李世鵬，汪富文，史穎超，項門們，雷初朝，黨瑞華

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

隨著肉牛業(yè)的發(fā)展，市場對良種肉牛的需求不斷提高.中國的牛品種資源豐富，但多以役用為主，且培育程度較低，為了提高肉牛的生產(chǎn)性能，適應(yīng)社會及市場需求，中國育種工作者不斷利用常規(guī)育種技術(shù)及現(xiàn)代生物技術(shù)等手段進行肉牛品種的選育.目前已培育出多個生產(chǎn)性能優(yōu)異的肉牛品種，比如云嶺牛、夏南牛.云嶺牛作為中國第1個采用三元雜交方式培育、南方第1個擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的肉用牛品種[1]，其在2014年通過了國家畜禽遺傳資源委員會的現(xiàn)場審定[2]，2015年已經(jīng)被正式定為國家畜禽新品種[3].

云嶺牛是通過云南黃牛 (Yunnan Yellow)、莫累灰 (Murray Grey)和婆羅門牛 (Brahman) 雜交選育出來的[1]，具有耐熱抗蜱、抗病力強、生長發(fā)育快、飼料利用率高、性成熟早、難產(chǎn)率低、繁殖性能好等優(yōu)點.其肉口感優(yōu)良，鮮嫩多汁，市場價值極高，為南方肉牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展，特別是為高檔雪花牛肉生產(chǎn)奠定了良好的種源基礎(chǔ)[3].但是云嶺牛因育成時間較短，個體間表型差異較大，仍需要在生長發(fā)育，特別是體尺性狀方面繼續(xù)進行系統(tǒng)地選育，以發(fā)揮和提高種群的生產(chǎn)優(yōu)勢.借助分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)可以加快云嶺牛的選育，這對云嶺牛品種的發(fā)展及其遺傳資源的保護具有重要的意義.

HMG(high mobility group, HMG)蛋白由Goodwin等1973年在牛胸腺細胞中首次發(fā)現(xiàn)，因其在聚丙烯酰胺凝膠中具有高遷移率而得名.Bustin 將HMG 蛋白家族分為3 類：HMGA、HMGB 和HMGN，該家族成員皆有其特征性結(jié)構(gòu)域，發(fā)揮著不同的作用[4].HMGA2是HMGA家族成員之一，在許多生物胚胎期及分化程度相對較低的組織中表達量高，而在高度分化的組織器官中表達量極低[5].HMGA2基因定位于人類染色體12q13-15位點上[6]，含有5個外顯子和4個內(nèi)含子， 其中外顯子Ⅰ-Ⅲ分別編碼3個基本的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (AT鉤) ，外顯子Ⅳ編碼一段含有11個特定氨基酸的序列，這個特定序列在HMGA1上是缺失的，外顯子Ⅴ編碼酸性的C-末端結(jié)構(gòu)域，是多種磷酸化的位點[7].HMGA2蛋白本身沒有轉(zhuǎn)錄活性，可以通過AT-hooks與DNA結(jié)合,繼而改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，使之發(fā)生彎曲、拉伸、卷曲、成環(huán)或解鏈,進而影響DNA依賴的細胞核過程，比如基因的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、重組及DNA修復(fù)[8].

目前研究最多的是HMGA2基因與癌癥的關(guān)系以及抗癌藥物的研發(fā)，如HMGA2基因在肝癌[9]、胰腺癌[10]、結(jié)腸癌[11]、胃癌[12]、甲狀腺癌[13]、卵巢癌[14]、前列腺癌[15]和膽囊腺癌[16]等癌癥組織中的表達及臨床意義.由于HMGA2在動物的生長發(fā)育過程中也發(fā)揮作用，是肉牛生長發(fā)育潛在的相關(guān)基因，故本實驗以云嶺牛為研究對象，探究HMGA2基因多態(tài)并分析其與體尺性狀的關(guān)系.

1 材料和方法

1.1 實驗材料

本實驗以中國培育的第4個肉牛新品種云嶺牛個體(共計356個)作為實驗材料，樣品采集于云南昆明草地動物科學(xué)研究院.每個個體采集10 mL頸靜脈血樣至EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid)抗凝采血管中，震蕩混勻后保存，保存溫度-80 ℃.采集的血液樣本采用全血/組織/細胞基因組DNA快速提取試劑盒提取血液基因組DNA，試劑盒購于天根生物科技有限公司.使用NanoDropTM1000 Spectrometer(Thermo Fisher Scientific)檢測提取后的DNA質(zhì)量濃度及純度，并將其稀釋到50 ng/μL，置于4 ℃下備用.

