陳灼林?劉佳?謝冰冰?甘周慶?鐘秀風(fēng)?彭福華

【摘要】目的 建立和鑒定CLCN2基因突變患者尿液來源特異誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC），并初步探討其神經(jīng)分化能力。方法 收集臨床上1例CLCN2基因突變患者尿液細(xì)胞，將表達(dá)重編程因子OCT4、SOX2、KLF4和SV40LT的附加型載體通過電轉(zhuǎn)染導(dǎo)入尿液細(xì)胞，使其重編程為iPSC，并繼續(xù)誘導(dǎo)其神經(jīng)分化。通過Sanger測(cè)序、核型鑒定、免疫熒光、逆轉(zhuǎn)錄PCR、畸胎瘤實(shí)驗(yàn)及定向分化等評(píng)價(jià)干細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞特性。結(jié)果 電轉(zhuǎn)后部分尿液細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變，形成邊界清楚的致密細(xì)胞克隆團(tuán);這些克隆狀生長(zhǎng)的細(xì)胞可以連續(xù)傳代，具有正常核型，含有CLCN2基因無義突變，表達(dá)多能干性標(biāo)記且無外源基因;裸鼠體內(nèi)形成三胚層畸胎瘤;體外可定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。結(jié)論 CLCN2基因突變患者尿液細(xì)胞可重編程為iPSC，并可體外分化為神經(jīng)細(xì)胞，可為CLCN2基因突變相關(guān)疾病的研究提供重要材料。

【關(guān)鍵詞】誘導(dǎo)多能干細(xì)胞;CLCN2;白質(zhì)腦病;神經(jīng)分化

Establishment of urine-derived induced pluripotent stem cell line from one patient carrying homozygous mutations in CLCN2 gene and differentiation into neural cells Chen Zhuolin， Liu Jia， Xie Bingbing， Gan Zhouqing， Zhong Xiufeng， Peng Fuhua. Department of Neurology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding authors， Peng Fuhua， E-mail： pengfh@ mail. sysu. edu. cn; Zhong Xiufeng， E-mail： zhongxf7@ mail. sysu. edu. cn

【Abstract】Objective To construct and identify the urine-derived induced pluripotent stem cells （iPSC） from one patient carrying homozygous mutations in CLCN2 gene， and to initially explore their ability of neural differentiation. Methods Urine cells from one patient with CLCN2 gene mutation were collected and transfected with episomal plasmids carrying the OCT4， SOX2， KLF4 and SV40LT to be reprogrammed into iPSC， and then be differentiated into neural cells. The characteristic of the iPSC and the neural cells were verified by Sanger sequencing， karyotyping analysis， immunocytochemistry， RT-PCR， teratoma test， directed differentiation and so on. Results The transfected urine cells gradually appeared some clonal cell clusters with clear boundary， which could be continuously passaged， showed normal karyotype， contained homozygous CLCN2 mutation and expressed pluripotent markers without integration of exogenous genes. Three germ-layer teratomas were identified in the nude mice. These iPSC could be induced to differentiate into neural stem cells and astrocytes.? Conclusion Urine cells from one patient carrying homozygous mutations in CLCN2 gene can be reprogrammed into iPSC and neural cells， which can provide vital evidence for investigating CLCN2 gene mutation-associated diseases.

【Key words】Induced pluripotent stem cell;CLCN2;Leukoencephalopathy;Neural differentiation

CLCN2基因是編碼氯離子通道2（ClC-2）蛋白的基因。ClC-2在人體中分布廣泛，尤其在大腦中表達(dá)較高，其在調(diào)節(jié)水電解質(zhì)平衡中發(fā)揮重要作用。CLCN2相關(guān)白質(zhì)腦?。–C2L）是由CLCN2基因突變進(jìn)而導(dǎo)致ClC-2功能障礙而引起的常染色體隱性遺傳病。CC2L患者常表現(xiàn)為視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜病變或視神經(jīng)萎縮、男性不育、小腦性共濟(jì)失調(diào)、認(rèn)知障礙、學(xué)習(xí)障礙等，顱腦MRI常提示髓鞘空泡變性[1]。關(guān)于CC2L，僅有少量的病例報(bào)道，且由于尚無合適的疾病模型，其致病機(jī)制尚不明確，目前也無有效的治療手段。因此，創(chuàng)建用于研究CLCN2基因相關(guān)疾病的體外細(xì)胞模型很有必要。

