李紅玲，宋美燕，馬昊然，陸藝蓓，馬曉莉，徐艷嬌

(1. 河北大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000;2.河北大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000)

瑞香狼毒(Stellerachamaejasme),又名紅狼毒，藏藥名稱熱甲巴，是瑞香科狼毒屬植物，其干燥根可入藥.中醫(yī)圣典《本草綱目》、《名醫(yī)別錄》對狼毒的功效，均有記載：稱其有“破積聚”、“除脅下積癖”[1]之功效，能“治痰飲癥瘕”[2].瑞香狼毒包含多種活性成分(萜類、香豆素、黃酮類化合物、木質(zhì)素、多糖等)，藥理作用包括抗腫瘤、抗菌、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫等[3-4].多項研究結(jié)果顯示，瑞香狼毒對肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、肉瘤等多種腫瘤細胞均表現(xiàn)出顯著的體內(nèi)外抑制活性[5-8].

由于瑞香狼毒生品具有一定毒性，從而限制了其臨床應(yīng)用.將狼毒生品炮制(如醋制、奶制、酒制等)后，通過改變其化學(xué)成分的含量，能起到減輕藥物毒副反應(yīng)、增強藥理功效的作用.其中，酒制可以增加瑞香狼毒的破痞功能[9-11].

本研究通過動物實驗，比較了瑞香狼毒酒制品和生品對S180腫瘤細胞的體內(nèi)抑制活性，并對其抗腫瘤作用機制進行了探討，從而為瑞香狼毒的藥物開發(fā)提供了實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑

小鼠80只(4～6周)，昆明種，清潔級，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，動物合格證編號：1811297，由河北醫(yī)科大學(xué)動物學(xué)部繁育，飼養(yǎng)于河北大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗中心.S180肉瘤細胞，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細胞資源中心提供.瑞香狼毒切片，馬曉莉教授鑒定為正品，安國市昌達藥材公司產(chǎn)品.

PBS磷酸鹽緩沖液(粉劑)，抗原修復(fù)緩沖液(EDTA法)，過氧化物酶阻斷液，封閉用山羊血清，Ki-67鼠抗人單克隆抗體(用PBS以體積比1∶100稀釋備用)及生物素標記通用二抗，DAB顯色試劑盒(20X)均為北京中杉金橋公司產(chǎn)品，Caspase-3兔抗人多克隆抗體(用PBS以體積比1∶100稀釋備用)為武漢博士德公司產(chǎn)品.

1.2 實驗儀器

倒置顯微鏡 (上海徠卡儀器有限公司)；電陶爐(上海元山電器工業(yè)有限公司)； 石蠟包埋機(上海徠卡)；撈片機(上海徠卡)；石蠟切片機(德國徠卡)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；微波爐(廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司).

1.3 實驗方法

1.3.1 瑞香狼毒的炮制及水煎液的制備

瑞香狼毒生藥200 g，用1 000 mL的60度紅星二鍋頭浸泡(時間不低于6 h)，再經(jīng)文火加熱、烤箱40 ℃烘干至白酒完全吸收(200 g瑞香狼毒生品炮制后，質(zhì)量減至194 g).酒制及生品瑞香狼毒各取100 g，分別加水1 000 mL，浸泡0.5 h后大火煮沸，小火慢煎0.5 h后紗布過濾留取藥汁.同法煎制第2次，將2煎藥液合并，經(jīng)大火煮沸濃縮、冷卻離心去除藥渣后，得250 mL澄明狼毒水煎液.部分原液用蒸餾水分別做2倍、4倍稀釋，最后得藥物質(zhì)量濃度分別為0.4、0.2和0.1 g/mL的瑞香狼毒生品及酒制品水煎液各100 mL，于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?

1.3.2 S180荷瘤鼠建模、隨機分組、灌胃給藥及觀察指標

離心收集S180肉瘤細胞至1×107/mL，0.2 mL腹腔注射于4～6周昆明小鼠體內(nèi)，建立S180腹水荷瘤小鼠模型.待接種7～9 d，小鼠腹水明顯時，抽取小鼠腹水.0.2 mL腹腔注射于另1只4～6周的小鼠體內(nèi)進行傳代.取第3代腹水型荷瘤小鼠1只，于腹腔接種第9天抽取腹水，用無菌PBS進行稀釋，將其調(diào)整至細胞濃度為1.5×107/mL的細胞懸液(活細胞數(shù)大于等于90%).以每只0.2 mL的劑量，皮下注射于小鼠左側(cè)上肢腋下部位，干棉簽按壓片刻防止液體滲出.為保持瘤細胞活力，接種操作需在1 h之內(nèi)完成.

