袁青?楊小安?蘭天云?鄒勇

【摘要】目的 探討HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭（HBV-ACLF）患者肝組織自然殺傷細(xì)胞天然細(xì)胞毒性受體NKp30特異性配體B7同源物6（B7-H6）的表達(dá)水平與肝損傷的相關(guān)性。方法 收集HBV-ACLF患者肝移植術(shù)中切除的肝組織（HBV-ACLF組）及CHB患者（CHB組）肝穿刺標(biāo)本各18例，并以5例來源于肝臟血管瘤切除標(biāo)本旁的正常肝組織為正常對(duì)照組。利用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)3組肝組織中B7-H6的表達(dá)水平。分析肝組織B7-H6表達(dá)水平及與肝損傷程度（總膽紅素水平）的相關(guān)性。結(jié)果 B7-H6主要表達(dá)在肝細(xì)胞，而且多在肝小炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈區(qū)域內(nèi)。定量分析顯示，HBV-ACLF組肝組織B7-H6表達(dá)的平均相對(duì)密度（127.02±40.25）高于輕度CHB組（22.08±10.82）和正常對(duì)照組（14.26±5.67）（P均< 0.05），輕度CHB組與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。HBV-ACLF患者肝臟B7-H6水平與血清總膽紅素水平呈正相關(guān)（rs = 0.604，P < 0.05）。結(jié)論 肝臟B7-H6高表達(dá)可能是NKp30/B7-H6被激活導(dǎo)致HBV-ACLF免疫性肝損傷加劇，肝細(xì)胞大量凋亡和壞死的重要因素。

【關(guān)鍵詞】乙型肝炎病毒;肝衰竭;自然殺傷細(xì)胞;B7同源物6

Correlation between the expression level of hepatic B7-H6 and liver injury in HBV-ACLF patients

Yuan Qing， Yang Xiaoan， Lan Tianyun， Zou Yong. Department of Blood Transfusion， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Zou Yong， E-mail： zouyong0205@ 163. com

【Abstract】Objective To investigate the correlation between the expression level of hepatic B7 homologue 6 （B7-H6） and liver injury in patients with hepatitis B virus-related acute-on-chronic liver failure （HBV-ACLF）. Method Needle biopsy liver tissues and resected liver tissue samples during liver transplantation were obtained from patients with mild chronic hepatitis B （CHB） and HBV-ACLF patients， respectively. Normal liver tissues from 5 cases of hemangioma were utilized as normal controls. The expression levels of hepatic B7-H6 were quantitatively measured by immunohistochemical staining. The correlation between the expression of B7-H6 and the degree of liver injury （total bilirubin level） was analyzed. Results B7-H6 was mainly expressed in liver cells， especially in the area with intense hepatic inflammatory responses. Quantitative analysis demonstrated that the average relative density of B7-H6 expression in the HBV-ACLF group was （127.02±40.25）/lpf， significantly higher compared with （22.08±10.82）/lpf and （14.26±5.67）/lpf in the mild CHB and normal control groups （both P < 0.05）. No statistical significance was noted between the mild CHB and normal control groups （P > 0.05）. In the HBV-ACLF patients， the B7-H6 expression level was positively correlated with the serum total bilirubin level （rs = 0.604， P < 0.05）. Conclusion High expression of hepatic B7-H6 is probably a critical factor leading to aggravation of immunity-mediated liver injury induced by NKp30/B7-H6 activation， the apoptosis and necrosis of a large quantity of liver cells in HBV-ACLF patients.

