朱宏，柴文娟，楊飛蕓, 3，王瑞剛 , 3

(1. 哈爾濱師范大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080；2. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物逆境生理與分子生物自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；3. 內(nèi)蒙古自治區(qū)植物基因資源挖掘與分子育種工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

植物細(xì)胞最外層透明的薄壁組織結(jié)構(gòu)稱為細(xì)胞壁，具有保護(hù)和支持細(xì)胞的作用.纖維素、半纖維素和果膠等是細(xì)胞壁的主要組分，纖維素是由β-1,4-葡聚糖鏈組成的大分子多糖類物質(zhì)，是自然界中分布最廣、地球上生物量最多，與人類生產(chǎn)生活密切相關(guān)的可再生資源[1].

纖維素主要由纖維素合酶(cellulose synthase, CesA)合成[2]，編碼纖維素合酶的基因CesA在各物種中比較保守，通常包含9～13個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)度為3.5～5.5 kb[1].由CesA基因所編碼的纖維素合酶單體，需在高爾基體上組裝成為具有對(duì)稱玫瑰花環(huán)結(jié)構(gòu)的纖維素合酶復(fù)合體(cellulose synthase complex, CSC)[3]，然后由分泌泡(secretory vesicles)將其轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，纖維素才在細(xì)胞膜上得以生成并最終沉積到細(xì)胞壁上[4].CesA蛋白的保守結(jié)構(gòu)域主要包括：負(fù)責(zé)與其他CesA單體互作的鋅指/環(huán)指結(jié)構(gòu)(zinc-/Ring finger motif，位于N端)、8個(gè)跨膜區(qū)(Transmembrane domains，TMD；2個(gè)在N端，6個(gè)在C端)、β-糖苷基轉(zhuǎn)移酶的保守序列、D…D…D…QxxRW結(jié)構(gòu)(x為任意氨基酸)、1個(gè)高度可變區(qū)和1個(gè)植物保守區(qū)域[5-7].自第1個(gè)CesA基因在木醋桿菌Bacillusxylinus中被分離發(fā)現(xiàn)以來(lái)[8]，得益于生物技術(shù)手段與測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的纖維素合酶基因被發(fā)現(xiàn)鑒定.目前，擬南芥Arabidopsisthaliana、楊樹Populusalba、棉花Gossypiumherbaceum、玉米Zeamays、葡萄Vitisvinifera、水稻Oryzasativa、馬尾松PinusmassonianaLamb和苧麻Boehmerianivea等40多個(gè)物種的16 400多條CesA基因序列都已被研究報(bào)道[9-10].擬南芥CesA基因家族共有10個(gè)成員，其中AtCesA1、AtCesA2、AtCesA3、AtCesA5、AtCesA6和AtCesA9參與植物細(xì)胞壁的初生壁形成時(shí)期纖維素的合成，而且已有研究表明AtCesA6和AtCesA2、AtCesA5、AtCesA9基因功能有部分冗余[11-13].次生壁纖維素的合成則由AtCesA4、AtCesA7和AtCesA8基因負(fù)責(zé)[12-14].Carroll等[15]研究發(fā)現(xiàn)AtCesA7基因可部分恢復(fù)cesa3突變體的初生細(xì)胞壁合成受阻的表型，表明初生壁CesA和次生壁CesA蛋白功能可以互補(bǔ).

中間錦雞兒是廣泛分布于中國(guó)西北部半干旱、干旱地區(qū)的一種多年生灌木，屬于豆科錦雞兒屬植物[16].近年來(lái)因其具有一定的飼用造紙等經(jīng)濟(jì)價(jià)值，同時(shí)也具有綠化環(huán)境、防風(fēng)固沙的生態(tài)價(jià)值而受到關(guān)注.當(dāng)中間錦雞兒做造紙用時(shí)，需要其具有較高含量的纖維素；做飼料用時(shí)，考慮到動(dòng)物適口性及消化等因素，則要求中間錦雞兒纖維素含量不可過高.因此通過基因工程手段改變纖維素含量或質(zhì)量成為研究熱點(diǎn).本研究以中間錦雞兒為材料，通過同源克隆及RACE(rapid amplification of cDNA end)技術(shù)，從中間錦雞兒中克隆得到CiCesA3基因全長(zhǎng)cDNA序列，并對(duì)基因進(jìn)行了生物信息學(xué)和組織表達(dá)分析，為進(jìn)一步了解中間錦雞兒纖維素合成提供了依據(jù).