采集血樣的同時對所采集的云嶺牛個體進行相關(guān)體尺數(shù)據(jù)的記錄，包括體高、體斜長、胸圍、腹圍、腰角寬、十字部高、 管圍、胸寬、胸深、臀圍、頭長、坐骨寬、額寬和尻長，以用于研究HMGA2基因的遺傳突變與云嶺牛體尺性狀之間的關(guān)系.

1.2 引物設(shè)計

根據(jù)西北農(nóng)林科技大學(xué)Animal Omics Database數(shù)據(jù)庫(http://animal.nwsuaf.edu.cn)，找到牛HMGA2基因的一部分InDel位點，挑選突變可能性較高的1個潛在位點(ARS-UCD1.2 5:47872723).根據(jù)數(shù)據(jù)庫信息 ，此位點上發(fā)生了15 bp的缺失(序列為TCCCTTTTTTGCGCC)，根據(jù)NCBI上Genebank提供的HMGA2基因序列(登錄號 NC_037332.1)，利用Primer Premier5.0對該突變位點進行引物設(shè)計(表1)，由上海生工生物有限公司合成.

表1 云嶺牛HMGA2基因InDel引物設(shè)計序列

1.3 PCR擴增體系及程序

引物合成完成后，取30個不同DNA樣本各1 μL混合制作云嶺牛的DNA池.本次實驗使用12.5 μL的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴增體系，體系組成為2×Taq Master Mix 6.25 μL，4.75 μL ddH2O,上游引物和下游引物各0.5 μL，模板DNA 0.5 μL.PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共計32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min,產(chǎn)物于4 ℃保存.完成后對擴增產(chǎn)物使用質(zhì)量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳進行產(chǎn)物檢測.PCR擴增產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序.

1.4 Indel位點比對和驗證

測序結(jié)果使用DNAstar比對分析，確定云嶺牛上存在這一突變，在HMGA2基因(登錄號NC_037332.1)的ARS-UCD1.2 5:47872723位置上存在15 bp的缺失，缺失序列為TCCCTTTTTTGCGCC，和預(yù)期結(jié)果相符.

1.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳分型及基因型記錄

將所有云嶺牛樣品分批次進行PCR擴增，PCR體系不變.擴增完畢后將產(chǎn)物利用質(zhì)量分數(shù)10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分型(200 V，120 min).使用Excel記錄所有的擴增結(jié)果的基因型.

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

利用Excel等軟件分析遺傳多態(tài)性的指標(biāo)，分別計算出基因型頻率和等位基因頻率.利用SHEsis在線軟件檢測實驗所用群體是否符合哈代-溫伯格平衡，使用MSRcall在線數(shù)據(jù)分析(www.msrcall.com/)進行群體遺傳學(xué)參數(shù)計算.利用SPSS20.0進行基因型和體尺性狀的關(guān)聯(lián)性分析,分析模型為Y=μ+a+b+c,其中Y代表個體表型記錄，μ代表群體均值，a代表年齡效應(yīng)，b代表標(biāo)記基因型效應(yīng)，c代表隨機誤差[17].

2 結(jié)果與分析

2.1 云嶺牛HMGA2突變位點分型與測序驗證

將所有云嶺牛樣本采用質(zhì)量分數(shù)10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分型，分型結(jié)果如圖1.野生型(II)為315 bp條帶，突變型(DD)為300 bp條帶，雜合型(ID)為315 bp 條帶和300 bp條帶，隨機各挑選1個樣本測序，測序結(jié)果和聚丙烯酰胺凝膠電泳分型結(jié)果一致(圖2).

圖1 HMGA2基因突變區(qū)域的PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of HMGA2 gene mutation region

圖2 15 bp缺失純合測序結(jié)果Fig.2 Sequencing result of 15 bp InDel

2.2 基因型頻率、等位基因頻率及遺傳參數(shù)估計

從統(tǒng)計數(shù)據(jù)(表2)可知，云嶺牛在InDel位點存在3種基因型，分別是II、ID、DD.其占據(jù)優(yōu)勢的等位基因是I. 經(jīng)檢驗，云嶺牛群體此位點不處于哈代-溫伯格平衡(P<0.05).對該云嶺牛群體進行遺傳參數(shù)估計可知此位點多態(tài)信息含量(polymorphism information content，PIC)在0.25～0.50,屬于中度多態(tài)(表3).

