黃治國，殷 維，晏 毅

（中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊九二零醫(yī)院麻醉科，云南昆明 650118）

腦缺血再灌注后產(chǎn)生的損傷包括自由基的產(chǎn)生、氧化應(yīng)激作用、興奮性氨基酸毒性作用及神經(jīng)元內(nèi)鈣超載，促使大量神經(jīng)遞質(zhì)釋放，最終導(dǎo)致神經(jīng)細胞凋亡的發(fā)生[1]。異氟烷是應(yīng)用于臨床最廣泛的吸入麻醉藥之一，經(jīng)過多年的臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)它具有降低顱內(nèi)壓、減少腦內(nèi)氧耗、誘導(dǎo)與維持平衡、蘇醒快、副作用少等特點。有關(guān)吸入麻醉藥對缺血神經(jīng)元保護作用的機制，盡管已經(jīng)提出了許多假說[2-3]，但其較深層次的作用機制迄今為止仍不很清楚。本文通過構(gòu)建腦缺血再灌注大鼠模型，觀察吸入不同濃度異氟烷（isoflurane,IF） 對大鼠神經(jīng)功能的改變及其對缺血神經(jīng)元c-fos，Bax 表達的影響，為進一步明確異氟烷的神經(jīng)保護作用以及相應(yīng)的作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1 實驗動物

SPF 級雄性Wistar 大鼠，32 只，體重（200±20） g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCK（京） 2016-0006。12 h 循環(huán)光照，室溫20℃～25℃，自由飲水和攝食。

1.2 主要試劑和儀器

大鼠c-fos、Bax、β-actin 引物合成（上海生工生物工程有限公司）；c-Fos，Bax 抗體（CST，Danvers，MA，USA）；β-actin 抗體及相應(yīng)二抗（Santa Cruz，USA）；RIPA 裂解液，Trizol 提取試劑，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas）；異氟烷（瑞沃德生命科技有限公司）；SOD，MDA 檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；儀器：腦立體定位儀B3E03-004（瑞沃德生命科技有限公司），電凝止血器（上海亮直醫(yī)療器械有限公司），微型電鉆P-500-3（施力特），動脈夾（北京冀諾泰科技發(fā)展有限公司）；多功能酶標(biāo)儀（Thermo），超低溫冰箱（Thermo），低溫高速離心機（Beckman）；自制呼吸箱；恒溫水浴箱（美國scilogex）；熒光定量PCR 儀（ABI StepOne），低溫離心機（HITACH：CF-16RX）；大鼠線栓（廣州佳靈）。

1.3 動物分組及缺血模型制備

大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉（來自昆明醫(yī)科大學(xué)動物學(xué)部，35 mg/kg） 腹腔注射麻醉，體溫由直腸探頭監(jiān)視，將大鼠放在可控溫電熱毯上面，體溫維持在（37.0±1.0） ℃，在體式顯微鏡下，取頸旁正中切口，分離頸前筋膜與肌肉組織，在甲狀軟骨上緣分離出左側(cè)ECA、ICA，絲線結(jié)扎ECA，將ECA 剪斷，微型血管夾暫時夾閉CCA 近分叉處和ICA 遠端，于ECA 殘端用顯微剪制備適當(dāng)?shù)男】冢褂么笫髮Ｓ盟ň€進入該切口，當(dāng)線栓準確進入ICA后再將ECA 的松結(jié)結(jié)扎，最后將ICA 遠處留置的動脈夾打開，線栓插入距離ICA 和ECA 分叉處8～9 mm，感到阻力后即停止插入線栓，使線栓完全固定，將動脈夾取下，構(gòu)建MCA 阻塞，MCAO梗阻2 h 后，拔除線栓，恢復(fù)血供，形成缺血再灌注損傷，徹底清洗并縫合手術(shù)切口。置飼養(yǎng)籠中觀察。動物隨機分為四組：假手術(shù)組（Sham），缺血組（IR），IR+IF（1.5%） 組，IR+IF（2.0%） 組。假手術(shù)組只手術(shù)暴露，不插入線栓以及MCA 栓塞，術(shù)后4 h 取材。吸入麻醉藥組在制成腦缺血再灌注模型后，置于呼吸箱內(nèi)，于缺血期間分別持續(xù)吸入最低肺泡有效濃度1.5%，2.0%的異氟烷。每組8 只大鼠，其中4 只取材后進行腦組織含水量測定，另外4 只，新鮮取材各大鼠右側(cè)海馬組織，分為3 份，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 神經(jīng)功能行為缺陷評分

再灌注4 h 后對大鼠進行神經(jīng)損害嚴重程度評分（neurological severity score，NSS）[4]，NSS 包含了運動、感覺、反射及平衡實驗，最低0 分，最高18 分。0 分為神經(jīng)功能正常；1～6 分為輕度損害；7～12 分為中度損害；13～18 分為神經(jīng)功能重度損害。

