盧超，陳景鮮，王國(guó)霞，陳剛，李春閣，王會(huì)魚

(鄭州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州，450044)

蛋白酶根據(jù)其最適pH可分為酸性、中性和堿性3種，因此，中性蛋白酶是一類能夠在pH=6.5～7.5的環(huán)境中催化蛋白質(zhì)發(fā)生水解，產(chǎn)生游離氨基酸和多肽片段的酶的總稱[1-3]。中性蛋白酶是很早就在工業(yè)生產(chǎn)中使用的蛋白酶類，廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥、洗滌、化妝品、紡織等行業(yè)[4-7]。中性蛋白酶的廣泛使用是由于其作為天然生物酶制劑，具有催化條件溫和，催化速率高，無(wú)工業(yè)污染等特點(diǎn)，與一般的化學(xué)添加劑相比，對(duì)人和動(dòng)物更加安全可靠[8]。目前，生產(chǎn)中性蛋白酶的微生物主要包括細(xì)菌、霉菌、酵母和放線菌等[9]。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是一類需氧型的革蘭氏陽(yáng)性菌，在土壤、海洋、動(dòng)物、植物中廣泛存在[10]。同時(shí)，枯草芽孢桿菌具有易于存活、生長(zhǎng)繁殖快，無(wú)致病性的特點(diǎn)，能夠分泌蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、葡聚糖酶、植酸酶、果膠酶等十幾種酶[11-15]。因此，枯草芽孢桿菌在改善腸道菌群、調(diào)節(jié)免疫力、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、改善脂類代謝等方面都有廣泛應(yīng)用[16-18]。本實(shí)驗(yàn)室前期分離出1株具有高產(chǎn)中性蛋白酶潛力的枯草芽孢桿菌L07，本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)枯草芽孢桿菌L07產(chǎn)中性蛋白酶的能力進(jìn)行考察，以碳源、氮源、吐溫-80、初始pH、MgSO4、種子液添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間為條件進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)分析，再通過(guò)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken實(shí)驗(yàn)響應(yīng)面分析，最終確定枯草芽孢桿菌L07產(chǎn)中性蛋白酶的最優(yōu)發(fā)酵條件。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)L07由本實(shí)驗(yàn)室前期篩選并保藏，實(shí)驗(yàn)所用試劑為市售分析純。

種子培養(yǎng)基(g/100mL)：NaCl 1、牛肉膏1、蛋白胨1，pH 7.0，高溫高壓滅菌后在30 ℃條件下振蕩培養(yǎng)到A600=1.0為制備種子液；

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/100mL)：蔗糖5、蛋白胨5、MgSO40.1、吐溫-80 0.1 mL/100mL、pH 6.8，高溫高壓滅菌后加入種子液3 mL/100mL，在30 ℃環(huán)境下振蕩培養(yǎng)36 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 中性蛋白酶酶活力的測(cè)定

各組發(fā)酵結(jié)束后，4 ℃離心取上清，即得待測(cè)發(fā)酵粗酶液。參考GB/T 23527—2009，采用Folin-酚法進(jìn)行蛋白酶酶活力的測(cè)定[19-21]。在pH 7.2、40 ℃的條件下1 mL粗酶液1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸定義為1個(gè)活力單位(U)，以U/mL表示,如公式(1)所示:

中性蛋白酶活力(U/mL)=A×N×4/10

(1)

式中：A為由吸光度對(duì)應(yīng)的酪氨酸微克數(shù)；4為反應(yīng)總體積；10為反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)；N為稀釋倍數(shù)。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)分析

1.2.2.1 蔗糖、蛋白胨添加量對(duì)菌種產(chǎn)中性蛋白酶的影響

分別在編號(hào)1～7的7個(gè)新配置基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入終質(zhì)量濃度為8、10、12、14、16、18、20 g/100mL的蔗糖溶液，其余按上述基本培養(yǎng)基的成分和條件進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行酶活力測(cè)定。

分別在編號(hào)1～7的7個(gè)新配置基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入終質(zhì)量濃度為6、9、12、15、18、21、24 g/100mL的蛋白胨，其余按上述基本培養(yǎng)基的成分和條件進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行酶活力測(cè)定。

