黃航君，李依，馬林喜，馬偉偉，王俊麗

(中央民族大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081)

華北八寶Hylotelephiumtatarinowii(Maxim.)H. Ohba又稱華北景天，是景天科Crassulaceae八寶屬Hylotelephium的多年生草本植物，分布于山西、河北、內(nèi)蒙古等地，生長地的海拔高度為1 000～3 000 m，常見于向陽山石上[1].

作為一種優(yōu)良的香草植物，華北八寶可用于園林綠化和城市造景[2]，也可用做食品或飼料，或者提取精油.石進朝等[3]引種試驗結(jié)果表明，將生于高海拔的華北八寶引種到低海拔的地區(qū)，能正常生長.

華北八寶是典型的旱生植物.那冬晨等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫條件下，華北八寶葉綠素含量有所增加，并且能維持植物正常的光合作用.華北八寶可以通過可溶性蛋白的滲透調(diào)節(jié)作用來維持細胞的正常生長和代謝.那冬晨[5]研究了華北八寶抵抗干旱脅迫的機理.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫條件下，其可溶性糖和游離脯氨酸的含量沒有明顯變化，而可溶性蛋白的含量發(fā)生了明顯改變.

張璐等[6]對華北八寶進行了離體培養(yǎng)研究，誘導(dǎo)出了愈傷組織，建立了再生體系，并對黃酮類化合物的含量進行了測定.本研究以此為基礎(chǔ)，測定華北八寶愈傷組織在PEG脅迫下酶活性的變化，為研究其抗旱機制提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 植物材料

本實驗所用的華北八寶野生植株采自北京市門頭溝區(qū)的靈山(海拔高度為2 300 m).

1.2 華北八寶愈傷組織的誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)

選取葉片，先在流水下沖洗2 h，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇表面消毒30 s，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1% 的HgCl2消毒12 min，再用無菌水沖洗3～4次.以無菌葉片(0.5 cm×0.5 cm)為外植體，接種至MS(Murashige & Skoog) + 2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid) 2.0 mg/L + 6-BA(6-Benzyladenine ) 0.5 mg/L培養(yǎng)基上，在溫度為(25 ± 2) ℃、光照12 h/d、光強為2 000～3 000 lx的條件下進行愈傷組織的誘導(dǎo).30 d后將誘導(dǎo)出的愈傷組織再接種到同樣的培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng).

1.3 愈傷組織的PEG 6 000脅迫處理

采用PEG 6 000進行脅迫處理.將質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0(對照組)、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%、8.0%的PEG 6 000添加到MS + 2,4-D 2.0 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L中，將愈傷組織切成小塊(體積約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm)接種到含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6 000的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，每隔12 h進行取樣，每個處理組取樣10次.將所取樣品放到液氮中快速冷凍，之后保存于-80 ℃冰箱中.實驗重復(fù)3次.

1.4 酶的提取

分別取樣品0.2 g，置于預(yù)冷過的研缽內(nèi)，加入液氮研磨至粉末狀，依次加入0.6、0.5、0.5 mL的磷酸緩沖液(pH = 7.8，0.05 mol/L)，共計1.6 mL，轉(zhuǎn)入2 mL離心管中進行離心(4 ℃、12 000g下離心20 min)，上清液即為酶粗提液.

1.5 酶活性的測定

過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法進行測定[7].過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外分光光度法進行測定[7].超氧化物歧化酶(SOD)活性采用NBT光化還原法進行測定[7].

1.6 同工酶分析

1.6.1 酶液制備

稱取1.0 g低溫(-80 ℃)保存的愈傷組織，置于液氮預(yù)冷過的研缽中，加液氮研磨至粉末狀，轉(zhuǎn)入預(yù)冷過的離心管中，加入0.1 mol/L的磷酸緩沖液，充分震蕩，離心10 min(4 ℃、12 000 r/min)，取上清液，置于-20 ℃冰箱中保存，備用.