表2 云嶺牛HMGA2基因InDel位點基因型頻率和等位基因頻率分布

表3 云嶺牛HMGA2基因InDel位點群體遺傳學(xué)參數(shù)估計

2.3 InDel位點與體尺性狀的關(guān)聯(lián)性分析

對云嶺牛多態(tài)位點的基因型與體高、體斜長、胸圍、腹圍、腰角寬、十字部高、 管圍、胸寬、胸深、臀圍、頭長、坐骨寬、額寬和尻長的關(guān)聯(lián)分析表明，云嶺牛DD基因型的腹圍顯著低于II和ID基因型的腹圍(P<0.05),ID和DD基因型之間差異不顯著(表4).

表4 云嶺牛HMGA2基因InDel位點多態(tài)性與其體尺性狀關(guān)聯(lián)分析

3 討論

3.1 HMGA2基因群體遺傳參數(shù)分析

通過對群體遺傳參數(shù)的分析，可以檢測出目標(biāo)基因的遺傳多樣性和遺傳潛力.本實驗中云嶺牛的有效等位基因數(shù)為1.530 4，這表明該基因多態(tài)在云嶺牛群體中分布較為不均勻.PIC分析發(fā)現(xiàn)在云嶺牛群體中該位點PIC為0.285，介于0.25～0.50，屬于中度多態(tài)，說明該基因變異較大，有較大選擇余地.哈代-溫伯格平衡檢測，發(fā)現(xiàn)其在云嶺牛群體中不處于哈代-溫伯格平衡(P<0.05)，其占據(jù)遺傳優(yōu)勢的等位基因是I，這說明可能具有DD基因型的個體的部分經(jīng)濟性狀較低，在人工選擇過程中遭到了淘汰.這也說明了HMGA2基因?qū)τ谠茙X牛的生產(chǎn)性能可能具有重大的影響，在選育中具有參考價值.

3.2 HMGA2基因多態(tài)性與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

HMGA2基因在真核生物中大量存在，該基因轉(zhuǎn)錄編碼含109個氨基酸的蛋白質(zhì),是高遷移率蛋白超家族的成員之一,因其分子質(zhì)量小，且在凝膠電泳中遷移率高而得名.現(xiàn)有的大量研究發(fā)現(xiàn)HMGA2與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，HMGA2可以結(jié)合細胞周期蛋白基因的啟動子進而上調(diào)細胞周期蛋白的表達,加速細胞周期G2/M期的轉(zhuǎn)化,促使腫瘤發(fā)生[18].此前已有研究表明，在胚胎發(fā)育晚期和分化完全的成熟細胞、組織中幾乎測不到其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,HMGA2基因功能處于失活狀態(tài)[19]，但HMGA2在許多惡性腫瘤中呈高表達，HMGA2蛋白表達水平與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān).且已發(fā)現(xiàn)的所有哺乳動物的HMGA2蛋白具有同源性，它們都有相似的功能.在其他的動物如小鼠上，HMGA2的表達已被證實和骨髓間充質(zhì)干細胞的更新過程[20]及精子發(fā)生過程[21]有關(guān)；在雞的研究中，宋遲等[22]發(fā)現(xiàn)HMGA2在雞的基因組中存在SNP，且與其體質(zhì)量、周增質(zhì)量也存在一定關(guān)系；在豬上，李平華等[23]發(fā)現(xiàn)HMGA2可能與耳面積有一定聯(lián)系.基于上述研究，可以得知HMGA2可能和細胞分化、胚胎發(fā)育等生理過程以及腫瘤細胞的增殖轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，據(jù)此推測HMGA2基因的表達水平可能對牛的生長發(fā)育有重要影響.在此實驗中，本課題組根據(jù)西北農(nóng)林科技大學(xué)Animal Omics Database數(shù)據(jù)庫(http://animal.nwsuaf.edu.cn)進行了初步篩選，然后通過云嶺牛混池測序，在HMGA2基因的第3內(nèi)含子上發(fā)現(xiàn)了15 bp的缺失序列，雖然內(nèi)含子并不是編碼區(qū)，但是內(nèi)含子會通過順式作用元件來調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄.本研究中，將HMGA2基因的多態(tài)位點與云嶺牛的生長性狀進行關(guān)聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)該位點和云嶺牛生長性狀的腹圍指標(biāo)顯著相關(guān)，ID與II的腹圍指標(biāo)顯著高于DD(P<0.05).該突變可能通過增強或者抑制HMGA2基因的表達水平或者可變剪切來影響表達蛋白的能力，其作用機制有待進一步研究.

4 結(jié)論

本研究在HMGA2的第3內(nèi)含子上發(fā)現(xiàn)15 bp的缺失突變，此突變與云嶺牛的腹圍指標(biāo)顯著相關(guān)，可以作為云嶺牛生長性狀的候選分子標(biāo)記輔助進行選擇和育種.