梁 穎 ， 高鴻彬 ， 李曉丹 ， 楊松林 ， 馬 麗 ， 劉 浩 *

（1.廣東食品藥品職業(yè)學院 藥學院，廣東 廣州 510520；2.第二軍醫(yī)大學 長海醫(yī)院藥學部，上海 200433；3.廣州安諾科技股份有限公司，廣東 廣州 510863）

2016年5 月，化橘紅入選廣東嶺南中藥材第一批立法保護品種，是產(chǎn)于廣東化州的珍稀名貴特產(chǎn)，為“中國四大南藥”和“十大廣藥”之一?；偌t為蕓香科植物化州柚或柚的未成熟或近成熟的干燥外層果皮，臨床多用于治療咳嗽痰多、食積傷酒、嘔惡痞悶等癥[1-6]。在化州種植的橘紅稱為化橘紅，為道地藥材，比產(chǎn)于異地的同種藥材的質(zhì)量更好。正宗的化橘紅制作工藝復雜、成本高，其銷售價格較為昂貴。不少商家為牟取暴利而出售假冒偽劣化橘紅產(chǎn)品，因此導致化橘紅的假貨和偽品成堆出現(xiàn)。而且其外形氣味一般與真貨及其相似，以至于普通消費者難以辨別化橘紅的真假。

化橘紅主要有效成分是黃酮類化合物，其中最主要是柚皮苷和野漆樹苷，二者含量之和占化橘紅黃酮類物質(zhì)總量的84%以上。其中《中國藥典》2015年版中的關鍵指標為柚皮苷含量，許多文獻研究也已經(jīng)證明柚皮苷是化橘紅的主要有效成分之一[7-9]。化橘紅在《中國藥典》2015年版中要求柚皮苷含量不低于3.5%[7]，而《中國藥典》2005年版僅要求柚皮苷含量不低于1.5%，兩者相比足足提高了2倍多。

有關化橘紅含量測定已有文獻報道，化橘紅中柚皮苷的含量測定方法一般用紫外-可見分光光度法（UV-Vis）、高效液相色譜法（HPLC）等[9-14]。而傳統(tǒng)的檢測化橘紅中柚皮苷含量的方法雖然檢測精度高，但是操作過程復雜、費時費力、耗用大量試劑，并且還會對化橘紅的樣本造成一定的破壞性傷害，無法實現(xiàn)經(jīng)濟成本低廉的快速無損檢測。因此建立快速測定柚皮苷的含量方法，是非常有必要的。針對現(xiàn)有技術缺點，本文采用近紅外光譜法進行了系統(tǒng)的化橘紅快速鑒別和含量測定研究。近紅外光譜法具有信息量大、便捷、快速、無損等特點，可作為藥品、食品等的快速檢測手段，可以實現(xiàn)樣品的快速鑒別和化學成分的快速測定[15-21]。

1 實驗

1.1 材料與試劑

化橘紅藥材，購自多家醫(yī)院藥房和零售藥店，產(chǎn)地來自于廣東化州、廣西等化橘紅主要產(chǎn)區(qū)，44個批次的樣品；柚皮苷對照品（純度：98%），購于成都埃法生物科技有限公司；甲醇（色譜純，霍尼韋爾貿(mào)易(上海)有限公司）；乙酸（分析純，廣州化學試劑廠）；石油醚（分析純，天津市富宇精細化工有限公司）；水為純凈水（怡寶牌）。

1.2 儀器設備

SupNIR-2700近紅外光譜分析儀（聚光科技(杭州）股份有限公司），Agilent-1260型高效液相色譜儀（包括四元泵、在線脫氣機、DAD 檢測器等）（Agilent公司），C18柱（150 mm×4.6 mm，4 μm）（Agilent公司），CJ-100S超聲清洗儀器（深圳市超潔科技實業(yè)公司），二兩裝高速萬能粉碎機（浙江屹立工貿(mào)有限公司），BAS224S電子天平（德國Sartorius公司），三號篩網(wǎng)（50目）（上虞市道墟五四儀器紗篩廠），微孔濾膜（規(guī)格為0.22 μm）（津騰牌）。