【Key words】Hepatitis B virus;Liver failure;Natural killer cell;B7 homologue 6

HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭（HBV-ACLF）是終末期肝病的常見模式，在慢性乙型肝炎（CHB）或HBV相關(guān)性肝硬化患者中經(jīng)常發(fā)生。HBV-ACLF是在CHB基礎(chǔ)上出現(xiàn)的急性或亞急性肝功能失代償， 臨床表現(xiàn)為黃疸和凝血障礙、失代償性腹水、 伴或不伴有肝性腦病[1-2]。其病情嚴(yán)重且發(fā)展迅速，病死率可高達(dá)45% ～ 90%，目前以肝移植為主要治療手段，但是絕大部分患者預(yù)后不良。目前認(rèn)為，HBV-ACLF的發(fā)病是病毒和宿主雙方共同作用的結(jié)果，其中細(xì)胞免疫介導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷在HBV-ACLF的發(fā)病中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。因此，深入研究HBV-ACLF細(xì)胞介導(dǎo)的肝損傷機(jī)制對(duì)降低肝衰竭患者的病死率及改善預(yù)后有著重要意義。筆者前期在HBV-ACLF的研究已經(jīng)證實(shí)，NK細(xì)胞在HBV-ACLF患者肝臟大量募集，外周血NK細(xì)胞表面天然細(xì)胞毒性受體（NCR）NKp30和NKp46表達(dá)增強(qiáng)，肝臟NK細(xì)胞pKP30的表達(dá)亦增強(qiáng)，提示HBV-ACLF肝細(xì)胞的大量壞死與肝臟NK細(xì)胞的過度激活以及NCR的應(yīng)激表達(dá)密切相關(guān)[3]。本研究通過檢測(cè)HBV-ACLF患者肝組織NKp30特異性配體B7同源物6（B7-H6）的表達(dá)水平，探討B(tài)7-H6的應(yīng)激表達(dá)與肝細(xì)胞損傷的相關(guān)性，為闡明HBV-ACLF的發(fā)病機(jī)制及尋找新的分子靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、標(biāo)本來源及分組

收集2013年1月至2015年6月在我院肝移植手術(shù)切除的HBV-ACLF肝組織標(biāo)本及行肝穿刺活組織檢查（活檢）確認(rèn)為輕度慢性乙型肝炎（CHB）的肝組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：HBV-ACLF患者須符合《肝衰竭診治指南（2012年版）》的HBV-ACLF診斷標(biāo)準(zhǔn)，CHB患者須符合《慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）》相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除合并其他肝炎病毒或HIV、酒精性肝炎、藥物性肝病、脂肪性肝病、自身免疫性疾病者。共收集了18例輕度CHB肝組織（輕度CHB組）、18例HBV-ACLF肝組織（HBV-ACLF組），并以5例來源于肝臟血管瘤切除標(biāo)本旁的正常肝組織為正常對(duì)照組。本研究方案已獲得中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，患者均已簽署知情同意書。

二、主要儀器與試劑

使用日本日立7170A型全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)。主要試劑包括兔抗人B7-H6多克隆抗體（Abcam，美國(guó)）、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗兔二抗（Kyoto，日本）、二氨基聯(lián)苯氨（DAB）工作液（Kyoto，日本）。

三、研究方法

1. 臨床資料的收集

記錄標(biāo)本來源患者的性別、年齡，肝穿刺或肝移植手術(shù)前各項(xiàng)生化指標(biāo)如ALT、AST、總膽紅素、凝血酶原時(shí)間、凝血酶原活動(dòng)度和HBV DNA水平等。

2. 免疫組織化學(xué)染色（免疫組化）

將5 μm石蠟切片脫蠟至水后用pH 6.0的0.01 mmo/L枸櫞酸鈉緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)。用0.03%過氧化氫/硝酸鈉處理阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，10%正常兔血清室溫覆蓋組織30 min以阻止非特異性染色。滴加50 μl （1∶50） 兔抗人B7-H6多克隆抗體于切片上，37℃濕盒孵育1 h。Tris-HCl緩沖液沖洗后，加入50 ～ 100 μl HRP標(biāo)記羊抗兔二抗孵育30 min，再加入DAB工作液，鏡下觀察顯色情況，蒸餾水沖洗終止顯色。利用Image-Pro Plus 7.0對(duì)肝臟B7-H6表達(dá)進(jìn)行半定量分析。每張免疫組化切片隨機(jī)選取6個(gè)200倍視野，以每個(gè)視野陽(yáng)性區(qū)域的光密度總和除以陽(yáng)性區(qū)域的面積總和得出表達(dá)的平均相對(duì)密度值。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）表示;正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用例（%）或相對(duì)比表示。肝組織B7-H6與血清總膽紅素、ALT、AST及HBV DNA的關(guān)系采用Spearman秩相關(guān)分析。P < 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、輕度CHB組、HBV-ACLF組和正常對(duì)照組的一般資料