1.5 大鼠腦組織含水量測定

神經(jīng)功能行為缺陷評分后，各組大鼠均用戊巴比妥鈉（35 mg/kg 腹腔注射） 麻醉后，斷頭取腦，迅速切取右側(cè)大腦半球，濾紙吸干其表面血漬，電子天平精確稱重后，置于120℃恒溫干燥箱內(nèi)烘烤48 h 至恒重，再精確稱重，采用干濕重法測定腦組織含水量，以百分率表示。計算公式為：腦組織含水量=（濕腦重量-干腦重量）/濕腦重量×100%。

1.6 腦組織中SOD，MDA 含量檢測

-80℃冰箱取出1 份海馬組織加入4℃生理鹽水制備組織勻漿，離心取上清液，分為兩份，按試劑盒說明書檢測SOD，MDA 含量。

1.7 實時定量RT-PCR

-80℃取出第2 份海馬組織進行總RNA 提取，參照Trizol 試劑盒說明書進行。每個樣本取1 μg總RNA 作為逆轉(zhuǎn)錄模板合成cDNA。所用引物見。PCR 反應(yīng)條件：94℃2 min；94℃20 s、60℃30 s、72℃30 s，共40 個循環(huán)；產(chǎn)物經(jīng)溶解曲線單峰驗證，記錄每個反應(yīng)管中的熒光信號達到所設(shè)定值時所需的循環(huán)數(shù)（Ct 值），△△Ct=（Ct目的基因-Ctβ-actin） 治療組-（Ct目的基因-Ctβ-actin） 對照組，數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法分析，計算目的基因與內(nèi)參β-actin 比值作為目的基因的相對表達量，見表1。

表1 實時定量PCR 檢測所用引物序列Tab.1 Primer sequence list for quantitative real-time PCR

1.8 Western blot 檢測蛋白表達

-80℃取出剩余的1 份海馬組織，加入RIPA裂解液制備樣本總蛋白，加入4 倍體積的上樣緩沖液，沸水中變性3 min，離心后收集上清液，上樣，電泳分離后，200 V、400 mA 轉(zhuǎn)膜2.5 h，封閉、洗膜后，加入用TBST 稀釋的一抗（β-actin，1:200；c-Fos，1:1 000；Bax，1:1 000），4℃冰箱搖晃孵育過夜。再用TBST 溶液洗膜3 次，每次10 min，加入HRP 標(biāo)記的二抗，室溫下?lián)u晃孵育2～4 h，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下顯色。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準差（±s） 表示；假設(shè)檢驗采用單因素方差分析，兩組間差異比較使用LSD檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 異氟烷處理后腦缺血再灌注大鼠行為學(xué)變化

缺血再灌注損傷4 h 后，各組行為學(xué)評分顯示：Sham 組未觀察到任何神經(jīng)功能損傷，IR 組（15.20±1.398），IR+IF（1.5%） 組（9.40±3.273），IR+IF（2.0%） 組（3.60±2.413），兩組間評分存在差異（P＜0.05），提示異氟烷處理能促進大鼠腦缺血后神經(jīng)功能修復(fù)。

2.2 腦組織含水量

再灌注后4 h，與模型組（84.33±1.408） %相比，假手術(shù)組的（78.59±2.030） %腦組織含水量較低，說明IR 組有明顯的腦水腫，1.5%異氟烷處理組的（81.03±2.897） %的腦組織含水量有一定下降，但差異不明顯（P＞0.05）；2.0%異氟烷處理組（79.25±2.029） %的腦組織含水量下降更為顯著（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損行為學(xué)評分和腦腦組織含水量比較（±s）Tab.2 Comparison of NSS score and the water content in brain tissue among different groups（±s）

表2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損行為學(xué)評分和腦腦組織含水量比較（±s）Tab.2 Comparison of NSS score and the water content in brain tissue among different groups（±s）

與IR 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.3 異氟烷處理后腦組織中SOD，MDA 含量

與假手術(shù)組相比，模型組腦組織勻漿中SOD活性明顯降低，而MDA 含量顯著增高，經(jīng)1.5%異氟烷處理后，腦組織勻漿中SOD 酶活性較模型組有相應(yīng)改善，且MDA 含量明顯降低，2.0%異氟烷處理組較1.5%組效果有增強，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 異氟烷處理對腦缺血再灌注后SOD 和MDA 的影響Fig.1 The effects of Isoflurane posttreatment on the release of SOD and MDA following cerebral ischemia reperfusion

2.4 異氟烷處理后腦缺血再灌注大鼠腦組織中c-fos 和Bax 表達變化

qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示異氟烷對腦缺血再灌注大鼠海馬中c-fos 和Bax 的表達具有明顯的調(diào)節(jié)作用。缺血再灌注之后，c-fos 和Bax mRNA 在大鼠腦組織海馬區(qū)中表達明顯增強；與IR 模型組相比，1.5%和2.0%異氟烷均可明顯降低c-fos 和Bax的mRNA 表達量，并且組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 qRT-PCR 檢測異氟烷處理對腦缺血再灌注后后c-fos 和Bax 的影響Fig.2 The effects of Isoflurane posttreatment on the expression of c-fos and Bax following cerebral ischemia reperfusion by qRT-PCR

