秦淑娜，顧圣瑩，汪碩聞，陳永智，范國榮*，范 琦*

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，重慶 400016；2.上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科，上海 200080)

富馬酸替諾福韋酯(tenofovir disoproxil fumarate, TDF)是一種核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑前藥，可在細(xì)胞內(nèi)磷酸化為活性代謝產(chǎn)物替諾福韋雙磷酸鹽，其通過競爭性抑制病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶，終止DNA鏈增長，主要用于治療人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)及乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染[1-2]?！秶颐赓M艾滋病抗病毒藥物治療手冊(第四版)》中，將TDF列為一線治療藥物。TDF片由美國Gilead Sciences公司研發(fā)，于2003年獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)，以商品名韋瑞德(Viread)在美國上市，用于治療HIV感染。TDF片于2008年獲得歐盟和FDA批準(zhǔn)用于治療乙型肝炎；2008年6月該藥獲得中國國家食品藥品監(jiān)督管理局的進(jìn)口藥品注冊證，專利于2017年到期后，國產(chǎn)仿制藥獲批上市。

TDF為生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)(biopharmaceutics classification system,BCS)Ⅲ類藥物，具有高溶解性和低滲透性?！吨腥A人民共和國藥典》(簡稱《中國藥典》)2015年版中未收錄該藥，國內(nèi)文獻(xiàn)關(guān)于該藥的溶出度一致性評價研究也較少。因此建立可靠、穩(wěn)定的TDF口服固體制劑溶出度測定方法，可為國內(nèi)TDF制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考依據(jù)。

溶出度試驗?zāi)M口服固體制劑在人體消化道內(nèi)崩解和溶出過程，是評價口服固體制劑質(zhì)量的重要手段之一[3-4]。本研究建立TDF口服固體制劑溶出度測定的HPLC法，并對國內(nèi)4個廠家生產(chǎn)的TDF仿制藥進(jìn)行溶出度一致性評價，為臨床遴選優(yōu)質(zhì)的仿制藥提供參考，并為國產(chǎn)TDF制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供數(shù)據(jù)支持。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 CPA225D分析天平(精度0.01 mg，德國賽多利斯公司)；UltiMate 3000高效液相色譜儀(美國賽默飛公司)；Waters C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,美國Waters公司)；FE 20 pH計(梅特勒-托利多國際有限公司)；SNTR-6400A溶出度儀、SSAS-6000自動取樣器(日本島津公司)；MCE針頭式過濾器(0.45 μm,上海島津技邇商貿(mào)有限公司)；5804R高速冷凍離心機(德國艾本德公司)；SK5200H超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；全自動滲透純水機(上海金邁凈水設(shè)備有限公司)。

1.2 試劑和藥品 TDF對照品(含量>98%，批號M0402AS，大連美侖生物技術(shù)有限公司)；TDF藥品信息見表1。乙腈(色譜純，批號JA060230，默克股份兩合公司)；鹽酸(批號20171108)、磷酸(批號20160217)、乙酸(批號201709012)、甲酸(批號20160620)、氫氧化鈉(批號20160620)、無水乙酸鈉(批號20170908)、磷酸二氫鈉(批號20160505)及磷酸二氫鉀(批號20160325)均為分析純，購于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；實驗用水均由上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科利用全自動滲透純水機自制。

表1 富馬酸替諾福韋酯口服固體制劑的藥品信息Table 1 The drug information of the oral solid preparations of tenofovir disoproxil fumarate

2 方法和結(jié)果

2.1 溶出條件 參照《中國藥典》2015年版四部通則0931選擇槳法，槳轉(zhuǎn)速為50 r/min。根據(jù)《普通口服固體制劑溶出度試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》(簡稱《溶出度指導(dǎo)原則》)，采用4種不同pH值的溶出介質(zhì)，溶出介質(zhì)體積為900 ml(由于D廠生產(chǎn)的TDF口服固體制劑為膠囊劑，根據(jù)《中國藥典》2015年版四部通則0931以槳法實驗時需用沉降籃)，溫度為(37±0.5) ℃，取樣時間點為5、10、15、20、30 min，各取樣時間點取溶出液5 ml，并及時補充相應(yīng)同溫度同體積的溶出介質(zhì)。