1.3 實驗方法

1.3.1 采集近紅外光譜數(shù)據(jù)

將化橘紅樣品干燥，粉碎過三號篩網(wǎng)（50目），密封，干燥保存，即得化橘紅樣品粉末。各稱取44份化橘紅樣品粉末3 g，裝入石英瓶，壓實，進行測定。近紅外光譜儀參數(shù)設置為：光譜采集范圍為2 500～1 000 nm；分辨率為1 nm；掃描次數(shù)為64次；測樣方法為積分球漫反射，用于建立模型。44個化橘紅樣品的近紅外光譜疊加圖如圖1所示，每條譜線由1557個數(shù)據(jù)點構成。

圖1 近紅外光譜疊加圖

1.3.2 化橘紅中柚皮苷的含量測定

1.3.2.1化橘紅中柚皮苷的提取

各取化橘紅樣品44批，置于玻璃干燥器中干燥過夜，取出，粉碎過50目篩，精密稱定1.0 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入25 mL石油醚，超聲處理30 min，取出放冷后，過濾，棄去濾液，將濾紙剪碎塞回錐形瓶中，放置通風櫥等石油醚揮干。準確加入50 mL甲醇至錐形瓶中，精密稱定，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，過0.22 μm濾膜，即得。

1.3.2.2供試品溶液的制備

準確量取上述“1.3.2.1”提取溶液4.0 mL至干凈干燥的10 mL量瓶中，加純化水至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

1.3.2.3對照品溶液的制備精密稱取柚皮苷對照品0.031 45 g，置10 mL具塞量瓶中，加甲醇溶解，定容，于冰箱2～8℃保存。同時配制甲醇-水（1∶1）用以稀釋對照品溶液，備用。

1.3.2.4色譜條件

色譜柱：Agilent C18色譜柱（150 mm×4.6mm，4 μm）；流動相：0.5%乙酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～5 min，30% B；5～28 min，35% B；28～40 min，95% B）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為283 nm；柱溫為室溫；進樣量20 μL。按照上述色譜條件進行測定，得到對照品和樣品色譜圖，如圖2a、2b所示。

圖2 對照品（a）和樣品（b柚皮苷）HPLC圖

2 結果與討論

2.1 樣品含量測定

按“1.3.2.4”項下色譜條件測定44批化橘紅中柚皮苷的含量，含量測定結果如表1所示。

表1 化橘紅中柚皮苷的含量

（續(xù)表1）

從表1可以看出，不同批次的化橘紅樣品中柚皮苷的含量差異非常大，最高為9號樣品，含量為25.89%，最低為33號樣品，含量為1.55%，盡管在售賣的時候都標以化橘紅，實際上質(zhì)量差異非常大，部分是以一般橘紅冒充化橘紅的，達不到應有的治療效果。在44批樣本中，21、32、33的柚皮苷含量未達到中國藥典的規(guī)定（3.5%），大多數(shù)樣本是符合藥典質(zhì)量要求的，事實上，在符合藥典的產(chǎn)品中，柚皮苷的含量差異也是比較大的，其中價格比較高的乳果含量最高。

對于一般人員來說，判斷不同化橘紅的質(zhì)量是比較困難的，而高效液相色譜等含量測定方法專業(yè)性強、耗時長、成本高，也給化橘紅的質(zhì)量判斷帶來了障礙。

2.2 模型的建立與驗證

2.2.1 化橘紅中柚皮苷定量分析模型的建立方法

采用偏最小二乘法（PLS）建立校正化橘紅中柚皮苷含量的模型。近紅外光譜進行預處理的方法有：一階導數(shù)、二階導數(shù)、矢量歸一化、最小-最大歸一化、多元散射校正等。在每個化橘紅中柚皮苷含量指標模型的建立中，光譜預處理方法的選擇原則一般是使得偏最小二乘法能夠在光譜數(shù)據(jù)和柚皮苷含量指標數(shù)據(jù)間建立最佳的相關關系。分析模型檢驗方法采用交叉留一驗證來建立。以上計算使用 BRUKER公司OPUS 7.8執(zhí)行。