1.6.2 電泳分析

采用Bradford蛋白定量試劑盒，推算出每個樣品的蛋白濃度和上樣量.聚丙烯酰胺凝膠電泳開始電壓為120 V，當(dāng)樣品進入分離膠時，將電壓調(diào)為100 V. POD酶采用改良聯(lián)苯胺法進行染色，SOD酶采用氮藍四唑(NBT)法進行染色，酯酶(EST)采用醋酸-α-萘酯和堅牢藍染色.

本實驗使用凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc XR+)對實驗結(jié)果進行處理，所用軟件為Image Lap 4.0.1，對電泳條帶進行相對定量地分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG 6 000脅迫下愈傷組織中POD酶活性的變化

采用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6 000進行脅迫，愈傷組織中POD酶活性變化有所不同，如圖1所示.

區(qū)縣級電視臺不重視優(yōu)秀人才培養(yǎng)，在制作電視專題節(jié)目時往往缺乏相應(yīng)的獎罰機制，沒有將地區(qū)優(yōu)點以及特色體現(xiàn)出來，在節(jié)目題材選擇上存在缺乏吸引力的狀況，其所使用的多媒體技術(shù)以及相應(yīng)的節(jié)目制作技術(shù)還存在著很大的提升空間，在宣傳方式和制作內(nèi)容上都還需要進一步提高。

圖1 PEG 6 000脅迫下愈傷組織中POD酶活性的變化Fig.1 POD activity of callus under the stress of PEG 6 000

從圖1中可以看出，在PEG 6 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0時，POD酶的活性隨著處理時間的延長基本保持不變.在PEG 6 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%～5.0%時，隨著PEG 6 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加和脅迫時間的延長，POD酶活性升高.在PEG 6 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%～2.0%時，愈傷組織生長良好，質(zhì)地緊實，呈綠色.當(dāng)PEG 6 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高到5.0%時，愈傷組織輕微白化.當(dāng)PEG 6 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到8.0%時，POD酶活性在24 h內(nèi)升高之后逐漸下降.愈傷組織白化現(xiàn)象加重，變軟，呈現(xiàn)水漬狀.

2.2 PEG 6 000脅迫下愈傷組織中CAT酶活性的變化

PEG 6 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同，脅迫處理后愈傷組織中CAT酶活性變化各不相同，如圖2所示.

圖2 PEG 6 000脅迫下愈傷組織中CAT酶活性的變化Fig.2 CAT activity of callus under the stress of PEG 6 000

從圖2中可以看出，在PEG 6 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0時，CAT酶的活性隨著處理時間的延長基本保持不變.在PEG 6 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%～5.0%時，隨著PEG 6 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加和脅迫時間的延長，CAT酶活性升高.當(dāng)PEG 6 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到8.0%時，CAT酶活性在24 h內(nèi)升高，之后急劇下降，在處理108 h時，CAT酶活性低于20 U/g.

2.3 PEG 6 000脅迫下愈傷組織中SOD酶活性的變化

在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6 000脅迫下SOD酶活性變化如圖3.從圖3可看出，在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6 000脅迫下，SOD酶活性變化與CAT相類似.當(dāng)PEG 6 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到8.0%時，SOD酶活性先升高，24 h之后急劇下降，在處理108 h時，SOD酶活性約為10 U/g.

圖3 PEG 6 000脅迫下愈傷組織中SOD酶活性的變化Fig.3 SOD activity of callus under the stress of PEG 6 000

2.4 PEG 6 000脅迫下愈傷組織中POD同工酶的表達

在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6 000脅迫下POD酶的酶譜如圖4.