隨著體細(xì)胞重編程技術(shù)的發(fā)展，獲取患者特異的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）成為現(xiàn)實(shí)[2]。研究表明，iPSC具有向機(jī)體幾乎所有細(xì)胞分化的能力，不僅可構(gòu)建多種體外細(xì)胞模型進(jìn)行疾病機(jī)制的研究以及藥物篩查，還可用于替代移植治療[3-4]。本課題組旨在建立CLCN2突變患者特異iPSC系（CC2L-iPSC），為CLCN2突變相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制及治療提供研究基礎(chǔ)。

材料與方法

一、標(biāo)本來源

采集1例就診于中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的38歲女性患者的尿液。該例患者表現(xiàn)為雙手的意向性震顫、記憶減退、耳鳴及視力減退;體格檢查提示小腦性共濟(jì)失調(diào);大腦MRI提示內(nèi)囊、大腦腳和小腦中腳的白質(zhì)出現(xiàn)異常的T1加權(quán)像低信號(hào)、T2加權(quán)像高信號(hào)，隨后的Sanger測(cè)序證實(shí)其CLCN2基因有1個(gè)純合致病突變（Exon20： c.2257C>T; p.Arg753Ter），其符合CC2L的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。本實(shí)驗(yàn)征得患者同意并簽署知情同意書，而且經(jīng)中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、細(xì)胞、質(zhì)粒和主要試劑

1. 細(xì)胞和質(zhì)粒

正常人IPSC系UE017及質(zhì)粒pCEP4-miR-302- 367 cluster均由中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院潘光錦研究組饋贈(zèng);pEP4-EO2S-ET2K 購(gòu)自美國(guó)Addgene。

2. 主要培養(yǎng)基配方

尿液細(xì)胞培養(yǎng)液——由DMEM/Hams：F12 1：

1（Life Technologies）、10%胎牛血清（Gibco）、0.1

mmol/L非必需氨基酸（Gibco）、1 mmol/L Gluta MaxTM-1（Gibco）、0.1 mmol/L β-Mercaptoethanol （Gibco）和0.1 mmol/L Renal Cell Growth Medium（Lonza）、0.1 mmol/L Single Quotkit supplements（Lonza）、0.1 mmol/L penicillin/streptomycin（Gibco）配成;神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基（Gibco）;增殖培養(yǎng)基——由Neurobasal Medium（Gibco）、Advanced DMEM/F-12（Gibco）和Neural Induction Supplement（Gibco）按49∶49∶2配成;星形膠質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng)基——由DMEM（Gibco）、1x N2和1%胎牛血清（Natocor）配成。

3. 其它主要試劑

L-gelatin基質(zhì)膠（Millipore）;EDTA-胰蛋白酶（trypsin-EDTA，Gibco）;NucleofectorTM Kit for primary mammalian epithelial cell試劑盒（Lonza）;Matrigel胚胎干細(xì)胞基質(zhì)膠（Cornning）;mTeSR1TM培養(yǎng)液（Stem Cell Technologies）;EDTA （Invitrogen）;Accutase （Invitrogen）;Prime ScriptTM RT Master Mix試劑盒（Takara）;SYBR Premix EX Taq 試劑盒（Takara）;瑞氏-姬姆薩染色液（貝索生物）; BCIP /NBT、堿性磷酸酯酶顯色試劑盒（碧云天生物）。引物均由英濰捷基（上海）公司合成，具體序列見表1。免疫熒光所用抗體信息見表2。

三、方 法

1. 尿液細(xì)胞的收集、擴(kuò)增培養(yǎng)

采集CLCN2突變患者清潔中段尿500 ml，室溫下×400 g離心10 min后棄掉上清液。離心后的尿液細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后加入2 ml尿液細(xì)胞培養(yǎng)液重懸。重懸后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至L-gelatin包被并加有每孔2 ml尿液細(xì)胞培養(yǎng)液的六孔板中，置于恒溫箱中培養(yǎng)。5 d后，當(dāng)細(xì)胞群融合時(shí)，用0.25% trypsin-EDTA消化，并按1∶3傳代。