昆明種小鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g.隨機抽取10只作為空白對照組，剩余70只進行S180皮下荷瘤造模.于造模第2天，將荷瘤小鼠按體質(zhì)量隨機分成7個組：模型組、生藥低中高劑量組(藥物質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.4 g/mL)、酒制低中高劑量組(藥物質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.4 g/mL)，每組10只，雌雄各半.

分組次日灌胃給藥，每只小鼠每日1 mL，連續(xù)給藥7 d.空白對照組、模型組給予生理鹽水；瑞香狼毒用藥組，分別給予低中高濃度的瑞香狼毒生藥及酒制水煎劑.

于造模日開始，密切觀察各組小鼠的飲食、飲水等情況，隔日測量體質(zhì)量1次.造模第2日起，荷瘤鼠進行造模處超聲檢查，隔日1次.

1.3.3 指標測量

末次給藥24 h后，將各組小鼠稱質(zhì)量后脫頸處死解剖，將瘤體、脾臟及胸腺取材并稱質(zhì)量，按下列公式計算各組小鼠的抑瘤率、脾指數(shù)、胸腺指數(shù).

抑瘤率=(模型組瘤質(zhì)量-用藥組瘤質(zhì)量)/模型組瘤質(zhì)量×100%，

脾指數(shù)=脾質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)×10，

胸腺指數(shù) =胸腺質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)×10[10].

多聚甲醛水(質(zhì)量比4∶100)溶液固定腫瘤組織48 h后，依次經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟包埋后制成石蠟切片.切片機切成4 μm薄片，于60 ℃烤箱內(nèi)2 h烘干，進行HE染色并按試劑盒操作流程進行Ki-67、Caspase-3免疫組化(SP法)檢測[12].顯微鏡下觀察腫瘤組織HE及免疫組化染色結(jié)果.免疫組化結(jié)果鑒定標準為Ki-67陽性呈棕黃色，表達于腫瘤細胞的細胞核；Caspase-3陽性為黃褐色，表達于腫瘤細胞的胞膜或胞漿中.每組10只小鼠，每只小鼠取1張切片，每張切片取5個高倍視野(視野需完整且不重疊)計算得出每張切片的陽性反應(yīng)率，公式為陽性率=陽性細胞數(shù)或陽性反應(yīng)面積/腫瘤細胞總數(shù)或細胞總面積×100%.最后累計得出平均值.

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)用SPSS19.0軟件進行分析處理，以均數(shù)±標準差表示，單因素、多因素及重復(fù)測量資料方差分析比較組內(nèi)、組間差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義的判定標準為P<0.05.

2 結(jié)果與分析

2.1 各組小鼠的抑瘤率、腫瘤體積、體質(zhì)量、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)比較

實驗結(jié)果顯示，瑞香狼毒生藥及酒制組小鼠的瘤質(zhì)量均小于模型組，F(xiàn)=7.616(P<0.01)；生藥低中高劑量組小鼠的抑瘤率分別為34.80%、44.00%、33.18%，中劑量組最高(P<0.05)；酒制低中高劑量組小鼠的抑瘤率分別為46.80%、57.97%、54.95%，中劑量組最高(P<0.05).酒制瑞香狼毒組抑瘤率與同劑量的生藥組相比，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，結(jié)果見表1.

小動物超聲檢查結(jié)果顯示：利用V=ab2公式計算各組荷瘤小鼠的腫瘤體積(a指腫瘤組織長度，b指腫瘤組織寬度).各組數(shù)據(jù)進行組內(nèi)、組間對比分析，組內(nèi)對比F=333.393，P≤0.001；組間對比F=2.687，P≤0.001，結(jié)果見表2.造模第8天，小動物超聲檢查可見小鼠造模區(qū)皮下有實質(zhì)性的不規(guī)則低回聲區(qū)，其邊界欠清晰，回聲區(qū)內(nèi)可見點、片狀的散在高回聲鈣化區(qū)，偶有液性暗區(qū)，結(jié)果見圖1.