PEG 6 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為a．0；b．0.5%；c．1.0%；d．2.0%； e．5.0%； f．8.0%.每張圖譜從左至右脅迫時間依次為0、12、24、36、48、60、72、84、96、108 h.圖4 PEG 6 000脅迫下愈傷組織中POD同工酶的表達Fig.4 Expression of POD isozymes under the stress of PEG 6 000

使用Image Lap4.0.1對圖片進行處理，以PEG 6 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、脅迫0 h時的表達量定為1.00，得出所有條帶的相對表達量.在PEG 6 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0～1.0%時共檢測出5條條帶，且每條條帶的相對表達量變化情況基本一致，說明質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低的PEG 6 000脅迫作用不明顯；在PEG 6 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%和5.0%時共檢測出6條條帶，條帶4、5、6的相對表達量在0 h時分別為0.89、0.27、1.57和0.90、0.70、2.64，在108 h時分別升高為2.45、1.07、5.04和2.55、1.54、4.97；在PEG 6 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.0%時，條帶1、2和5的相對表達量都逐漸降低，在96～108 h時不再表達.在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.0%的PEG 6 000脅迫下，愈傷組織不能正常生長.

2.5 PEG 6 000脅迫下愈傷組織中SOD同工酶的表達

在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6 000脅迫下SOD酶的酶譜如圖5.使用Image Lap4.0.1對圖片進行處理，得出所有條帶的相對表達量.

PEG 6 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為a. 0；b．0.5%；c．1.0%；d．2.0%； e．5.0%； f．8.0%.每張圖譜從左至右脅迫時間依次為0、12、24、36、48、60、72、84、96、108 h.圖5 PEG 6 000脅迫下愈傷組織中SOD同工酶的表達Fig.5 Expression of SOD isozymes under the stress of PEG 6 000

2.6 PEG 6 000脅迫下愈傷組織中酯酶(EST)同工酶的表達

在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG 6 000脅迫下EST酶譜如圖6.使用Image Lap4.0.1對圖片進行處理，得出所有條帶的相對表達量.

PEG 6 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為a． 0；b． 0.5%；c．1.0%；d．2.0%； e．5.0%； f．8.0%.每張圖譜從左至右脅迫時間依次為0、12、24、36、48、60、72、84、96、108 h.圖6 PEG 6 000脅迫下愈傷組織中EST同工酶的表達Fig.6 Expression of EST isozymes under the stress of PEG 6 000

從圖6中可以看出，在愈傷組織中檢測出2條EST同工酶條帶.在不受PEG 6 000脅迫時，愈傷組織中條帶1、2的相對表達量基本保持在1.00和 1.16.在PEG 6 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%～5.0%的脅迫條件下，隨著脅迫時間延長和脅迫程度的加大，2條條帶的相對表達量均有所升高.在PEG 6 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.0%時，2條條帶在24 h后未檢測到表達.

3 討論

已有研究表明，環(huán)境脅迫會引起抗氧化系統(tǒng)酶如SOD和CAT等酶活性的改變[8-10].蔡小東等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍的PEG 6 000脅迫下，隨著脅迫時間的延長和脅迫程度的加大，柑橘愈傷組織中POD、SOD和CAT酶活性不斷升高，在PEG 6 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%時，酶活性達到最大值.當(dāng)PEG 6 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于15%時，3種酶的酶活性隨著PEG 6 000質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而逐漸降低.這3種酶活性的變化趨勢基本上與本研究的結(jié)果相類似.褚妍[12]研究發(fā)現(xiàn)，用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG 6 000脅迫處理水稻愈傷組織，SOD、POD和CAT 3種酶對PEG 6 000處理后的響應(yīng)方式和響應(yīng)強度都不同.

干旱脅迫對植物造成的傷害是由于活性氧的積累而導(dǎo)致的膜透性增加和質(zhì)膜損傷，抗氧化系統(tǒng)酶在活性氧清除中發(fā)揮重要作用.在不同的脅迫環(huán)境下，植物愈傷組織都會有耐受極限，在一定的范圍內(nèi)，脅迫可以誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生過量同工酶來適應(yīng)脅迫環(huán)境.反之，如果脅迫程度超出植物的耐受極限，就會使同工酶表達異常，愈傷組織不能正常生長.