲效果，創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟效益。 隨著轉(zhuǎn)基因棉花種植面積的持續(xù)擴大，國家越來越重視轉(zhuǎn)基因生物安全評價。 轉(zhuǎn)基因材料的種植和審批必須要明確其分子特征，明確轉(zhuǎn)基因植株T-DNA 的插入位點及側(cè)翼序列是對轉(zhuǎn)基因知識產(chǎn)權(quán)的保護， 可以作為監(jiān)管和保護的依據(jù)，為進一步研究其分子機理提供理論基礎(chǔ)。

基因組學技術(shù)的出現(xiàn)給生物學研究帶來了革命性的變化，側(cè)翼序列的測定仍然是確定基因結(jié)構(gòu)的重要步驟?，F(xiàn)階段對側(cè)翼序列的測定都是基于以下2 種方法，1 種是基于基因組文庫連續(xù)區(qū)域或大片段克隆， 另1 種是基于聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）的近距離克隆。 根據(jù)這些方法的原理， 主要分為基于限制性內(nèi)切酶的PCR、 基于隨機引物的PCR 和基于接頭的PCR[1]。使用常規(guī)的技術(shù)測定側(cè)翼序列存在一些缺點，當擴增靶區(qū)域時，有些未知/ 已知區(qū)域中限制性內(nèi)切酶位點的可用性成為限制因素[2]，有些非特異性擴增產(chǎn)物太多[3]，都會導(dǎo)致側(cè)翼序列的鑒定效率與準確率下降。 由Liu 等[4]首次提出的熱不對稱交錯PCR技術(shù)（Thermal asymmetric interlaced PCR，Tail-PCR），具有簡單易行、靈敏度高、特異性好、重復(fù)性高、不涉及酶切連接等多種優(yōu)勢。 2007 年，Liu 等[5]對Tail-PCR 改進為了高效熱不對稱交錯PCR（High-efficiencythermal asymmetric interlaced PCR，hiTail-PCR），在兼并引物的5’端增加了23 bp 的已知序列， 提高了Tail-PCR 的特異性與擴增效率。Wang 等[6]提出了融合引物與巢式聚合酶鏈式反應(yīng)（Fusion primer and nested integrated PCR，F(xiàn)PNI-PCR），與Tail-PCR 和hiTail-PCR 原理類似，但效率更高、特異性更好、更加靈敏和準確。隨著技術(shù)的改進提高， 對于已經(jīng)創(chuàng)建了大型T-DNA 插入文庫的生物，如水稻和擬南芥[7]，以及轉(zhuǎn)基因棉花不斷發(fā)展的今天，1 種準確高效的方法具有重要的意義。

本研究通過FPNI-PCR 對cry2Ab4 轉(zhuǎn)基因棉花材料L280 及cry2Ab4、vip3Aa11 雙價轉(zhuǎn)基因棉花材料L282 的T-DNA 在基因組上的插入位置進行測定分析。cry2Ab4 與vip3Aa11 兩個外源殺蟲基因均來自于蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis,Bt），分別編碼殺蟲晶體蛋白和營養(yǎng)期殺蟲蛋白，轉(zhuǎn)基因植株對鱗翅目害蟲如小地老虎、棉鈴蟲等具有較好的殺蟲效果，對2 種轉(zhuǎn)基因抗蟲棉側(cè)翼序列進行測定，為后續(xù)科研試驗、專利保護以及安全評價等提供了重要的分子理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

轉(zhuǎn)cry2Ab4 基因抗蟲棉L280 與轉(zhuǎn)cry2Ab4、vip3Aa11 雙價抗蟲棉L282 由本實驗室通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化棉花下胚軸的方法獲得，通過檢測為穩(wěn)定遺傳的T5轉(zhuǎn)基因材料。 Ex-Taq DNA 聚合酶、DNA marker、pMD18-T 載體等購自寶生物工程（大連）有限公司；PCR 產(chǎn)物回收試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DH5α 感受態(tài)菌株等購自全式金生物技術(shù)（北京）有限公司，PCR 引物的合成和克隆片段的測序由生工生物工程（上海）有限公司完成。