2.2.2 主因子數(shù)的選擇

主因子數(shù)的選擇影響建模結果的好壞。本研究中，柚皮苷主因子數(shù)的篩選和校正均方差之間的關系圖如圖3所示，柚皮苷以主因子數(shù) 8建模，RMSECV值最小。

圖3 主因子數(shù)對甘草酸定量分析模型校正均方差的影響

2.2.3 不同預處理方法優(yōu)化的校正模型選擇結果

建立化橘紅中柚皮苷模型后，采用的評價指標有建模集和驗證集變量間的線性關系（R）、建模集交叉驗證均方差（RMSECV）。對于同一化橘紅樣品集所構建的近紅外定量分析校正模型，相關系數(shù)R2越接近1、均方差 RMSECV越小，表示模型擬合能力越佳，所建柚皮苷的模型適用性越強、回歸（預測）結果越好[20]。經(jīng)過篩選不同預處理方法優(yōu)化的校正模型比較結果，最終確定一階導數(shù)+多元散射校正為光譜預處理方法，檢驗方法采用交叉驗證以2 350～2 199 nm、1 750～1 600 nm和1 301～1 150 nm的波長作為最佳范圍，如表2所示。

表2 不同預處理方法對模型的影響

表3 不同波長范圍對模型的影響

從表2和3可以看出不同預處理方法或者不同波長范圍對模型的影響是不同的。其中一階導數(shù)+多元散射校正的數(shù)據(jù)預處理方法得到了最優(yōu)的結果，一階導數(shù)可以消除樣本各成分之間光譜之間的相互干擾導致的光譜重疊，提高分辨率，多元散射校正主要用來消除樣本顆粒分布的不均勻，以及顆粒大小差異而導致的光散射影響，說明化橘紅在粉碎時不同的顆粒大小對結果影響較大。

2.2.4 化橘紅中柚皮苷定量分析模型的建立

以44批化橘紅樣品中35份組成模型的校正集，8份作為驗證集，用一階導數(shù)＋矢量歸一化作為近紅外光譜預處理方法，以2 350～2 199 nm、1 750～1 600 nm和1 301～1 150 nm的波長為最佳波段范圍，平滑點數(shù)為17，柚皮苷校正模型的交叉檢驗相關系數(shù)R2＝0.978，校正均方差 RMSECV＝0.997，各項參數(shù)的評價良好。近紅外光譜預測值與真值的相關圖如圖4所示。

圖4 化橘紅NIR預測值與真值的相關性

3 總結

本實驗采用高效液相色譜法（HPLC）測定含量結合近紅外光譜檢測技術，利用偏最小二乘回歸分析結合交叉驗證法，建立快速測定化橘紅中柚皮苷含量的模型。建立的校正模型的相關系數(shù)和內(nèi)部交叉驗證均方差分別為：R2＝0.978，RMSECV＝0.997，表明預測結果良好。該法的建立證明了近紅外光譜技術應用于化橘紅藥材中柚皮苷含量測定的可行性。

本實驗是定量分析模型，其準確性是在大量具有代表性樣品的精準測定及模型后期持續(xù)不斷的完善之上而建立的。在建立檢測化橘紅柚皮苷含量的過程中，樣品代表性越強，模型的實用性就越強，但是這需花費大量的時間和精力。從檢測化橘紅中柚皮苷含量的建立模型過程來看建立的過程是非常關鍵的，它將會直接影響近紅外光譜分析柚皮苷含量的工作效率和質(zhì)量。只有選擇合適的預處理方法和合適的波長范圍來減少光譜的干擾信息，才能獲得較理想的結果。柚皮苷的近紅外模型建成后，只需掃描獲得化橘紅樣品的近紅外光譜圖，根據(jù)模型即可直接預測出化橘紅中柚皮苷的含量，可以使繁瑣的常規(guī)分析方法變得簡便易行且快速無損。本文所建立的模型對于測定化橘紅中柚皮苷是非常有效的，值得借鑒和推廣使用。