2. 尿液細(xì)胞的重編程

根據(jù)文獻(xiàn)[6]的方法進(jìn)行操作，尿液細(xì)胞擴(kuò)增至約1.5×106個(gè)/孔后，按NucleofectorTM Kit for primary mammalian epithelial cell 試劑盒的說明往尿液細(xì)胞中加入電轉(zhuǎn)緩沖液，并加入6 μg pEP4-EO2S-ET2K質(zhì)粒以及4 μg pCEP4-miR-302-367 cluster質(zhì)粒，通過Amaxa電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)染（程序： T-020，Lonza）。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞按2×105個(gè)/孔接種于

Matrigel包被的六孔板中，加入尿液細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)2 d后，換mTeSR1TM培養(yǎng)液于恒溫箱中（37℃，5%CO2）繼續(xù)培養(yǎng)，隔日換液。電轉(zhuǎn)染18 d后，挑取生長(zhǎng)狀況良好且具有清晰邊界的克隆，轉(zhuǎn)移至新的Matrigel包被的六孔板中，加入mTeSR1TM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，用0.5 mmol/L EDTA消化，并按1∶3 ～ 1∶6進(jìn)行傳代。

3. iPSC向星形膠質(zhì)細(xì)胞定向分化能力鑒定

采用文獻(xiàn)[7]的誘導(dǎo)方案，iPSC傳代后第2日，換神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每日換液，7 d得到原始神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）。加入Accutase細(xì)胞消化液把原始NSC消化為單細(xì)胞，按5×105個(gè)/孔接種于Matrigel包被的六孔板中，加入神經(jīng)增殖培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)，隔日換液，培養(yǎng)5 ～ 7 d后得到成熟NSC，此時(shí)可傳代或進(jìn)行后續(xù)分化操作。進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞分化時(shí)，把Accutase消化后的NSC按5×105個(gè)/孔接種于Matrigel包被的六孔板中，加入星形膠質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng)基，隔日換液，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)（5 ～ 7 d）用Accutase消化并按1∶4進(jìn)行傳代，培養(yǎng)約25 d。

4. 核型鑒定

iPSC傳代6次后，融合度達(dá)到80%時(shí)，用0.2 μg/ml秋水仙堿在室溫中處理細(xì)胞2 h，然后加入0.5 mmol/L EDTA消化并收集細(xì)胞，加入0.075 mol/L

KCl溶液于37℃中處理20 min，然后用卡諾氏固定液（乙酸∶乙醇為1∶3）1 ml，在37℃中固定40 min。200 r/min離心5 min，加入1 ml卡諾式固定液重懸，吸取懸液滴在一干凈的載玻片上，然后置于75℃烘箱中3 h。最后，滴加5%的Giemsa染液染色20 min，自然晾干后在Olympus顯微鏡下進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)G帶核型分析。

5. 基因突變分析

收集2×106 iPSC送往廣州金域醫(yī)學(xué)公司進(jìn)行Sanger測(cè)序，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果用Swiss模型預(yù)測(cè)iPSC的ClC-2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)[11]。

6. 免疫熒光染色

當(dāng)生長(zhǎng)在爬片上的iPSC、NSC和星形膠質(zhì)細(xì)胞融合度達(dá)60%時(shí)，進(jìn)行免疫熒光染色，操作步驟如下，加入4%多聚甲醛固定15 min，用PBS清洗3遍，加入封閉破膜液（10%驢血清/0.25% Triton X-100溶液1∶9）后于室溫中靜置1 h。吸走封閉破膜液，加入一抗，在4℃中孵育過夜（> 22 h）。吸走一抗，用PBS清洗3遍，避光中加入相應(yīng)的二抗，避光孵育1 h。吸走二抗，用PBS洗滌2遍后加入DAPI溶液，避光靜置15 min，用PBS洗滌3遍后滴加抗熒光淬滅劑，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

7. 逆轉(zhuǎn)錄PCT（RT-PCR）檢測(cè)iPSC多能干性的表達(dá)及重編程因子的清除

iPSC傳代9次后，使用Trizol提取總RNA，按照Prime ScriptTM RT Master Mix的說明逆轉(zhuǎn)錄cDNA，PCR循環(huán)參數(shù)為： 95℃預(yù)變性2 min;95℃，30 s，35個(gè)循環(huán);60℃，30 s;72℃，30 s;72℃，8 min。PCR結(jié)束后，取10 μl擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳時(shí)間30 min。