小鼠的體質(zhì)量增長曲線結(jié)果發(fā)現(xiàn)：自造模第7天起，各組小鼠的體質(zhì)量組間差異明顯(P<0.05).與空白對照組相比，模型組及生藥低、中劑量組小鼠的體質(zhì)量增長緩慢(P<0.05)；酒制各劑量組小鼠體質(zhì)量略高于生藥組，但組間差異P>0.05，不具有統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果見圖2.

模型組、生藥各劑量組小鼠的脾指數(shù)低于空白對照組，生藥高劑量組小鼠脾指數(shù)最低(P<0.05)；與空白對照組相比，酒制各劑量組小鼠的脾指數(shù)略高，但組間差異P>0.05，沒有統(tǒng)計學(xué)意義；酒制各劑量組小鼠的脾指數(shù)高于生藥組(P<0.05).各組小鼠的胸腺指數(shù)結(jié)果顯示，組間差異P>0.05，不具有統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果見表1.

腫瘤組織的HE染色形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)：模型組腫瘤細胞形狀不規(guī)則、大小不等，數(shù)量較多并且排列緊密；高倍鏡下可見多個增殖細胞，胞核較大且呈分裂狀、深染.瑞香狼毒各用藥組的腫瘤細胞較模型組相比，排列稀疏，數(shù)量較少，高倍視野下可見大小不規(guī)則的壞死區(qū)，區(qū)內(nèi)呈淺粉色，正常細胞結(jié)構(gòu)消失，無胞膜，胞核消失或可見散在的碎裂胞核，壞死區(qū)周圍有散在的、不同程度的白細胞浸潤(圖3).

圖1 各組荷瘤小鼠造模第8天腫瘤超聲影像Fig.1 Ultrasound image of tumor tissue of tumor-bearing mice in each group on the 8th day of modeling

圖2 各組小鼠體質(zhì)量增長曲線Fig.2 Mass growth curve of mice in each group

圖3 各組荷瘤小鼠腫瘤組織形態(tài)學(xué)觀察 HE染色(×400)Fig.3 Morphological observation of tumor tissue of tumor-bearing mice in each group HE staining(×400)

2.2 各組荷瘤小鼠Ki-67、Caspase-3免疫組化結(jié)果比較

免疫組化結(jié)果顯示，生藥及酒制瑞香狼毒各劑量組小鼠的Ki-67增殖指數(shù)明顯低于模型組(P<0.05，P<0.01).生藥低中高劑量組的Ki-67增殖指數(shù)分別為40.00%、29.23%、30.78%，中劑量組最低(P<0.05)；酒制低中高劑量組的Ki-67增殖指數(shù)分別為27.37%、26.50%、26.28%，高劑量組最低(P<0.05).酒制瑞香狼毒組Ki-67增殖指數(shù)與同劑量生藥組相比，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05).

瑞香狼毒各用藥組小鼠的Caspase-3陽性表達率高于模型組，其中以酒制中高劑量組50.75%、40.40%的Caspase-3陽性表達率最高(P<0.01)，但生藥各劑量組、酒制低劑量組的Caspase-3陽性表達率與模型組相比，組間差異P>0.05；與生藥組相比，酒制各劑量組Caspase-3陽性表達率增高(P<0.05)，結(jié)果見表3.

免疫組化形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)：DAB常規(guī)染色后，鏡下可見Ki-67陽性細胞呈現(xiàn)胞核棕黃色染色，模型組小鼠的Ki-67陽性細胞數(shù)量最多，生藥及酒制瑞香狼毒各劑量組數(shù)量相對較少，結(jié)果見圖4.Caspase-3陽性細胞的胞膜及胞漿呈現(xiàn)黃色或黃褐色，瑞香狼毒各用藥組的黃色顆粒數(shù)量明顯多于模型組，結(jié)果見圖5.