2.2 溶液的配制

2.2.1 溶出介質(zhì) 4種溶出介質(zhì)分別為：(1)純化水；(2)pH=1.2的鹽酸溶液；(3)pH=4.0的緩沖溶液；(4)pH=6.8的緩沖溶液。配制方法參考《溶出度指導(dǎo)原則》。

2.2.2 對照品溶液 取TDF對照品約10 mg，精密稱定，置10 ml容量瓶中，加80%甲醇水溶液稀釋至刻度，得TDF對照品儲備液，再將對照品儲備液用4種溶出介質(zhì)分別稀釋至相應(yīng)濃度，即得TDF對照品溶液。

2.2.3 供試品溶出液 取TDF片劑6片或膠囊劑6粒，置于2.2.1項下配制的溶出介質(zhì)中，按2.1項下條件進(jìn)行溶出度試驗，得溶出液，置于冷凍離心機中，1.803 2×104×g離心10 min，取上清，即得。

2.3 測定方法的建立和驗證

2.3.1 色譜條件 以含0.1%甲酸的乙腈為流動相A，0.02 mol/L磷酸氫二鈉水溶液為流動相B，梯度洗脫(0～6 min，75%～55% B；6～9 min，75% B)；檢測波長260 nm；流速1 ml/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μl。

2.3.2 專屬性考察 分別取2.2項下4種空白溶出介質(zhì)、4種對照品溶液及TDF原研藥溶出液(取樣時間點為30 min)，1.803 2×104×g離心10 min后，按2.3.1項下色譜條件測定，結(jié)果4種空白溶出介質(zhì)在主峰位置無干擾，不同溶出介質(zhì)中替諾福韋酯峰的保留時間基本一致，對照品溶液與原研藥溶出液中的替諾福韋酯峰保留時間穩(wěn)定在8.0 min左右(見圖1)，表明該方法專屬性較好。

2.3.3 線性關(guān)系考察 精密量取2.2.2項下對照品儲備液適量，分別用4種溶出介質(zhì)稀釋成103.01、206.02、309.03、515.05、721.07、927.09、1 030.10 μg/ml系列濃度對照品溶液，1.803 2×104×g離心10 min后，按2.3.1項下色譜條件測定。以濃度(c)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程見表2。結(jié)果顯示，4種溶出介質(zhì)中，TDF在103.01～1 030.10 μg/ml濃度范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系，且截距均不超過100%溶出時峰面積的2%，表明系統(tǒng)誤差較小[4]。

2.3.4 精密度實驗 精密量取2.2.2項下TDF對照品儲備液適量，分別用4種溶出介質(zhì)稀釋成343.37 μg/ml(相當(dāng)于100%濃度水平)的對照品溶液，1.803 2×104×g離心10 min后，按2.3.1項下色譜條件測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果顯示，平均峰面積的RSD均<2%(見表2)，表明日內(nèi)精密度符合要求。以上述用4種溶出介質(zhì)為稀釋液，分別平行配制6份對照品溶液，1.803 2×104×g離心10 min后，按2.3.1項下色譜條件測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，計算峰面積的RSD；連續(xù)測定3 d，計算平均峰面積的RSD。結(jié)果顯示，平均峰面積RSD均<2%(見表2)，表明方法重復(fù)性及日間精密度均符合要求。

表2 HPLC法測定TDF濃度的方法學(xué)驗證Table 2 Validation of HPLC method for concentration determination of TDF

2.3.5 回收率實驗 取TDF原研藥按2.2.3項下方法操作，取30 min時的溶出液適量，其余溶出條件同2.1項。將相當(dāng)于制劑標(biāo)示量100%的對照品加入溶出液中，平行配制6份，將加樣前后溶液以1.803 2×104×g離心10 min后，按2.3.1項下色譜條件測定，根據(jù)兩次測定結(jié)果計算加樣回收率。結(jié)果顯示，平均加樣回收率在99%～102%(見表2)，表明該方法準(zhǔn)確度符合要求。