8. 實(shí)時(shí)熒光定量PCT（qRT-PCR）檢測(cè)NSC和星形膠質(zhì)細(xì)胞各基因的表達(dá)

使用SYBR Premix EX Taq 試劑盒進(jìn)行qRT-PCR，擴(kuò)增神經(jīng)干細(xì)胞相關(guān)基因PAX6、Nestin、SOX2及星形膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因S100β、GFAP。GAPDH 作為內(nèi)參照。引物序列見表1。

9. 體內(nèi)畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)

收集CC2L-iPSC，加入mTeSR1溶液制成細(xì)胞懸液，與等量50X Matrigel混合后，分別注射到9只6周齡免疫缺陷的NOD-SCID小鼠（購(gòu)于中山大學(xué)中山眼科中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）中，每只小鼠注射雙后肢及后背共3個(gè)位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)注射200 μl細(xì)胞懸液（含1.5×106 iPSC）。每3日觀察并記錄小鼠情況直至畸胎瘤形成。處死小鼠并切除畸胎瘤組織，把畸胎瘤用甲醛固定、石蠟包埋后切片，并用HE染色，最后在顯微鏡下觀察不同類型組織結(jié)構(gòu)并拍照。

結(jié)果

一、CLCN2患者尿液細(xì)胞重編程為iPSC

收集CLCN2突變患者約500 ml清潔中段尿，離心后得到的尿液細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)增后在光鏡下呈正常的細(xì)胞形態(tài)，主要有2種細(xì)胞類型，1型細(xì)胞較小，呈紡錘狀，大小基本一致，數(shù)量較多;2型細(xì)胞較大，呈均質(zhì)圓形，數(shù)量較少且繁殖能力較低（圖1B-a、b）。

通過非整合重編程的方法（圖1A），把攜帶OCT4、SOX2、KLF4、SV40LT轉(zhuǎn)錄因子的ORIP/EBNA1附著體和miR-302-367 cluster經(jīng)電轉(zhuǎn)染導(dǎo)入尿液細(xì)胞，9 d后，鏡下可見部分尿液細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變，呈不規(guī)則扁平狀聚集（圖1B-d）。18 d后得到高核質(zhì)比、輪廓清晰、中心緊湊的iPSC克隆（圖1B-f）。把目標(biāo)克隆挑取再培養(yǎng)15 d后可得到細(xì)胞形態(tài)均一、高核質(zhì)比的iPSC克?。▓D1C），這些克隆可進(jìn)行穩(wěn)定傳代，核型鑒定結(jié)果正常（圖1D）。本研究最終共獲取5個(gè)iPSC克隆，并對(duì)其中3個(gè)克?。–4、C12、C13）進(jìn)行了充分的驗(yàn)證。

二、CC2L-iPSC表達(dá)多能性標(biāo)記，不含外源因子及整合基因，在體內(nèi)可形成畸胎瘤

在至少傳代12次后，對(duì)CC2L-iPSC進(jìn)行RT- PCR，結(jié)果表明所有外源重編程因子（OCT4、SOX2、KLF4、SVL40T和miR-302-367）和游離質(zhì)粒DNA（ORIP和EBNA-1）均呈陰性（圖2A）。CC2L-iPSC克隆均表達(dá)包括OCT4、SOX2、NANOG、GDF3和DNMT3B在內(nèi)的干細(xì)胞多能性基因（圖2B）。免疫熒光染色還證實(shí)，已建立的CC2L-iPSC表達(dá)典型的多能性蛋白標(biāo)記物SSEA4、NANOG、OCT4和TRA-1-60（圖2C）。把CC2L-iPSC注射到小鼠體內(nèi)8周后，可得到畸胎瘤，經(jīng)HE染色可見三胚層結(jié)構(gòu)，分別是包括內(nèi)胚層的腸上皮、中胚層的軟骨、外胚層的神經(jīng)組織（圖2D）。

三、 CC2L-iPSC包含純合的CLCN2突變

與NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)中的CLCN2基因序列對(duì)比（圖3A），Sanger測(cè)序證實(shí)CC2L-iPSC包含純合突變c.2257C> T（p.Arg753Ter）（圖3B），與患者血液的Sanger測(cè)序結(jié)果一致?；谝汛_認(rèn)的氯離子通道1（ClC-1）結(jié)構(gòu)，本研究通過SWISS-MODEL對(duì)ClC-2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)模型表明ClC-2為同源二聚體，c.2257C > T突變導(dǎo)致蛋白C端截短（圖3C）。