1 材料和方法

1.1 植物材料與處理方法

實(shí)驗(yàn)所用中間錦雞兒種子采于內(nèi)蒙古烏蘭察布市四子王旗.選取生長(zhǎng)飽滿的種子播種于裝有營(yíng)養(yǎng)土和蛭石(體積比1∶3)的培養(yǎng)缽中，在溫室中培養(yǎng)25 d，具體培養(yǎng)條件為7 000～8 000 lx光照強(qiáng)度、22 ℃、16 h光照/ 8 h黑暗.

選擇長(zhǎng)勢(shì)良好、未受脅迫的中間錦雞兒幼苗用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).小心從蛭石中取出中間錦雞兒幼苗，并用清水清洗干凈幼苗根部的蛭石，放于清水中，以溫室培養(yǎng)條件培養(yǎng)2 d.分別剪取幼苗的根、莖、葉部分并于液氮中速凍，存于-80 ℃?zhèn)溆?

1.2 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

利用TRIzol(Invitrogen公司)法進(jìn)行中間錦雞兒總RNA及根、莖、葉RNA的提取.用超微量紫外分光光度計(jì)(Quawell公司，Q5000)測(cè)定所提取的檸條總RNA及不同組織RNA的含量，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，選取條帶清晰且無(wú)拖帶現(xiàn)象的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄.

取1 000 ng純化過的總RNA，利用RTase M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(大連寶生物工程有限公司，TaKaRa)，依照反轉(zhuǎn)錄試劑說(shuō)明書合成cDNA第1條鏈.

1.3 基因保守區(qū)克隆與cDNA末端快速擴(kuò)增

根據(jù)大豆Glycinemax、楊樹、棉花Gossypiumraimondii以及中間錦雞兒中其他已知的CesA基因序列，利用Primer premier5.0軟件設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物(表1)，以cDNA第1條鏈為模板進(jìn)行基因中間片段的克隆.多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)體系：10×LA PCR Buffer Ⅱ(+Mg2+)5 μL，上游(CiCesA3-jb5＇)和下游(CiCesA3-jb3＇)引物各2 μL(10 μmol/L)，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)8 μL，模板1 μL，LA Taq酶0.5 μL，無(wú)菌水31.5 μL.引物退火溫度為58 ℃，PCR反應(yīng)條件依照TaKaRa LA Taq?說(shuō)明書(Cat#RR002B)設(shè)置.PCR反應(yīng)中所用到的rTaq酶、PrimeSTAR高保真酶、LA Taq酶及Marker DL5000均購(gòu)于TaKaRa.

表1 基因克隆與表達(dá)分析所用引物

通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，利用膠回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化(膠回收試劑盒采購(gòu)于天根生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司).將純化過的PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體(TaKaRa)相連接，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌Escherichiacoli感受態(tài)細(xì)胞DH5α，37 ℃培養(yǎng)9～12 h.藍(lán)白斑篩選后，使用移液槍挑取白色陽(yáng)性克隆菌落，溶于20 μL無(wú)菌水中并吹打混勻，取5 μL上述菌液為模板進(jìn)行菌落PCR.挑選成功擴(kuò)增出目的基因的陽(yáng)性克隆搖菌(37 ℃，200 r/min, 培養(yǎng)9～12 h)，取2 mL菌液送上海生工生物工程有限公司測(cè)序.

根據(jù)測(cè)序得到的部分基因序列設(shè)計(jì)RACE引物CiCesA3-rc5＇、CiCesA3-rc3＇(表1)，以中間錦雞兒cDNA為模板進(jìn)行RACE實(shí)驗(yàn)，具體操作按照SMARTerTM RACE cDNA Amplification kit試劑盒(TaKaRa)說(shuō)明書進(jìn)行.

1.4 CiCesA3基因cDNA全長(zhǎng)克隆

將RACE得到的序列與中間保守序列進(jìn)行拼接，獲得CiCesA3基因全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)特異性全長(zhǎng)引物CiCesA3-5＇和CiCesA3-3＇(表1)對(duì)拼接結(jié)果進(jìn)行PCR驗(yàn)證.PCR反體系：5×Primer STAR buffer(+Mg2+)10 μL，上、下游引物各2 μL(10 mol/L)，模板1 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，Primer STAR酶0.5 μL，無(wú)菌水補(bǔ)充至50 μL.引物退火溫度為62.3 ℃，PCR具體反應(yīng)條件根據(jù)PrimeSTAR HS DNA Polymerase說(shuō)明書(Cat#R010B)設(shè)置.