1.2.2.2 吐溫-80、初始pH對(duì)菌種產(chǎn)中性蛋白酶的影響

分別在編號(hào)1～7的7個(gè)新配置基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入終濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL/100mL的吐溫-80，其余按上述基本培養(yǎng)基的成分和條件進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行酶活力測(cè)定。

分別將編號(hào)1～7的7個(gè)新配置基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整初始pH至6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8，其余按上述基本培養(yǎng)基的成分和條件進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行酶活力測(cè)定。

1.2.2.3 MgSO4、種子液添加量對(duì)菌種產(chǎn)中性蛋白酶的影響

分別在編號(hào)1～7的7個(gè)新配置基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入終質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 g/100mL的MgSO4，其余按上述基本培養(yǎng)基的成分和條件進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行酶活力測(cè)定。

分別在編號(hào)1～7的7個(gè)新配置基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入終濃度為3、5、7、9、11、13、15 mL/100mL的種子培養(yǎng)液，其余按上述基本培養(yǎng)基的成分和條件進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行酶活力測(cè)定。

1.2.2.4 發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌種產(chǎn)中性蛋白酶的影響

配制編號(hào)1～7的7個(gè)新配置基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別置于30、32、34、36、38、40、42 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，其余按上述基本培養(yǎng)基的成分和條件進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后取培養(yǎng)液進(jìn)行酶活力測(cè)定。

配制編號(hào)1～7的7個(gè)新配置基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)40、44、48、52、56、60、64 h，其余按上述基本培養(yǎng)基的成分和條件進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后取培養(yǎng)液進(jìn)行酶活力測(cè)定。

1.2.3 Packett-Burman實(shí)驗(yàn)分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Packett-Burman設(shè)計(jì)法，對(duì)蔗糖(A)、蛋白胨(B)、吐溫-80(C)、初始pH(D)、MgSO4(E)、接種量(F)、發(fā)酵溫度(G)、發(fā)酵時(shí)間(H)這8個(gè)影響菌種產(chǎn)中性蛋白酶的實(shí)驗(yàn)因素進(jìn)行探究，從中確定出3個(gè)相對(duì)較顯著的影響因子，以便進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。這8個(gè)影響因子分別取高低2個(gè)水平，以發(fā)酵液的中性蛋白酶活力為單一響應(yīng)值，Packett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因子和水平如表1所示。

1.2.4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)分析

根據(jù)上一步Packett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選得出的3個(gè)顯著因子，參考各個(gè)顯著因子的正負(fù)效應(yīng)值，確定最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的適當(dāng)步長(zhǎng)。以最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果的最大響應(yīng)值作為下一步Box-Behnken實(shí)驗(yàn)分析的中心點(diǎn)。

1.2.5 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)分析

根據(jù)Packett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選得出的3個(gè)顯著因子，最陡爬坡實(shí)驗(yàn)得出3個(gè)顯著因子的質(zhì)量濃度范圍，利用Design-Expert 8.0.5軟件進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 蔗糖、蛋白胨添加量對(duì)菌種產(chǎn)中性蛋白酶的影響

碳源在微生物的生長(zhǎng)過(guò)程中普遍發(fā)揮著重要的作用，而氮源添加量則對(duì)微生物合成蛋白質(zhì)和產(chǎn)酶有重要影響。本實(shí)驗(yàn)選擇蔗糖作為碳源、蛋白胨作為氮源，兩者添加量對(duì)菌種產(chǎn)中性蛋白酶的影響如圖1所示。由圖1可知，當(dāng)蔗糖的添加量從8 g/100mL上升到16 g/100mL時(shí)，枯草芽孢桿菌L07產(chǎn)酶活力呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)，而在培養(yǎng)基中蔗糖含量在16～20 g/100mL階段時(shí)，出現(xiàn)了相對(duì)明顯的下降。當(dāng)?shù)鞍纂说奶砑恿繌? g/100mL上升到15 g/100mL時(shí)，枯草芽孢桿菌L07產(chǎn)酶活力呈現(xiàn)明顯上升的趨勢(shì)，而在培養(yǎng)基中蔗糖含量在15～24 g/100mL階段時(shí)，出現(xiàn)了明顯的下降。

圖1 蔗糖和蛋白胨添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.1.2 吐溫-80、初始pH對(duì)菌種產(chǎn)中性蛋白酶的影響