四、CC2L-iPSC能夠向神經(jīng)方向分化，形成星形膠質(zhì)細(xì)胞

加入神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，iPSC無需通過形成神經(jīng)花環(huán)即可直接分化為NSC（圖4A）。在誘導(dǎo)分化過程中，細(xì)胞呈單層扁平狀集落樣增殖，且體積略變小，呈均一圓球狀，細(xì)胞透亮度增加（圖4B-a）。消化后重新接種的NSC呈鏈狀分布（圖4B-b），單個(gè)細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多邊形，細(xì)胞體積增大（圖4B-c）。加入星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基后，單個(gè)細(xì)胞進(jìn)一步呈不規(guī)則多角形，細(xì)胞體積進(jìn)一步增大，胞質(zhì)淡染（圖4B-d）;隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞胞質(zhì)逐漸明顯、邊界逐漸銳利清晰（圖4B-e ～ f）我們以健康人尿源iPSC系UE017進(jìn)行同樣誘導(dǎo)分化操作，把所得到的NSC和星形膠質(zhì)細(xì)胞作為對(duì)照組，與CC2L-iPSC C4和C12 2個(gè)細(xì)胞系的分化所得細(xì)胞進(jìn)行qRT-PCR，結(jié)果表明所得到的NSC（P2代）表達(dá)PAX6、SOX2和NESTIN神經(jīng)干細(xì)胞相關(guān)基因;所得到的星形膠質(zhì)細(xì)胞（25 d）表達(dá)GFAP和S100β，且它們的表達(dá)量均與健康對(duì)照組相近（圖4C）。對(duì)P2代NSC進(jìn)行免疫熒光染色，可見Nestin和PAX6均呈陽性（圖4D）;25 d的星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示其表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞特異性分子標(biāo)志GFAP、S100β和VIMENTIN（圖4E）。

討論

ClC-2在人體中廣泛表達(dá)，研究表明CLCN2基因突變與生殖系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等均有關(guān)，但是，其具體機(jī)制尚不清楚[8-12]。由于iPSC能夠自我更新并分化為人體中絕大多數(shù)類型的細(xì)胞和組織，因此其已成為研究發(fā)育和疾病（尤其是遺傳性疾?。┑闹匾牧?。本課題組采用無創(chuàng)且非整合的方法首次成功構(gòu)建CLCN2突變患者特異性iPSC，并對(duì)其進(jìn)行充分的驗(yàn)證，確認(rèn)它們來源于CLCN2突變患者尿液細(xì)胞，具有正常的核型，并證實(shí)其具有典型的iPSC特征，包括表達(dá)多能性基因和多潛能分化能力等。這些包含CLCN2遺傳背景的iPSC可以作為體外細(xì)胞模型用于進(jìn)一步的研究，以揭示ClC-2功能障礙對(duì)各個(gè)器官、系統(tǒng)的影響。