3組標(biāo)本來源患者的一般資料見表1。

二、輕度CHB組、HBV-ACLF組和正常對(duì)照組肝組織B7-H6的表達(dá)比較

B7-H6主要表達(dá)在肝細(xì)胞，而且多在肝小炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈區(qū)域內(nèi)。定量分析顯示，3組肝組織B7-H6表達(dá)的平均相對(duì)密度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 73.731，P < 0.001）。HBV-ACLF組肝組織B7-H6表達(dá)的平均相對(duì)密度（127.02±40.25）高于輕度CHB組（22.08±10.82）和正常對(duì)照組（14.26±5.67）（P均< 0.05），輕度CHB組與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），見圖1。

三、肝組織B7-H6的表達(dá)水平與肝損傷的相關(guān)性分析

HBV-ACLF患者肝組織B7-H6表達(dá)水平與血清總膽紅素水平呈正相關(guān)（rs = 0.604，P = 0.008），B7-H6的表達(dá)水平與血清ALT、AST及HBV DNA水平均無關(guān)（P均> 0.05）。

討論

NCR包括NKp30、NKp44、NKp46，是近年發(fā)現(xiàn)的一類非MHV限制的特異性啟動(dòng)NK細(xì)胞活化的新穎活化受體。NCR在NK細(xì)胞殺傷包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤、黑色素瘤、白血病等多種腫瘤細(xì)胞以及流感病毒、副流感病毒、EB病毒等多種病毒感染細(xì)胞中發(fā)揮著關(guān)鍵作用?，F(xiàn)有研究表明，NCR在抗HBV及 HCV感染、肝癌中發(fā)揮著重要作用。在慢性HCV感染中，NK細(xì)胞表面NCR NKp46和NKp30表達(dá)下調(diào)，這可能是NK細(xì)胞效應(yīng)功能被抑制，病毒持續(xù)感染的重要機(jī)制[4]。聚乙二醇干擾素α-2b治療CHB，對(duì)IFN產(chǎn)生應(yīng)答的CHB患者NK細(xì)胞NKp30的表達(dá)增強(qiáng)，其與HBV載量降低有關(guān)，研究表明NKp30在NK細(xì)胞抗HBV感染中發(fā)揮著重要作用[5-6]。一項(xiàng)最新的研究表明，肝癌患者腫瘤浸潤(rùn)NK細(xì)胞NKp30的表達(dá)及其配體B7-H6在肝癌組織的表達(dá)與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]。

NCR需要與腫瘤細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞上特異性配體識(shí)別后才能發(fā)揮效應(yīng)功能，然而尋找NCR配體的研究進(jìn)展緩慢，直至2009年，美國(guó)Levin等才證實(shí)，B7家族免疫受體成員B7-H6是NK細(xì)胞活化受體NKp30的配體。B7-H6在正常人體組織中不表達(dá)，但在一些腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[8]。近年進(jìn)一步的研究表明，B7-H6或可溶性B7-H6在某些體外或體內(nèi)炎癥條件下可被誘導(dǎo)表達(dá)[9]。為探討在HBV-ACLF高度炎癥狀態(tài)下肝臟B7-H6能否被應(yīng)激誘導(dǎo)以及NKp30/B7-H6信號(hào)通路在HBV-ACLF免疫介導(dǎo)肝細(xì)胞損傷中的作用，本研究收集HBV-ACLF患者肝移植手術(shù)切除的肝組織及CHB患者肝穿刺標(biāo)本并通過免疫組化對(duì)肝組織B7-H6的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)和比較。結(jié)果顯示，與CHB患者相比，HBV-ACLF患者肝組織B7-H6表達(dá)上調(diào)，而且與肝細(xì)胞損傷程度（總膽紅素水平）呈正相關(guān)，表明NKp30/B7-H6相互作用在活化NK細(xì)胞介導(dǎo)肝細(xì)胞損傷中可能發(fā)揮著重要作用。

綜上所述，B7-H6在HBV-ACLF患者肝組織中表達(dá)上調(diào)，其應(yīng)激表達(dá)與HBV-ACLF患者肝細(xì)胞損傷的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，這將為深入研究HBV-ACLF肝損傷機(jī)制提供新的分子靶點(diǎn)和思路。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2020-04-21）

（本文編輯：林燕薇）