湯嘉慧,郭全友,鄒咪,謝晨,熊澤語,包海蓉,3,4*
1(上海海洋大學 食品學院,上海,201306)2(中國水產(chǎn)科學研究院 東海水產(chǎn)研究所,上海,200090)3(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術研究中心,上海,201306)4(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海),上海,201306)
隨著社會的不斷發(fā)展,消費者對飲食的要求不斷在改變,低脂肪高蛋白的肉類受到許多人的青睞,消費者對魚和魚糜制品的需求不斷增加。一些小雜魚由于大小、風味、質地或顏色等因素未被充分利用,但是通過魚糜技術和重組技術,這些低值魚都可以轉化為高價值產(chǎn)品。
魚糜是把魚肉切碎后連續(xù)洗滌而獲得的濃縮的肌原纖維蛋白。在這一系列過程中,魚肉中的肌漿蛋白和脂肪、色素以及一些不受歡迎的氣味物質會被去除。但是,某些魚類制作成的魚糜,特別是一些小雜魚混合制作成的魚糜,它們的凝膠性能通常比較差。卡拉膠是從某些種類的紅海藻中提取獲得的天然多糖,它們主要以3種形式存在:κ-卡拉膠、ι-卡拉膠和λ-卡拉膠。其中,κ-卡拉膠主要通過從熱帶海藻——長心卡帕藻中提取而獲得。因為κ-卡拉膠具有理想的穩(wěn)定、增稠等特性,近年來受到越來越多的關注,在符合使用標準的前提下被廣泛應用于化妝品、食品加工和藥品領域??ɡz是天然膠體中唯一具有蛋白質反應性的膠體,添加卡拉膠可以顯著提高豬肉肌原纖維蛋白的乳化能力、凝膠硬度、彈性和保水性[1]。從天然的長心卡帕藻中提取出的κ-卡拉膠凝膠強度通常比較低,而一些陽離子,比如Ca2+、NH4+、K+等能提高κ-卡拉膠凝膠化的能力[2],形成硬且脆的凝膠,其中K+對κ-卡拉膠的影響最明顯。趙春波等[3]用部分KCl代替NaCl,發(fā)現(xiàn)豬肉腸的保水率隨著添加量的增加而增加。豬肉肌球蛋白的凝膠強度和持水性隨著κ-卡拉膠/K+凝膠體系添加量的增加而提高,凝膠空間網(wǎng)絡結構變得更加緊密并且表面粗糙程度降低[4]。隨著K+添加量的增加,卡拉膠-豬肉肌原纖維蛋白混合凝膠的硬度、黏著性、彈性和黏聚性有不斷減小的趨勢[5]。雖然已有部分κ-卡拉膠/K+凝膠體系對肉制品影響的研究,但主要集中在豬肉和雞肉制品中,對于魚糜類制品的研究依然不足并且不深入。肉制品中卡拉膠的添加量通常為0.5%~1.0%[6]。尚一平[7]研究發(fā)現(xiàn),添加量從0.2%開始,香腸的硬度隨著添加量的增加而增大。添加量在0.2%~0.4%時,硬度的增長最快,而添加量為0.4%~0.6%時,硬度的增長稍趨平緩,但仍在上升。添加過量的卡拉膠會降低肉制品的感官品質,同時有研究表明,過量的卡拉膠對人體健康會產(chǎn)生影響。因此,本實驗選擇0.4%、0.7%、1.0%(均為質量分數(shù))3個不同添加量,探究κ-卡拉膠/K+凝膠體系是否會對雜魚魚糜的凝膠強度、持水性、微觀結構、蛋白質二級結構和流變等性質產(chǎn)生影響,從宏觀和微觀不同角度分析并探究其機制,從而為魚糜類重組產(chǎn)品的生產(chǎn)加工提供理論性的指導和建議。
冷凍魚糜,2019年購于石獅正源水產(chǎn)科技開發(fā)有限公司;NaCl、KCl等(分析純),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;κ-卡拉膠,梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司。
低溫培養(yǎng)箱(LRH-100 CL),上海一恒;流變儀(MCR301),奧地利安東帕;分析天平(AL104-IC),梅特勒-托利多;電子分析天平(FA2004),南京東邁;質構儀(TA.XT Plus),英國SMS;臺式高速冷凍離心機(H1850R),湘儀集團;鹵素水分測定儀(HB43-S),梅特勒-托利多;傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet iS20),賽默飛世爾;切碎機(QSJ-B02R1),小熊電器;場發(fā)射掃描電子顯微鏡(S-4800),日本日立。
1.3.1 魚糜凝膠的制備
制備魚糜凝膠參考ZHANG等[8]的方法并進行適當修改。將冷凍魚糜從-60 ℃冰箱轉移到4 ℃低溫培養(yǎng)箱中放置2~3 h,直到中心溫度達到-5 ℃左右。將魚糜切成小塊后,放入切碎機中攪拌3 min,再與3.0% NaCl混合均勻后攪拌4 min。分別加入0.4%、0.7%和1%(均為質量分數(shù))的κ-卡拉膠或0.4%、0.7%和1%(均為質量分數(shù))的κ-卡拉膠+KCl[m(κ-卡拉膠):m(KCl)=10∶3]混合均勻后攪拌1 min。最后加入冰水調節(jié)最終水分含量至80 %,然后攪拌1 min。在整個攪拌的過程中,將切碎機置于碎冰中,控制溫度低于10 ℃。將攪拌后的魚糜漿裝入直徑為2.5 cm的離心管中,離心(4 ℃,1 000×g,3 min),去除魚糜漿中的氣泡。把離心后的魚糜漿在90 ℃下加熱30 min后放入碎冰中冷卻30 min,置于4 ℃低溫培養(yǎng)箱中保存直至測試。
1.3.2 凝膠強度測定