CC2L是一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病，是由于CLCN2基因突變致ClC-2氯化物通道蛋白功能異常引起的，其與大腦中水電解質(zhì)平衡有關(guān)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，ClC-2主要分布在少突膠質(zhì)細(xì)胞周圍的縫隙連接處以及血管周圍基底的星形膠質(zhì)細(xì)胞末端。有學(xué)者認(rèn)為，ClC-2在神經(jīng)活動(dòng)后會(huì)通過星形膠質(zhì)細(xì)胞合胞體重吸收Cl-以維持神經(jīng)元的興奮性[13]。CLCN2的突變可能影響ClC-2通道對(duì)Cl-的通透性而導(dǎo)致其重吸收功能障礙，這可能解釋了CC2L的發(fā)病機(jī)制[11]。另一項(xiàng)基于果蠅的研究表明，ClC-2通道在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起著重要作用，因?yàn)樗鼈儏⑴c控制神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)元的發(fā)育形成以及兩者的連接，這也可能與CC2L有關(guān)[14]。然而，CLCN2基因突變疾病的確切分子機(jī)制仍然有待進(jìn)一步闡明。雖然CLCN2基因敲除（K/O）小鼠模型已被成功構(gòu)建，但這些小鼠并不能真實(shí)反映CC2L的遺傳背景。本研究預(yù)測(cè)突變后的ClC-2的三級(jí)結(jié)構(gòu)僅顯示其C端截短了，表明它可能保留部分功能，正如一些研究者指出，在CC2L患者中ClC-2的功能并不完全丟失，相反，K/O小鼠中的ClC-2功能明顯受損。因此，構(gòu)建一個(gè)能更真實(shí)反映CC2L的疾病模型非常必要。本課題組和其他研究者的研究表明，人類iPSC可以成功地分化為神經(jīng)細(xì)胞和組織，包括大腦和3D視網(wǎng)膜等，這些研究可為建立合適的CC2L疾病特異性細(xì)胞模型提供基礎(chǔ)，以進(jìn)一步探究其發(fā)病機(jī)制及進(jìn)行藥物篩查。此外，這些患者的iPSC還可在通過基因編輯技術(shù)進(jìn)行突變校正后為細(xì)胞治療提供細(xì)胞來源。

皮膚成纖維細(xì)胞和血液細(xì)胞、肝細(xì)胞、羊水細(xì)胞等已被廣泛用作構(gòu)建iPSC的親代細(xì)胞，但它們是通過侵襲性方式采集獲得的[2]。相比之下，本研究通過無創(chuàng)尿液收集的方式獲得的細(xì)胞來源，取材方便，更易被患者接受。同時(shí)，有研究表明尿路上皮細(xì)胞較皮膚成纖維上皮更具有上皮的特性，其重編程效率比血液細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞更為高效[6]。此外，整合基因組的病毒感染方法會(huì)使外源基因隨機(jī)但永久地整合到宿主基因組中而帶來潛在的風(fēng)險(xiǎn)，如產(chǎn)生插入突變、影響分化潛能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生等。相比之下，本研究采用非整合方法，pEP4-E02S-ET2K質(zhì)粒含有的ORIP/EBNA1元件可以使其攜帶的OCT4、SOX2、KLF4和SV40LT以游離體的形式穩(wěn)定存在，并有利于游離基因組的核轉(zhuǎn)移。pEP4-E02S-ET2K質(zhì)粒的復(fù)制周期與供體細(xì)胞基本相同，因此在重編程過程中，隨著細(xì)胞的增殖，其能不斷表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子。當(dāng)iPSC形成后，因?yàn)閕PSC的增殖速度較供體細(xì)胞和質(zhì)粒更快，質(zhì)粒因復(fù)制不同步便會(huì)隨著iPSC的增殖而逐漸丟失，得到的iPSC細(xì)胞一般在經(jīng)過5 ～ 10代的培養(yǎng)后就沒有附加載體質(zhì)粒的存在了，此方法較之傳統(tǒng)的整合方法更為安全且更適用于臨床。

為了驗(yàn)證此白質(zhì)腦病患者來源的iPSC能否進(jìn)行神經(jīng)分化，我們采用成熟的單層貼壁神經(jīng)定向誘導(dǎo)分化方案，把其向神經(jīng)方向定向誘導(dǎo)分化。結(jié)果表明本研究所構(gòu)建的CC2L-iPSC可以正常分化為神經(jīng)干細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，初步的分化結(jié)果顯示其各項(xiàng)細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)與正常細(xì)胞大體相當(dāng)，這表明CC2L-iPSC可被用于構(gòu)建白質(zhì)腦病的體外細(xì)胞模型。綜上所述，本課題組建立了一個(gè)將尿液細(xì)胞通過非整合的方法誘導(dǎo)為iPSC的方案，有望被用于CLCN2基因突變的致病機(jī)制和治療等研究。然而，在目前已報(bào)道的CC2L病例中，存在不同的CLCN2基因突變類型，本課題組僅構(gòu)建了攜帶其中一種突變類型的iPSC細(xì)胞系，也只是初步鑒定了所獲得的CC2L患者來源細(xì)胞的iPSC重編程及星形膠質(zhì)細(xì)胞分化能力，沒有對(duì)重編程效率以及CC2L發(fā)病機(jī)制進(jìn)行探討。接下來我們希望能發(fā)掘更多CC2L病例，或通過基因編輯技術(shù)等構(gòu)建不同突變類型的iPSC，擴(kuò)大樣本量，建立CC2L患者特異性的iPSC細(xì)胞庫(kù)，為今后深入研究CC2L發(fā)病機(jī)制及治療方法提供便利。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Depienne C， Bugiani M， Dupuits C， Galanaud D， Touitou V， Postma N， van Berkel C， Polder E， Tollard E， Darios F， Brice A， de Die-Smulders CE， Vles JS， Vanderver A， Uziel G， Yalcinkaya C， Frints SG， Kalscheuer VM， Klooster J， Kamermans M， Abbink TE， Wolf NI， Sedel F， van der Knaap MS. Brain white matter oedema due to ClC-2 chloride channel deficiency： an observational analytical study. Lancet Neurol，2013，12（7）：659-668.