1.5 CiCesA3基因組織特異性表達(dá)分析

根據(jù)CiCesA3基因cDNA序列設(shè)計(jì)qRT-PCR特異性引物(表1)，并利用SYBR@Green I熒光染料，以中間錦雞兒幼苗的根、莖、葉cDNA為模板，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(羅氏Light Cycler480)中進(jìn)行CiCesA3基因組織特異性表達(dá)分析.內(nèi)參基因選擇中間錦雞兒延伸因子EF1α(elongation factor 1-alpha，EF1α).PCR具體反應(yīng)體系及反應(yīng)條件依照TaKaRa的SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)(Cat#RR420B).反應(yīng)結(jié)束后利用2-ΔCT算法分析數(shù)據(jù).

1.6 CiCesA3基因生物信息學(xué)分析

將基因序列輸入到NCBI Blastn(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站搜索并比對(duì)，推測(cè)其序列的完整性.使用Vector NTI Advance@ 11.5軟件拼接擴(kuò)增得到的3段序列.登錄ExPASy 網(wǎng)站后，分別利用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)、ProParam(http://web.expasy.org/protparam/)工具進(jìn)行預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的親疏水性、理論等電點(diǎn)與分子質(zhì)量的預(yù)測(cè).利用MEGA 5.0進(jìn)化分析軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.將氨基酸序列輸入到HNN網(wǎng)站中(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa)分析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu).同時(shí)在CBS網(wǎng)站中，通過TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線工具預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域的數(shù)量與位置.

2 結(jié)果與分析

2.1 CiCesA3基因克隆

從NCBI中下載大豆、楊樹、棉花等物種的纖維素合酶基因CesA3序列，分析這些序列的保守區(qū)域并根據(jù)保守區(qū)序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，以中間錦雞兒cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖1a).測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增得到基因中間片段序列長(zhǎng)度為2 287 bp，進(jìn)一步針對(duì)該中間片段設(shè)計(jì)引物，分別進(jìn)行3＇RACE和5＇RACE，電泳分別檢測(cè)到約700 bp(圖1b)和1 300 bp(圖1c)的擴(kuò)增產(chǎn)物.測(cè)序并將接頭序列剪切后，3＇RACE和5＇RACE擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為479 bp和1 198 bp.將擴(kuò)增獲得的3＇RACE、5＇RACE和中間片段進(jìn)行拼接得到中間錦雞兒CiCesA3基因.針對(duì)該基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，以cDNA為模板，利用RT-PCR擴(kuò)增驗(yàn)證拼接得到的全長(zhǎng)序列(圖2).測(cè)序結(jié)果表明CiCesA3基因cDNA全長(zhǎng)為3 475 bp.

a.中間保守區(qū)域克??；b. 3＇RACE；c.5＇RACE；M. DL 5 000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).圖1 CiCesA3基因克隆凝膠電泳分析Fig.1 Agarose gel analysis of CiCesA3 gene cloning

1，2.CiCesA3全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物；M. DL 5000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).圖2 CiCesA3基因全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增凝膠電泳分析Fig.2 Agarose gel analysis of CiCesA3 full-length cDNA cloning

2.2 CiCesA3基因序列分析

用ORF(open reading frame, ORF) finder分析該基因cDNA序列發(fā)現(xiàn)其具備完整的ORF，5＇UTR長(zhǎng)度為175 bp，3＇UTR長(zhǎng)度為76 bp， ORF長(zhǎng)度為3 225 bp，編碼1 075個(gè)氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA(圖3).將該基因序列輸入到NCBI Blast中進(jìn)行搜索發(fā)現(xiàn)，其和大豆GmCesA3基因相似度最高，故命名為CiCesA3.