2.3.6 穩(wěn)定性實驗 精密量取2.2.2項下TDF對照品儲備液適量，分別用4種溶出介質(zhì)稀釋，平行制備6份濃度為343.37 μg/ml(相當(dāng)于100%濃度水平)的對照品溶液。分別于37 ℃水浴放置0、3 h及室溫放置0、3、6、12 h 后，1.803 2×104×g離心10 min，按2.3.1項下色譜條件測定，計算峰面積平均值。結(jié)果顯示峰面積平均值的RSD<2%(n=6)，表明在4種溶出介質(zhì)中，TDF于37 ℃放置3 h及室溫下放置12 h均穩(wěn)定。

2.4 槳轉(zhuǎn)速的選擇 將溶出儀槳轉(zhuǎn)速分別設(shè)為50和75 r/min，取TDF原研藥和A廠仿制藥片各6片，以水為溶出介質(zhì)，按2.2.3項下方法制備供試品溶出液，然后按2.3.1項下色譜條件測定，計算平均溶出度百分比。結(jié)果顯示，槳轉(zhuǎn)速為75 r/min時TDF仿制藥與原研藥溶出均較快，其中A廠生產(chǎn)的仿制藥片在第一個取樣時間點(5 min)時基本全部溶出，溶出度為(98.80±2.35)%(n=6)，50 r/min時TDF仿制藥與原研藥溶出區(qū)分力度更大，故將50 r/min作為本研究的槳轉(zhuǎn)速。

2.5 溶出度條件耐用性考察

2.5.1 溶出介質(zhì)溫度、槳轉(zhuǎn)速耐用性考察及溶出介質(zhì)脫氣的影響 分別取TDF原研藥6片，以水為溶出介質(zhì)，按2.2.3項下方法制備供試品溶出液，在給定的溶出條件下分別考察溶出介質(zhì)溫度(37 ℃、36 ℃、38 ℃)和槳轉(zhuǎn)速(50、45、55 r/min)及溶出介質(zhì)是否脫氣對溶出的影響。分別對條件改變前后的溶出曲線做t檢驗，結(jié)果P值均>0.05，表明溶出介質(zhì)微小溫度變化、槳轉(zhuǎn)速變化及溶出介質(zhì)是否脫氣對TDF口服固體制劑的溶出行為無顯著影響。

2.5.2 濾膜吸附影響的考察 取TDF原研藥，按2.2.3項下方法分別制備溶出液，僅于溶出30 min時取樣，分成兩份，一份用MCE針頭式過濾器過濾，另一份于1.803 2×104×g離心10 min后取上清液，分別平行制備6份，按2.3.1項下色譜條件測定。結(jié)果在水、pH=1.2的鹽酸溶液、pH=4.0的緩沖溶液和pH=6.8的緩沖溶液中，濾膜過濾樣品與離心后樣品的峰面積平均值的百分比分別為93.07%、95.81%、94.68%及94.38%，即在4種溶出介質(zhì)中，TDF濾膜吸附率均>2%。為避免濾膜對供試品溶出液中藥物的吸附作用，本研究進(jìn)樣前采用離心的方法處理溶出液。

2.6 溶出度一致性評價

2.6.1 非模型依賴法 按2.2.3項下方法制備TDF口服固體制劑仿制藥及原研藥溶出液，然后按2.3.1項下色譜條件進(jìn)樣，計算各取樣時間點的累積溶出百分率。根據(jù)《溶出度指導(dǎo)原則》，繪制溶出曲線，見圖2。由于D廠生產(chǎn)的TDF膠囊劑僅在pH=1.2的鹽酸溶出介質(zhì)中1 h內(nèi)可以全部溶出，故將D廠生產(chǎn)的TDF膠囊劑在其他3種溶出介質(zhì)中的取樣時間點設(shè)為5、10、15、20、30、45、60、75、90、120、150、180 min，其余溶出條件同2.1項，計算各取樣時間點的累積溶出百分率并繪制溶出曲線(見圖3)。結(jié)果除D廠生產(chǎn)的TDF膠囊劑外，其余仿制藥片劑與原研藥在15 min內(nèi)的溶出度均>85%。根據(jù)《溶出度指導(dǎo)原則》，無需比較相似因子f2，即可認(rèn)為A、B、C廠生產(chǎn)的仿制藥片劑與原研藥的溶出行為一致，D廠生產(chǎn)的TDF膠囊劑與原研藥溶出行為不一致。