[2] Takahashi K， Tanabe K， Ohnuki M， Narita M， Ichisaka T， Tomoda K， Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell，2007，131（5）：861-872.

[3] 邢紅艷，張藝哲，王美婷，趙琪，汪溪潔. 人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞在疾病模型和藥物篩選中的應(yīng)用. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2019，50（8）：834-841.

[4] Ortu?o-Costela MDC， Cerrada V， García-López M， Gallardo ME. The challenge of bringing iPSCs to the patient. Int J Mol Sci，2019，20（24）：6305.

[5] Guo Z， Lu T， Peng L， Cheng H， Peng F， Li J， Lu Z， Chen S， Qiu W. CLCN2-related leukoencephalopathy： a case report and review of the literature. BMC Neurology，2019，19（1）：156.

[6] Zhou T， Benda C， Dunzinger S， Huang Y， Ho JC， Yang J， Wang Y， Zhang Y， Zhuang Q， Li Y， Bao X， Tse HF， Grillari J， Grillari-Voglauer R， Pei D， Esteban MA. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc，2012，7（12）：2080-2089.

[7] Yan Y， Shin S， Jha BS， Liu Q， Sheng J， Li F， Zhan M， Davis J， Bharti K， Zeng X， Rao M， Malik N， Vemuri MC. Efficient and rapid derivation of primitive neural stem cells and generation of brain subtype neurons from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med，2013，2（11）：862-870.

[8] Brennan SC， Wilkinson WJ， Tseng HE， Finney B， Monk B， Dibble H， Quilliam S， Warburton D， Galietta LJ， Kemp PJ， Riccardi D. The extracellular calcium-sensing receptor regulates human fetal lung development via CFTR. Sci Rep，2016，6：21975.

[9] Dutta RK， Arnesen T， Heie A， Walz M， Alesina P， S?derkvist P， Gimm O. A somatic mutation in CLCN2 identified in a sporadic aldosterone-producing adenoma. Eur J Endocrinol，2019，181（5）：K37-K41.

[10] Henry KR， Lee S， Walker D， Zeitlin PL. Direct interactions between ENaC gamma subunit and ClCN2 in cystic fibrosis epithelial cells. Physiol Rep，2015，3（1）：e12264.

[11] Xie H， Su W， Pei J， Zhang Y， Gao K， Li J， Ma X， Zhang Y， Wu X， Jiang Y. De novo SCN1A， SCN8A， and CLCN2 mutations in childhood absence epilepsy. Epilepsy Res，2019，154：55-61.

[12] Fernández MV， Budde J， Del-Aguila JL， Iba?ez L， Deming Y， Harari O， Norton J， Morris JC， Goate AM; NIA-LOAD family study group; NCRAD， Cruchaga C. Evaluation of gene-based family-based methods to detect novel genes associated with familial late onset alzheimer disease. Front Neurosci，2018，12：209.

[13] Bellot-Saez A， Kékesi O， Morley JW， Buskila Y. Astrocytic modulation of neuronal excitability through K（+） spatial buffering. Neurosci Biobehav Rev，2017，77：87-97.

[14] Hou X， Zhang R， Wang J， Li Y， Li F， Zhang Y， Zheng X， Shen Y， Wang Y， Zhou L. CLC-2 is a positive modulator of oligodendrocyte precursor cell differentiation and myelination. Mol Med Rep，2018，17（3）：4515-4523.

（收稿日期：2020-02-16）

（本文編輯：洪悅民）