陳驍勇

[摘要]目的 建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）測(cè)定夏枯草片中蘆丁含量的方法。方法 采用UPLC-MS/MS法，色譜柱為ACQUITY UPLC RBEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為甲醇-水溶液（47：52），電噴霧離子化（ESI）正離子模式下選擇質(zhì)荷比（m/z）為300.1離子進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果 所建方法能快速檢測(cè)夏枯草片中蘆丁的含量，在10.78～172.48 ng/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9993），平均加樣回收率為99.44%，方法重復(fù)性和精密度良好。結(jié)論 該方法專屬性強(qiáng)，快速靈敏，適用于夏枯草片中蘆丁的含量測(cè)定。

[關(guān)鍵詞]夏枯草片;蘆丁;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

[中圖分類號(hào)] R284.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2020）7（b）-0030-04

Content determination of rutin in Xiakucao Tablets by ultra-high performance liquid chromatography-andem mass spectrometry

CHEN Xiao-yong

Department of Pharmacy， Yancheng No.1 People′s Hospital， Jiangsu Province， Yancheng? ?224000， China

[Abstract] Objective To establish an ultra-high performance liquid chromatography-andem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method for the content determination of rutin in Xiakucao Tablets. Methods UPLC-MS/MS method was used and the chromatographic column was ACQUITY UPLC RBEH C18 column （2.1 mm×100 mm， 1.7 μm）， the mobile phase was methanol-aqueous solution （47：52）. The mass-charge ratio （m/z） of 300.1 ion was determined by using an electrospray ionization （ESI） in positive ionization mode. Results The established method was able to rapidly detect the rutin content in Xiakucao Tablets with a good linear relationship （r=0.9993） within the concentration range of 10.78-172.48 ng/ml， and the average recovery rate was 99.44%. The method had good repeatability and precision. Conclusion The method has strong specificity， rapid sensitivity and is suitable for the content determination of rutin in Xiabancao Tablets.

[Key words] Xiakucao Tablets; Rutin; Ultra-high performance liquid chromatography-andem mass spectrometry

夏枯草片具有消火、散結(jié)、消腫的功效，由中藥夏枯草加工制成，主要用于火熱內(nèi)蘊(yùn)所致的頭痛、眩暈、瘰疬、癭瘤、乳癰腫痛，臨床上常用于甲狀腺腫大、淋巴結(jié)核、乳腺增生病見上述癥候者[1-3]。其中主要有效成分為黃酮，目前所采用標(biāo)準(zhǔn)為國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBZ09492008[4]，此標(biāo)準(zhǔn)中采用蘆丁與亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色，在氫氧化鈉堿性條件下測(cè)定吸光度，并制備標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定黃酮的含量，該方法具有操作繁瑣、專屬性差、重現(xiàn)性低等缺點(diǎn)，而液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)將超高效液相色譜（UPLC）的高效快速的分離能力和質(zhì)譜的超高選擇性、超高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來，在中藥分析中具有廣泛應(yīng)用[5-6]。本文參照有關(guān)文獻(xiàn)對(duì)蘆丁的測(cè)定[7-11]，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法測(cè)定夏枯草片中蘆丁含量，并進(jìn)行系統(tǒng)研究，旨在為夏枯草片的質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料與試劑

蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-201610;含量：91.9%），購自中國食品藥品檢定研究院;去離子水使用超純水儀自制;甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純;夏枯草片樣品均為市售產(chǎn)品（規(guī)格：20 mg/片，批號(hào)：1803N08、20180309、170907、1802051、1704014）。

1.2儀器與設(shè)備

Agilent 1290 In finity Ⅱ超高效液相質(zhì)譜儀[安捷倫科技（中國）有限公司];Agilent 6470 Triple Quad LC/MS/MS串聯(lián)四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀[安捷倫科技（中國）有限公司];BP211D電子天平[賽多利斯（上海）貿(mào)易有限公司];Merck Milli-Q Advantage A10純水機(jī)[默克化工技術(shù)（上海）有限公司]。

1.3方法

1.3.1對(duì)照品溶液的制備? 精密量取蘆丁對(duì)照品10.78 mg，置100 ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1毫升含107.80 μg的溶液，搖勻，作為對(duì)照品貯備溶液。取對(duì)照品貯備液，加流動(dòng)相稀釋制成每1毫升約含50 ng的溶液，作為對(duì)照品溶液。

1.3.2供試品溶液的制備? 取同一批次的夏枯草片20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取0.5 g，置100 ml量瓶中，加流動(dòng)相適量，超聲30 min溶解，放冷至室溫，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液適量，加流動(dòng)相稀釋制成每1毫升約含蘆丁50 ng的溶液，搖勻，用0.22 μm濾膜過濾，即得供試品溶液。

1.3.3陰性對(duì)照溶液的制備? 取除夏枯草的其他原輔料，按夏枯草片處方比例，制成陰性對(duì)照樣品，按“1.3.2”制備供試品陰性對(duì)照溶液。

1.3.4色譜條件? 色譜柱：ACQUITY UPLC RBEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動(dòng)相：甲醇-水溶液（47∶52），柱溫：35℃;流速：0.2 ml/min;進(jìn)樣量：1 μl。分離度良好。

1.3.5質(zhì)譜條件? 采用電噴霧離子源（ESI），正離子掃描模式，霧化氣：45PSI，錐孔電壓是4900，干燥氣溫度：300℃。蘆丁的Fragmentor為135;蘆丁的m/z為300.1。供試品溶液、對(duì)照品溶液及陰性對(duì)照溶液的色譜圖見圖1A、B、C，蘆丁的二級(jí)全掃描質(zhì)譜圖見圖1D。