吐溫-80作為微生物發(fā)酵常見(jiàn)的表面活性劑，可能在調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的通透性上有積極的作用。吐溫-80、初始pH對(duì)菌種產(chǎn)中性蛋白酶的影響如圖2所示。當(dāng)吐溫-80的添加量從0.1 mL/100mL上升到0.4 mL/100mL時(shí)，枯草芽孢桿菌L07產(chǎn)酶活力呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)，而隨著吐溫-80在培養(yǎng)基中含量增高，培養(yǎng)基中酶活力出現(xiàn)了相對(duì)明顯的下降。而當(dāng)培養(yǎng)基中的初始pH從6.6調(diào)整到7.8的過(guò)程中，枯草芽孢桿菌L07產(chǎn)酶活力呈現(xiàn)一個(gè)起伏的趨勢(shì)。

圖2 吐溫-80和初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.1.3 MgSO4、種子液添加量對(duì)菌種產(chǎn)中性蛋白酶的影響

無(wú)機(jī)鹽可以調(diào)節(jié)微生物的生長(zhǎng)過(guò)程中細(xì)胞膜的滲透壓，而Mg2+作為許多蛋白酶的輔助因子，對(duì)維持酶的催化性有重要作用。由圖3可知，當(dāng)MgSO4的添加量從0.2 g/100mL上升到0.4 g/100mL時(shí)，枯草芽孢桿菌L07產(chǎn)酶活力呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，而在培養(yǎng)基中MgSO4含量繼續(xù)增加到1.4 g/100mL時(shí)，培養(yǎng)基中酶活力出現(xiàn)了相對(duì)明顯的下降。當(dāng)培養(yǎng)基中的種子液含量從3 mL/100mL上升到13 mL/100mL時(shí)，枯草芽孢桿菌L07產(chǎn)酶活力呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)，而在培養(yǎng)基中種子培養(yǎng)液繼續(xù)增加到15 mL/100mL，酶活力下降。

圖3 MgSO4和接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.1.4 發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌種產(chǎn)中性蛋白酶的影響

發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間能夠影響微生物的動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)過(guò)程和代謝過(guò)程。由圖4可知，當(dāng)發(fā)酵溫度從30 ℃上升到38 ℃的時(shí)候，枯草芽孢桿菌L07產(chǎn)酶活力呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)，發(fā)酵溫度繼續(xù)升到42 ℃的時(shí)候，酶活力出現(xiàn)了相對(duì)較快下降。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間從40 h持續(xù)增加到60 h期間，枯草芽孢桿菌L07產(chǎn)酶活力呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)，繼續(xù)發(fā)酵到64 h時(shí)，發(fā)酵

圖4 發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

液中酶活力下降。

2.2 Packett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Minitab 17軟件進(jìn)行Packett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。Packett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，Packett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析如表2所示。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

對(duì)表1所列的Packett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析得到回歸模型方程：Y=160.11-4.58A+21.07B+1.73C+6.47D-19.29E+36.40F+6.86G+15.54H。該模型R2=0.985 3，說(shuō)明模型顯著，擬合良好。根據(jù)表2所列的方差分析結(jié)果可知，8個(gè)影響因子的顯著性排序?yàn)镕(接種量)>B(蛋白胨)>E(MgSO4)>H(發(fā)酵時(shí)間)>G(發(fā)酵溫度)>D(初始pH)>A(蔗糖)>C(吐溫-80)，且F(接種量)、B(蛋白胨)、E(MgSO4)3個(gè)因子的添加量在8個(gè)因子中最顯著。因此確定接種量、蛋白胨、MgSO4這3個(gè)因子進(jìn)行下一步的最陡爬坡實(shí)驗(yàn)。

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯著性分析

2.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)分析

根據(jù)表1的Packett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在最陡爬坡實(shí)驗(yàn)中將4個(gè)不顯著因子維持相對(duì)較低水平。對(duì)于Packett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選得出的接種量、蛋白胨和MgSO43個(gè)最顯著因子，參考這3個(gè)因子的效應(yīng)值可知，接種量和蛋白胨含量對(duì)產(chǎn)酶的影響為正效應(yīng)，MgSO4含量對(duì)產(chǎn)酶的影響為負(fù)效應(yīng)。因此在最陡爬坡實(shí)驗(yàn)中需要逐步升高接種量和蛋白胨含量，降低MgSO4的含量。