2.6.2 威布爾模型法 威布爾模型法可以精確描述藥品溶出過程[5-6]，故本研究采用威布爾模型法對TDF固體制劑的溶出行為進(jìn)行評價。由于TDF片劑在溶出介質(zhì)中崩解溶出極快，設(shè)位置參數(shù)α為0，再將3種國產(chǎn)TDF片劑和原研藥溶出度試驗所得數(shù)據(jù)按威布爾模型法采用Excel軟件(Office 2016)建模，并計算4種溶出介質(zhì)中各釋放參數(shù)的均值[6-7](見表3)。結(jié)果顯示，不同廠家生產(chǎn)的TDF片劑在4種溶出介質(zhì)中藥物溶出50%的時間參數(shù)(T50)、藥物溶出63.2%的時間參數(shù)(Td)和藥物溶出85%的時間參數(shù)(T85)均值均不相同，表明A、B、C廠生產(chǎn)的仿制藥片劑與原研藥的溶出參數(shù)存在差異，其中C廠生產(chǎn)的TDF片劑在4種溶出介質(zhì)中的T50、Td和T85分別是A廠的35.31、18.08及5.21倍，說明國內(nèi)不同廠家生產(chǎn)的TDF片劑的溶出行為存在較大差異。

表3 TDF片的溶出參數(shù)Table 3 Dissolution parameters of TDF tablets

3 討 論

本研究建立了TDF濃度測定的HPLC法，方法的專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、回收率及穩(wěn)定性均符合要求。本研究參考《溶出度指導(dǎo)原則》，采用4種不同溶出介質(zhì)，溶出度條件耐用性考察結(jié)果符合要求，故本研究建立的方法適用于TDF口服固體制劑溶出行為的一致性評價。

本研究發(fā)現(xiàn)，D廠生產(chǎn)的膠囊劑與原研藥溶出行為不一致，且在不同溶出介質(zhì)中膠囊內(nèi)藥物的溶出行為也不同。可能是因為D廠生產(chǎn)的TDF口服固體制劑劑型改變所致，明膠外殼對TDF藥物的溶出有限制。有文獻(xiàn)指出，TDF膠囊劑和片劑具有生物等效性[8]，可能與其生物藥劑學(xué)特性有關(guān)。另外，由于TDF片劑中主藥釋放速度較快，可產(chǎn)生突釋效應(yīng)，導(dǎo)致胃腸道不良反應(yīng)等，而TDF膠囊劑的釋放速度較平緩，可避免突釋效應(yīng)，此現(xiàn)象可為臨床選藥提供參考。

本研究采用兩種方法對TDF原研藥與國產(chǎn)口服固體制劑溶出度的一致性進(jìn)行評價。首先，參照《溶出度指導(dǎo)原則》繪制溶出曲線，其中除D廠生產(chǎn)的膠囊劑外，其余3個廠家生產(chǎn)的仿制藥片劑與原研藥在4種溶出介質(zhì)中15 min內(nèi)溶出度均>85%，根據(jù)《溶出度指導(dǎo)原則》，理論上初略表征3種片劑仿制藥與原研藥的溶出行為一致。將這3個廠家生產(chǎn)的TDF片劑與原研藥以威布爾模型法計算溶出參數(shù)，結(jié)果3種TDF片劑與原研藥之間，及國產(chǎn)仿制藥片劑之間的溶出參數(shù)存在差異，由此推測國內(nèi)不同廠家生產(chǎn)的TDF片劑的生產(chǎn)工藝可能存在較大差異。對溶解較快的藥品，僅以15 min溶出量>85%即認(rèn)為口服固體制劑的溶出行為一致具有局限性，以不同的方法考察仿制藥與原研藥的溶出度一致性，能更全面地評價國產(chǎn)仿制藥與原研藥溶出行為的差異。