1.2 DNA 的提取

本研究對棉花基因組DNA 的完整性要求較高，參考李忠旺等[8]的CTAB 法提取DNA，注意在提取的過程中不要劇烈晃動，將提取的DNA 于4 ℃保存待用。

1.3 FPNI-PCR 引物及驗證引物

參考Wang 等[7]在棉花基因組上設(shè)計9 個融合引物FP1-FP9、及2 個特定引物FSP1、FSP2。 根據(jù)轉(zhuǎn)化時用到的植物表達載體pCAMBIA2300 的左邊界（Left border,LB）和右邊界（Right border,RB）的序列，由Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計， 分別設(shè)計3 對引物為：LSP1/RSP1、LSP2/RSP2、LSP3/RSP3。此外還分別設(shè)計驗證L280 與L282 轉(zhuǎn)基因植株T-DNA 完整性的引物各3 對：L280-a1/L280-b1、L280-a2/L280-b2、L280-a3/L280-b3；L282-a1/L282-b1、L282-a2/L282-b2、L282-a3/L282-b3 引物具體序列見表1。

表1 FPNI-PCR 的引物序列

表1 （續(xù)）

1.4 FPNI-PCR 擴增體系與反應(yīng)條件

FPNI-PCR 擴增體系和擴增程序參考文獻[7]，具體體系與程序見表2。 第一輪PCR 以基因組DNA 為模板，分別將左邊界引物LSP1 與9 個融合引物FP、 右邊界引物RSP1 與9 個融合引物FP 配對，共18 對引物，按照第一輪PCR 程序進行擴增；第二輪PCR 分別以第一輪PCR 的18 個產(chǎn) 物 （1 μL） 作 為 模 板， 左 邊 界 引 物 對 使 用LSP2/FSP1，右邊界引物對使用RSP2/FSP1，按照第二輪PCR 程序進行擴增； 將第二輪PCR 的產(chǎn)物分別稀釋50 倍，各取1 μL 作為模板，左邊界引物對使用LSP3/FSP2， 右邊界引物對使用RSP3/FSP2， 按照第三輪PCR 程序進行擴增，共計18 個產(chǎn)物，三輪PCR 結(jié)束后將有條帶的送去測序，將測序結(jié)果分別與載體和棉花基因組進行比對分析。

表2 三輪PCR 反應(yīng)程序

1.5 側(cè)翼序列的獲取及比對分析

將第三輪擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離后，特異條帶用膠回收試劑盒回收純化， 將回收的PCR 片段連接到pGEM-T easy 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，每個轉(zhuǎn)化隨機挑5 個單克隆菌落， 使用通用引物M13進行測序驗證。 根據(jù)測序的結(jié)果，分別與載體骨架pCAMBIA2300 左右邊界序列以及Cotton FGD 的棉花基因組數(shù)據(jù)庫 （https://cottonfgd.org/） 進行比對， 通過比對結(jié)果確定T-DNA 左右邊界在基因組上的插入位置。

1.6 側(cè)翼序列的驗證與T-DNA 區(qū)域的分析

根據(jù)插入的位置， 在T-DNA 兩側(cè)的棉花基因組上設(shè)計引物（圖2A、2C），L280-F1 或L280-F2 結(jié)合載體的左邊界序列LSP3 配對擴增，L280-R1 或L280-R2 結(jié)合載體的右邊界序列RSP3 配對擴增；L282-F1 或L282-F2 結(jié)合載體的左邊界序列LSP3配對擴增，L282-R1 或L282-R2 結(jié)合載體的右邊界序列RSP3 配對擴增， 以此對T-DNA 插入位點進行驗證。 同時分別在T-DNA 區(qū)域內(nèi)設(shè)計引物進行擴增驗證（圖2A、2C），將擴增的結(jié)果與預(yù)測的條帶大小比較驗證， 根據(jù)驗證的結(jié)果將T-DNA 的完整序列在棉花基因組中的插入位置標識出來。

2 結(jié)果與分析

2.1 FPNI-PCR 擴增結(jié)果

分別選取轉(zhuǎn)cry2Ab4 抗蟲棉（田間編號L280）與轉(zhuǎn)cry2Ab4、vip3Aa11 雙價抗蟲棉 （田間編號L282）的DNA 作為模板，通過FPNI-PCR 進行三輪擴增，擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳（圖1），L280左邊界有8 個條帶，大于500 bp 的有6 條，主要集中在500～2 000 bp；右邊界沒有條帶，可能是載體右側(cè)邊緣存在缺失等原因造成的。 L282 左邊界擴增的4 個有條帶， 右邊界擴增的2 個有條帶，6 個條帶均大于500 bp。