圖4 各組荷瘤小鼠腫瘤組織Ki-67免疫組化結(jié)果(DAB×400)Fig.4 Immunohistochemical results of Ki-67 in tumor tissue of tumor-bearing mice in each group(DAB×400)

圖5 各組荷瘤小鼠腫瘤組織Caspase-3免疫組化結(jié)果(DAB×400)Fig.5 Immunohistochemical results of Caspase-3 in tumor tissue of tumor-bearing mice in each group(DAB×400)

3 結(jié)論

中藥炮制是在辨證論治中醫(yī)藥理論體系下所形成的一種中國特有的制藥技術(shù).中醫(yī)理論認為：通過炮制，可改變藥材的四氣五味、升降浮沉、歸經(jīng)等特性，從而導(dǎo)致其功效、用途發(fā)生相應(yīng)變化，以達到辯證論治的用藥目的.中醫(yī)認為：酒，性味甘、辛，大熱，具有活血通絡(luò)、祛風(fēng)散寒、引藥上行、緩和藥性、減毒等功效.多項研究結(jié)果顯示：酒精是一種良好的溶劑，能溶解多種物質(zhì)，如糖類、生物堿、揮發(fā)油、甙類、鞣質(zhì)、有機酸等.經(jīng)酒精浸潤溶解后，能增強藥物有效成分的置換和擴散，從而達到提高藥物生物利用度的效果.本次實驗結(jié)果證實：酒制后的瑞香狼毒對S180腫瘤細胞的抑制作用優(yōu)于生品，提示酒制能提高瑞香狼毒的破痞功能，起到抗腫瘤增效的作用.

與空白對照組相比，酒制瑞香狼毒組小鼠體質(zhì)量組間差異P>0.05，而生藥組小鼠體質(zhì)量增長減緩，可能與酒制能降低瑞香狼毒生藥的毒性反應(yīng)相關(guān).同時，酒制組小鼠的脾指數(shù)高于生藥組，提示酒制后的瑞香狼毒能提高小鼠的脾指數(shù).該實驗劑量的瑞香狼毒對胸腺的影響不大(胸腺指數(shù)組間差異P>0.05)，結(jié)果不具統(tǒng)計學(xué)意義.

抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡是公認的中藥抗腫瘤的2種主要作用機制.采用免疫組化法，筆者對S180腫瘤細胞的增殖相關(guān)蛋白Ki-67、凋亡相關(guān)酶Caspase-3進行了定性和半定量分析[12].

腫瘤細胞的增殖，較正常細胞相比，具有不受控性.作為一個細胞增殖相關(guān)蛋白，Ki-67指數(shù)的高低，能體現(xiàn)細胞的增殖活性.其陽性率達到10%以上，則提示患有惡性腫瘤的可能性較高[13].研究顯示，Ki-67的陽性率與多種腫瘤的分化程度、浸潤、轉(zhuǎn)移及預(yù)后息息相關(guān)[14].實驗結(jié)果證實：與腫瘤對照組49.25%的陽性率相比，瑞香狼毒生藥組及酒制組的Ki-67增值指數(shù)明顯降低(P<0.05,P<0.01).酒制瑞香狼毒組Ki-67增殖指數(shù)與同劑量生藥組相比，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05).實驗數(shù)據(jù)顯示，酒制瑞香狼毒通過抑制Ki-67在S180細胞中的表達，減緩腫瘤細胞分裂增殖.

細胞凋亡是一種真核細胞特有的細胞消亡現(xiàn)象，具有主動有序、多基因調(diào)控的特點[15].研究發(fā)現(xiàn)，多種酶蛋白、基因?qū)Φ蛲龅膯诱{(diào)控具有調(diào)節(jié)作用.Caspase(含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶)家族，在細胞凋亡執(zhí)行過程中具有不可替代的作用，是凋亡啟動的介導(dǎo)者和執(zhí)行者.Caspase的激活，是公認的最佳凋亡生化標志.Caspase-3是凋亡最重要的執(zhí)行者，是種類龐大的Caspase家族中最重要的效應(yīng)型蛋白酶，處于凋亡有序級聯(lián)反應(yīng)的下游[16].實驗結(jié)果證實,酒制中高劑量組Caspase-3的陽性表達率顯著性增高(P<0.01)，表明中高劑量的酒制瑞香狼毒能通過促進Caspase-3活化,誘導(dǎo)S180腫瘤細胞發(fā)生凋亡.