2結(jié)果

2.1線性范圍

精密量取“1.3.1”項(xiàng)的蘆丁對(duì)照品貯備液1 ml，置100 ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，分別取0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 ml置10 ml量瓶中，加流動(dòng)相分別稀釋至刻度，搖勻，濾過，分別取1 μl，按照“1.3.4”項(xiàng)的色譜條件分析，以對(duì)照品峰面積比為縱坐標(biāo)（Y），各對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=0.1746X+0.02（r=0.9993）。蘆丁在10.78～172.48 ng/ml的濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.2穩(wěn)定性試驗(yàn)

取夏枯草片樣品（批號(hào)：1803N08）1份，按“1.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫放置于進(jìn)樣室中，分別放置0、2、4、8、12 h，按“1.3.4”項(xiàng)的色譜條件、“1.3.5”項(xiàng)的質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果顯示，峰面積的RSD為0.9%（n=5），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3精密度試驗(yàn)

精密量取“1.3.1”項(xiàng)的對(duì)照品溶液，連續(xù)6次，按“1.3.4”項(xiàng)的色譜條件、“1.3.5”項(xiàng)的質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，校正因子的RSD為0.5%，表示精密度符合要求。

2.4重復(fù)性試驗(yàn)

取夏枯草片樣品（批號(hào)：1803N08）6份，按“1.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.3.4”項(xiàng)的色譜條件、“1.3.5”項(xiàng)的質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算蘆丁平均含量為59.7 mg/片，RSD=1.3%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.5加樣回收率試驗(yàn)

取夏枯草片樣品（批號(hào)：1803N08）6份（含量為59.7 mg/片），每份約含蘆丁10 mg，置100 ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度。精密量取上述溶液各1 ml置另一100 ml量瓶中，精密加“1.3.1”項(xiàng)的蘆丁對(duì)照品貯備液1 ml，加流動(dòng)相定容至刻度，依法制備供試品溶液，分別取1 μl，按“1.3.4”項(xiàng)的色譜條件、“1.3.5”項(xiàng)的質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果顯示，平均回收率為99.44%，RSD=1.87%（表1）。

2.6檢出限與定量限

以信噪比S/N為10測(cè)定定量限，計(jì)算出蘆丁的定量限為0.2 ng/ml。

2.7樣品測(cè)定

取5批不同批號(hào)的夏枯草片，按“1.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行測(cè)定2次，計(jì)算樣品中蘆丁的平均含量。結(jié)果顯示，批號(hào)1802051夏枯草片中的蘆丁平均含量最高，為82.3 mg，批號(hào)1803N08夏枯草片中的蘆丁平均含量最低，為59.7 mg（表2）。

3討論

夏枯草為唇形科夏枯草屬植物，最早載于《神家本草經(jīng)》，能解內(nèi)熱、緩肝火，治乳癰、乳巖。臨床上夏枯草片常用于治療慢性乳腺炎、甲狀腺腫大、急性黃疸型肝炎、乳腺纖維囊性病等病癥，對(duì)胰腺癌和結(jié)腸癌也有一定的抗腫瘤作用[12-15]。

夏枯草中主要活性成分為黃酮類、甾醇類、皂苷類、有機(jī)酸類等化合物。黃酮類具有廣泛的藥理活性，具有保肝、調(diào)節(jié)免疫、抗病毒殺菌等功效[16-17]。因此夏枯草通常以測(cè)定黃酮類成分來控制夏枯草的質(zhì)量，而蘆丁有典型的黃酮類結(jié)構(gòu)，在總黃酮家族中是比較典型的代表物質(zhì)，因此目前多以蘆丁作為黃酮的指標(biāo)成分[18]。

本文分別選取甲醇、稀乙醇作為流動(dòng)相，采用回流提取法和超聲處理法處理樣品，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相超聲提取30 min，能完全提取夏枯草片中有效成分，而且操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)峰形也很好。

蘆丁的常用測(cè)定方法有紫外分光光度法、高效液相色譜法，加壓毛細(xì)管電色譜法、UPLC-MS/MS法等。而UPLC-MS/MS法具有檢測(cè)限低、專屬性強(qiáng)、分析時(shí)間快、分離效果好等優(yōu)點(diǎn)，UPLC-MS/MS法以超高效液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測(cè)系統(tǒng)，近年來，UPLC-MS/MS法在中藥質(zhì)量分析中的應(yīng)用越來越廣，因此本文參照有關(guān)文獻(xiàn)對(duì)蘆丁的測(cè)定[8-10，17-18]，采用UPLC-MS/MS法檢測(cè)夏枯草片中蘆丁的含量，通過線性范圍、重復(fù)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、精密度試驗(yàn)可以得出，UPLC-MS/MS法檢測(cè)夏枯草片中蘆丁含量的線性關(guān)系良好、重復(fù)性良好、穩(wěn)定性高，同時(shí)精密度符合要求。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示，運(yùn)用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定6份夏枯草片樣品的加樣回收率高，說明采用本法的檢測(cè)限低。本研究結(jié)果還顯示，不同批號(hào)的夏枯草片，測(cè)得樣品中的蘆丁含量差異較大，說明不同批號(hào)的夏枯草片含量不等，實(shí)驗(yàn)時(shí)要注意批號(hào)一致性。

本研究實(shí)驗(yàn)操作過程中，相比于從前采用的紫外分光光度法，UPLC-MS/MS法操作更加簡(jiǎn)便。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析得出，本研究建立的UPLC-MS/MS測(cè)定夏枯草片中蘆丁含量的方法，具有專屬性強(qiáng)、靈敏度高、分析時(shí)間快、分離效果好的優(yōu)點(diǎn)。

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（收稿日期：2019-12-10）