小寫字母表示5＇UTR和3＇UTR.圖3 CiCesA3基因的cDNA及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.3 cDNA and deduced amino acid sequence of CiCesA3

2.3 CiCesA3蛋白理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分析

對(duì)CiCesA3基因所推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明該蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)是6.54，分子質(zhì)量約為119.89 ku.此外，利用ProtScale工具分析所推導(dǎo)蛋白序列的親疏水性.正值越大說(shuō)明該區(qū)域氨基酸越疏水，相反，負(fù)值越大表明該區(qū)域氨基酸越親水.分析發(fā)現(xiàn)第103、104位的谷氨酰胺(Gln)和天冬酰胺(Asn)具最低分值-3.244，親水性最強(qiáng)；第274位的精氨酸(Arg)則具最高分值3.2，疏水性最強(qiáng).多肽鏈中親水性氨基酸整體上分布較多，預(yù)示著該蛋白是親水的.同時(shí)還預(yù)測(cè)了CiCesA3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中，無(wú)規(guī)則卷曲占比最大，β折疊占比最小，α螺旋位于中間(表2).

表2 CiCesA3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

在TMHMM網(wǎng)站中預(yù)測(cè)了CiCesA3蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示該蛋白C端有6個(gè)跨膜區(qū)，具體氨基酸位置為851～873、885～907、922～944、970～992、1 002～1 024、1 037～1 056，此外N端第300個(gè)氨基酸位置附近也可能存在2個(gè)跨膜區(qū)(圖4).

圖4 CiCesA3蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.4 Predication of transmembrane domains of CiCesA3

2.4 CiCesA3基因的進(jìn)化分析

在NCBI BlastP中輸入中間錦雞兒CiCesA3氨基酸序列并進(jìn)行搜索，在搜索結(jié)果中下載擬南芥、大豆等物種的CesA序列進(jìn)行多重序列比對(duì).結(jié)果顯示CiCesA3與大豆及擬南芥CesA3的氨基酸序列相似度非常高(圖5)，其中，與野生大豆GsCesA3(KHN37622.1)和大豆GmCesA3(XP_003542849.1)的相似度分別達(dá)到94%和92%，與同為初生CesA蛋白的大豆GmCesA1(XP_003542849.1)的相似度也達(dá)到69%.

從Genebank中下載與CiCesA3氨基酸序列相似的其他物種的序列，采用ClustalW法進(jìn)行多重序列比對(duì)，在MEGA5.0軟件中進(jìn)行中間錦雞兒CiCesA3的系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖6).分析結(jié)果表明，CiCesA3與大豆GmCesA3、野生大豆GsCesA3親緣關(guān)系最近，相似度均達(dá)到92%以上.此外CiCesA3與同是初生壁蛋白的大豆GmCesA1、擬南芥AtCesA1的親緣關(guān)系相對(duì)較近，序列相似度達(dá)到60%以上.而與次生壁蛋白，如野生大豆GsCesA4、GsCesA8、大豆GmCesA4、GmCesA8-like、GmCesA7、擬南芥AtCesA4、AtCesA8的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn).

圖中從上至下依次為野生大豆、擬南芥、中間錦雞兒和大豆的序列.圖5 CiCesA3和其他植物CesAs氨基酸序列比對(duì)Fig.5 Alignment of amino acid sequences from CiCesA3 and other plant CesAs

采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；Bootstrap 設(shè)置為1 000次.圖6 CiCesA3與其他植物CesAs系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of CiCesA3 and other plant CesAs

2.5 CiCesA3基因的組織表達(dá)分析

為了探究CiCesA3基因表達(dá)的組織特異性，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了中間錦雞兒幼苗根、莖、葉中CiCesA3的表達(dá)情況.結(jié)果表明該基因在根、莖、葉中均有表達(dá)，但表達(dá)量各有不同，其中，在葉中表達(dá)最高，莖中次之，根中最低，葉中的表達(dá)量是根中的7倍多(圖7).

圖7 CiCesA3組織特異性表達(dá)檢測(cè)Fig.7 Gene expression analysis of CiCesA3 from different tissue by qRT-PCR

3 討論

纖維素作為植物細(xì)胞壁的主要組分，對(duì)植物細(xì)胞的形態(tài)建成起著至關(guān)重要的作用.隨著人類對(duì)自然資源的過度開發(fā)與利用，可再生資源的研究逐漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)，纖維素作為全球生物量巨大的可再生資源，正在被廣泛研究.中間錦雞兒不僅具有防風(fēng)固沙的生態(tài)價(jià)值，還具有重要的藥用、飼用及造紙價(jià)值.