圖1 兩個轉(zhuǎn)基因抗蟲棉FPNI-PCR 的電泳圖

2.2 側(cè)翼序列的克隆分析及驗證

根據(jù)電泳結(jié)果，將擴增條帶切膠回收，純化后的產(chǎn)物測序驗證。 將測序結(jié)果分別與Cotton FGD的棉花基因組數(shù)據(jù)庫和載體骨架pCAMBIA2300左右邊界序列進行比對，結(jié)果表明，L280 的擴增條帶L1、L3、L6、L7、L8、L9 的序列均能與載體骨架pCAMBIA2300 和棉花基因組比對上，T-DNA 插入位點位于棉花基因組D13 染色體上61 309 969-61 309 997 bp 區(qū)間 （圖2A） 基因組缺失27 bp，T-DNA 左右兩端分別缺失15 bp 與28 bp。 小于500 bp 的2 個條帶與T-DNA 和棉花基因組都沒有相似序列，推測這2 個條帶可能是非特異性擴增產(chǎn)物。L282 擴增的6 個條帶核苷酸比對結(jié)果表明，這6 個條帶與載體骨架pCAMBIA2300 和棉花基因組都有部分相同的核苷酸序列，T-DNA 插入位點位于D11 染色體上11 069 019-11 069 039 bp 區(qū)間（圖2C），基因組缺失19 bp，T-DNA 左右兩端分別缺失21 bp 與17 bp。 根據(jù)基因組比對的結(jié)果，分別選取L280 和L282 兩個材料LB 與RB 的側(cè)翼序列各1 000 bp ，通過計算分析，側(cè)翼序列的AT 堿基含量較高。 材料L280 的LB 與RB 側(cè)翼序列AT堿基含量分別為72%、69%； 材料L282 的LB 與RB 側(cè)翼序列AT 堿基含量分別為64%、67%。 為進一步驗證T-DNA 插入的準確性， 分別在T-DNA插入位點兩側(cè)的棉花基因組DNA 上設(shè)計特異性引物與載體邊界序列進行PCR 擴增（圖2A、2C），產(chǎn)物測序結(jié)果表明分離得到的側(cè)翼序列是正確的。

2.3 T-DNA 完整性分析

根據(jù)在圖2A 和2C 上標識的T-DNA 特異性引物，經(jīng)PCR 擴增、瓊脂糖凝膠電泳，從圖2B 和圖2D 中可以看出， 條帶大小與預(yù)測一致。 說明T-DNA 插入的各個元件都保持了較好地完整性。

圖2 兩個轉(zhuǎn)基因抗蟲棉T-DNA 插入位點及完整性示意圖

3 討論

本研究為了分析cry2Ab4 基因抗蟲棉（L280）與轉(zhuǎn)cry2Ab4＋vip3Aa11 基因雙價抗蟲棉（L282）的插入位點，探究了FPNI-PCR 在棉花中高效的側(cè)翼序列克隆方法。 研究結(jié)果表明，18 個泳道只要有1 個擴增的條帶可以與載體骨架與基因組分別比對上，就可以確定插入位點，然后通過在基因組上設(shè)計特異性的引物即可進行驗證。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，功能基因的不斷挖掘以及未來棉花突變體庫的建立，1 種高效的側(cè)翼序列測定的方法是必不可少的。 FPNI-PCR 在本實驗中能夠高效對側(cè)翼序列進行測定，因此在載體邊界序列信息清楚的情況下，使用該方法省時省力，特異性高。轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的種植不僅能夠減少棉花生產(chǎn)的成本和棉農(nóng)的勞動強度， 同時也對生態(tài)環(huán)境起到良好的保護作用。 轉(zhuǎn)基因的側(cè)翼序列就是該品種的標簽，明確轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的插入位點對申請安全證書有一定幫助，對改善轉(zhuǎn)基因棉花市場的監(jiān)管也能起到積極的作用。 因此，測定兩種抗蟲棉的側(cè)翼序列是對其進行后續(xù)研究的必要步驟。

4 結(jié)論

本研究通過FPNI-PCR 成功擴增出cry2Ab4基因抗蟲棉（L280）與轉(zhuǎn)cry2Ab4＋vip3Aa11 基因雙價抗蟲棉 （L282） 的側(cè)翼序列。 確定了它們的T-DNA 插入位置， 分別位于棉花基因組染色體D13 上61 309 969-61 309 997 bp 區(qū) 間 和D11 上11 069 019-11 069 039 bp 區(qū)間。 通過設(shè)計特異性引物， 對插入位點的準確性與T-DNA 區(qū)域的完整性分別進行了驗證分析。檢測兩種抗蟲棉的側(cè)翼序列不僅能夠為品種的保護在申請專利時提供理論依據(jù)， 也在后續(xù)研究以及安全證書的申請?zhí)峁?shù)據(jù)支撐。