最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示，隨著接種量、蛋白胨和MgSO4三個(gè)因子在發(fā)酵液中含量的變化，枯草芽孢桿菌L07產(chǎn)酶呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。最陡爬坡實(shí)驗(yàn)中最優(yōu)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為第4組，即接種量為13 mL/100mL、蛋白胨質(zhì)量濃度為15 g/100mL，MgSO4質(zhì)量濃度為0.4 g/100mL，以此質(zhì)量濃度為中心點(diǎn)進(jìn)行下一步Box-Behnken實(shí)驗(yàn)分析。

表3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

2.4 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)分析

根據(jù)前面Packett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選得出的3個(gè)顯著因子，最陡爬坡實(shí)驗(yàn)得出3個(gè)顯著因子的濃度范圍，利用Design-Expert 8.0.5軟件進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，結(jié)果如表4、5所示。

表4 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

表5 回歸模型的方差分析結(jié)果

通過(guò)Design-Expert 8.0.5軟件得到接種量、蛋白胨和MgSO4含量3個(gè)因子之間的模型響應(yīng)曲面圖如圖5所示。由圖5可知，當(dāng)?shù)鞍纂撕恳欢〞r(shí)，隨著種子液含量升高，發(fā)酵液中性蛋白酶活力呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)，這可能是由于隨著菌體的生長(zhǎng)繁殖，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分消耗在加速，同時(shí)溶氧供應(yīng)不足從而影響了中性蛋白酶的合成。此外，大量菌體分泌代謝產(chǎn)物的迅速增多可能會(huì)導(dǎo)致反饋抑制。當(dāng)接種量一定時(shí)，適當(dāng)?shù)腗g2+能夠增加菌體細(xì)胞膜的通透性和滲透壓，有利于中性蛋白酶的合成和釋放，而當(dāng)無(wú)機(jī)鹽離子質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)，可能會(huì)影響菌體的正常生長(zhǎng)代謝。同時(shí)，蛋白胨為枯草芽孢桿菌L07的產(chǎn)酶提供了重要的氮源，而當(dāng)?shù)鞍纂嗽诎l(fā)酵液中超過(guò)一定質(zhì)量濃度的時(shí)候，可能會(huì)影響發(fā)酵液的通透性和溶氧量，從而影響菌種的產(chǎn)酶。綜上所述，根據(jù)建立的數(shù)學(xué)模型分析，3個(gè)影響因子在A=0.19、B=0.15、C=-0.065時(shí)，有最佳產(chǎn)酶響應(yīng)值。換算為接種量在13.4 mL/100mL、蛋白胨含量在15.3 g/100mL、MgSO4含量在0.39 g/100mL條件下，此時(shí)枯草芽孢桿菌L07產(chǎn)中性蛋白酶活力值預(yù)測(cè)將達(dá)到401.005 U/mL。

a-接種量和蛋白胨對(duì)中性蛋白酶活力的影響；b-接種量和MgSO4對(duì)中性蛋白酶活力的影響；c-蛋白胨和MgSO4對(duì)中性蛋白酶活力的影響圖5 各因素對(duì)產(chǎn)酶影響的響應(yīng)曲面圖

為了驗(yàn)證該模型的準(zhǔn)確性和實(shí)用性，按照上述的預(yù)測(cè)發(fā)酵條件進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果測(cè)得枯草芽孢桿菌L07產(chǎn)中性蛋白酶活力分別為402.13、401.25、401.83 U/mL。3次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的平均值為401.74 U/mL，與理論預(yù)測(cè)值401.005 U/mL非常貼近，說(shuō)明該模型有良好的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。

3 結(jié)論

本文通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)、Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)枯草芽孢桿菌L07產(chǎn)中性蛋白酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。得到最佳發(fā)酵條件為蔗糖10 g/100mL、蛋白胨15.3 g/100mL、吐溫-80為0.2 mL/100mL、初始pH 6.8、MgSO40.39 g/100mL、接種量13.4 mL/100mL、發(fā)酵溫度32 ℃、發(fā)酵時(shí)間44 h，在此發(fā)酵條件下理論預(yù)測(cè)枯草芽孢桿菌L07產(chǎn)中性蛋白酶酶活力為401.005 U/mL，實(shí)測(cè)值達(dá)到401.83 U/mL，比最初優(yōu)化前133.42 U/mL提高了2.01倍。