本研究從中間錦雞兒中通過同源克隆、RACE技術(shù)獲得1個(gè)纖維素合酶基因——CiCesA3.序列分析表明該基因5＇UTR長(zhǎng)為175 bp，3＇UTR長(zhǎng)為76 bp，ORF長(zhǎng)度為3 225 bp，編碼1 075個(gè)氨基酸.CiCesA3蛋白預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為119.89 ku，是親水性蛋白.

植物細(xì)胞壁是保護(hù)、支撐細(xì)胞的主要結(jié)構(gòu)，分為初生壁和次生壁，構(gòu)成細(xì)胞壁的主要化學(xué)組分是半纖維素、纖維素以及木質(zhì)素.植物CesA基因常根據(jù)其表達(dá)時(shí)所具有的特定的時(shí)空性，被分為初生壁纖維素合酶基因和次生壁纖維素合酶基因[17-18].進(jìn)化分析結(jié)果表明，本研究中克隆得到的CiCesA3基因與次生壁CesA親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與同為初生壁CesA的AtCesA3和GmCesA3親緣關(guān)系更近.已有研究表明纖維素合酶是具有1個(gè)催化中心和多個(gè)跨膜區(qū)的典型細(xì)胞質(zhì)膜蛋白，中間錦雞兒CiCesA3蛋白具有D…D…D…QxxRW催化中心，且蛋白N端有2個(gè)跨膜區(qū)，C端有6個(gè)跨膜區(qū).

所有植物纖維素合酶基因都會(huì)參與纖維素的合成，同時(shí)有些家族成員還參與植物抵抗逆境脅迫的過程.由AtCesA1蛋白催化中心的1個(gè)氨基酸發(fā)生錯(cuò)義突變(D640N)形成的擬南芥突變體any1，表現(xiàn)出植株矮小、根及毛狀體變少的表型，而且CSC移動(dòng)速率和細(xì)胞壁結(jié)晶速度降低，但其纖維素總量和野生型并無(wú)差別[19].AtCesA3突變體mre1(G916E)植物根部細(xì)胞形狀改變且細(xì)胞分裂受到抑制，導(dǎo)致根及下胚軸變短變粗，同時(shí)還表現(xiàn)出纖維素含量降低、植株矮小的表型[20].此外，在煙草中表達(dá)AtCesA3ixr1-2基因使轉(zhuǎn)基因植物出現(xiàn)植株矮化、纖維素總量降低、次生壁纖維素雜亂沉積，同時(shí)對(duì)異惡草胺(isoxaben)耐受的表型[21].將擬南芥AtCesA6基因突變后發(fā)現(xiàn)，突變體植物纖維素含量降低，下胚軸和根變得又短又粗，而且植物根部皮層微管排列方向發(fā)生變化[22].二穗短柄草BrachypodiumdistachyonBdCesA4和BdCesA7基因突變后，植株變矮且開花延遲，同時(shí)細(xì)胞壁結(jié)晶纖維素合成減少，木質(zhì)部和韌皮部細(xì)胞的細(xì)胞壁變薄[23].在楊樹中過表達(dá)PtCesA8基因后，過表達(dá)植物出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯、枝條萎蔫、初生葉片變小、根系延伸受阻、細(xì)胞壁不規(guī)則和纖維素含量驟減等現(xiàn)象[24].

與擬南芥CesA1基因同源的花椰菜BrassicaoleraceaL.BoiCesA基因突變后，T3代植株葉片維管束細(xì)胞伸長(zhǎng)不足，植物可溶性糖和脯氨酸含量升高，而且表現(xiàn)出比野生型更加耐鹽的表型[25].擬南芥次生壁蛋白CesA4/ IRREGULAR XYLEM5 (IRX5)、 CesA7/ IRX3和CesA8/ IRX1依賴于乙烯、水楊酸和茉莉酸信號(hào)途徑負(fù)調(diào)控植物抗病過程，當(dāng)茄科雷爾氏菌Ralstoniasolanacearum或黃瓜枯萎菌Plectosphaerellacucumerina侵染植物后，這3個(gè)基因的突變體植株表現(xiàn)出比野生型更抗病的表型，但初生壁CesA蛋白(CesA1、CesA3和CesA6)并不參與這一過程[26].根據(jù)已有研究結(jié)果可推測(cè)，中間錦雞兒CiCesA3也可能同時(shí)參與了纖維素的合成與植物抵抗非生物或生物脅迫的過程，但還需進(jìn)一步地實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.