2.5 Western blot 結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組海馬區(qū)組織中c-fos和Bax 蛋白表達量明顯升高，經(jīng)1.5%異氟烷處理后，海馬區(qū)組織中c-fos 和Bax 蛋白表達量較模型組顯著降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；2.0%異氟烷處理組較1.5%組效果有增強，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 Western blot 檢測異氟烷處理對腦缺血再灌注后c-fos 和Bax 的影響Fig.3 The effects of Isoflurane posttreatment on the expression of c-fos and Ba following cerebral ischemia reperfusion by Western blot

3 討論

即早基因（immediate early gene，IEG） 在體內(nèi)發(fā)揮第三信使的作用，被發(fā)現(xiàn)普遍存在于中樞神經(jīng)細胞中，正常狀態(tài)下呈現(xiàn)低表達，難于檢測。但在神經(jīng)細胞接受內(nèi)源刺激后，早期快反應(yīng)基因即出現(xiàn)快速表達[6]，作用于目的基因，導(dǎo)致目的基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生改變，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞的生長、分化和損傷修復(fù)。研究腦損傷時早期快速反應(yīng)基因表達的意義在于明確他們對于繼發(fā)性病理損害過程發(fā)生與發(fā)展的影響，尤其是在神經(jīng)細胞損傷機理與抗損傷修復(fù)機制中的作用。研究已證實，中樞神經(jīng)系統(tǒng)在受到如腦缺血、癲癇發(fā)作等損害性刺激時，即早基因c-fos、c-jun 出現(xiàn)異常高表達。藥物誘發(fā)癲癇時，腦不同部位出現(xiàn)c-fos、c-jun mRNA 及其蛋白表達，并于用藥后15 min 開始表達，1 h 后達到高峰，16 h 后恢復(fù)正常水平[7]。c-fos 作為即早基因中的研究熱點之一，參與神經(jīng)細胞生長、發(fā)育、分化、記憶和信息傳遞等生理過程。大腦在受到缺血缺氧、創(chuàng)傷性損傷等多種刺激后，可激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)（nervous system，CNS） 中c-Jun、c-Fos 基因的表達。

Bax 作為Bcl-2 家族蛋白中的第一個促進細胞凋亡的因子，其分子量大約為21 κD。Bax 通常以單體形式分布于細胞漿中，并均勻圍繞在線粒體外膜周圍[8]。Bax 可通過調(diào)節(jié)線粒體PT 孔破壞線粒體膜的完整性，改變線粒體膜的通透性，導(dǎo)致線粒體跨膜電位丟失，釋放線粒體內(nèi)的細胞色素C等促凋亡因子到細胞質(zhì)內(nèi)，進而激活Caspase 級聯(lián)反應(yīng)[9]。線粒體PT 孔的改變，導(dǎo)致線粒體內(nèi)外之間Ca2+、pH 值、電荷發(fā)生變化，影響呼吸鏈的正常進行。Bax 蛋白還可以增加Ca2+釋放，釋放的Ca2+可以直接激活Caspase 效應(yīng)分子或使線粒體對各種內(nèi)、外源性凋亡刺激因素敏感性增高，促進細胞凋亡的發(fā)生[10]。眾多研究都表明神經(jīng)細胞凋亡在腦缺血再灌注損傷過程中的的重要作用，如何減弱、抑制神經(jīng)細胞的凋亡也成為對于腦缺血再灌注損傷治療的一個重要方向[11]。

腦缺血再灌的一個早期反應(yīng)是海馬神經(jīng)元迅速表達c-fos 基因[12]。關(guān)于c-fos 表達的功能意義目前還爭議，但神經(jīng)元受損導(dǎo)致c-fos 高表達這一點是肯定的[13]。Neumann-Henfelin 等[14]表 明Ca2+是c-fos 表達增強的激發(fā)劑。缺血再灌早期細胞內(nèi)Ca2+濃度升高導(dǎo)致c-fos 的高表達。如上所述，由于異氟烷對Ca2+的內(nèi)、外流均有阻滯作用[15]，因此也表現(xiàn)出對c-fos 表達的衰減作用。

綜上所述，本研究中發(fā)現(xiàn)異氟烷對于大鼠腦缺血再灌注損傷具有一定保護作用，可以改善大鼠因腦缺血引起的神經(jīng)功能減弱、也可改善海馬區(qū)神經(jīng)細胞的凋亡、還可抑制c-fos mRNA 表達，并且在一定程度上呈現(xiàn)出劑量依賴性。異氟烷因其安全、可控性好等優(yōu)點，成為目前臨床上應(yīng)用最為廣泛的吸入氟化麻醉藥之一。近年研究發(fā)現(xiàn)，異氟烷對神經(jīng)系統(tǒng)的作用廣泛而復(fù)雜，因此積極開展異氟烷對神經(jīng)系統(tǒng)作用機制的研究對于全面認識異氟烷具有積極的作用。