魚糜凝膠的破斷力(breaking force,BF)和斷裂形變(breaking deformation,BD)通過質構儀進行測定,測定方法參考BENJAKUL等[9]的方法并進行適當修改。在分析前,把魚糜凝膠切成2.5 cm直徑和2.5 cm高度的圓柱體,在室溫(25 ℃)下平衡30 min。將圓柱體的魚糜凝膠放置于配備有P/5S球形探頭的質構儀中,以恒定(60 mm/min)的下降速度垂直地壓入凝膠樣品的切割表面,下壓高度為15 mm,觸發(fā)力為5 g。通過力-形變曲線可以獲得第1次力的峰值即為破斷力,通過力-形變曲線可以獲得起點和第1次力的峰值點的距離即為斷裂形變BD(mm)。凝膠強度(gel strength,GS)的計算如公式(1)所示[9]:
GS/(g·mm)=BF×BD
(1)
1.3.3 持水性測定
持水性(water holding capacity,WHC)測定:將魚糜凝膠切成5 mm左右薄片,稱重(M1)后用雙層濾紙包裹,離心(4 ℃,2 600×g,10 min),離心后的樣品稱重(M2)。持水性計算如公式(2)所示[10]:
(2)
式中:M1,樣品的初始質量,g;M2,樣品離心后的質量,g。
1.3.4 溫度掃描測定
參考MORENO等[11]的方法作適當修改。將魚糜漿放到配備有平行板(直徑50.0 mm;間隙1.0 mm)的流變儀上來測量動態(tài)黏彈性參數(shù),即儲能模量(G′)與溫度(T)的關系。用硅油覆蓋樣品,減少水分蒸發(fā)。溫度為20~85 ℃,加熱速率是1 ℃/min,頻率和應變分別為0.1 Hz和1%[12]。
1.3.5 傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,F(xiàn)TIR)
使用傅里葉變換紅外光譜測定κ-卡拉膠/K+凝膠體系對魚糜蛋白的二級結構產(chǎn)生的變化之前,先要將魚糜凝膠進行冷凍干燥去除水分。取1 mg冷凍干燥后的凝膠樣品和100 mg KBr充分混合后研磨成非常細的粉末,然后使用壓片機將其壓縮成薄片。在室溫為25 ℃的干燥的環(huán)境中以光譜分辨率為4 cm-1進行測試,掃描32次,波數(shù)為4 000~400 cm-1。使用PeakFit 4.12對獲得的圖上的曲線進行多次擬合[13]。
1.3.6 掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)
使用掃描電子顯微鏡對含有和不含有κ-卡拉膠/K+凝膠體系的魚糜凝膠進行研究。在室內溫度下,使用消毒過的剃須刀片將魚糜凝膠切成2~3 mm厚度的薄片,取中間部分用2.5%(體積分數(shù))的戊二醇在0.2 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)中固定3 h后,用蒸餾水將樣品清洗干凈。固定的魚糜凝膠樣品在25%,50%,70%,80%,90%和100%(體積分數(shù))的乙醇中分別進行15 min脫水,對脫水后的魚糜凝膠樣品使用二氧化碳作為過渡液進行臨界點干燥,把干燥好的魚糜凝膠樣品安裝在青銅短管上使用金進行濺射鍍膜。最后,使用加速電壓為3 kV的掃描電子顯微鏡來分析魚糜凝膠樣品的微觀結構[14]。
1.3.7 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)
根據(jù)PETCHARAT等[14]和LAEMMLI[15]的方法作適當修改。分別取魚肉和魚糜凝膠樣品3 g,切碎后加入27 mL的SDS溶液,均質1 min后85 ℃水浴加熱1 h,隨后3 500 ×g離心20 min。雙縮脲法測定上清液的蛋白質濃度。與上樣緩沖液混合后煮沸5 min,上樣量為10 μL,使用4%~20%的商業(yè)預制膠進行電泳。電泳結束后將預制膠在含有0.1%考馬斯亮藍R-250的染色液中染色,脫色液脫色后照膠。
1.3.8 數(shù)據(jù)處理
使用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析,用OriginPro 8和Prism 8進行做圖。
圖1顯示了κ-卡拉膠/K+凝膠體系(KC/KC+KCl)對魚糜凝膠強度的影響。與空白組(添加量為0)樣品對比,KC和KC+KCl都能較大程度地提高雜魚魚糜的凝膠強度且差異顯著(P<0.05)。對于分別添加了KC和KC+KCl的2組魚糜凝膠,其凝膠強度的增加表現(xiàn)出相同的趨勢,都隨著添加量的增加而增加。在同一組中,添加量為0.4%和0.7%的魚糜凝膠強度之間差異不顯著(P>0.05),但是當添加量繼續(xù)增加到1%時,KC組和KC+KCl組的凝膠強度分別達到392.4 g·mm和457.3 g·mm,與空白組樣品的凝膠強度(222.5 g·mm)相比差異顯著(P<0.05)。通常,靜電相互作用是蛋白質與陰離子多糖之間的主要相互作用[16]。κ-卡拉膠在混合凝膠體系中可能充當活性填料,填充在魚糜凝膠的空隙中,冷卻之后形成可以結合水分的凝膠片段[17-18]。在相同的添加量水平下,KC組和KC+KCl組兩者之間都表現(xiàn)出顯著的差異(P<0.05)。陽離子增強κ-卡拉膠凝膠化的能力按Li+< Na+≤Mg2+,Ca2+< NH4+< K+的順序排列[2]。因此K+增強了κ-卡拉膠的凝膠化能力,形成硬且脆的凝膠,影響魚肉蛋白的凝膠性能。從而使得在相同添加量水平下,KC+KCl組相比較KC組更能增加魚糜凝膠的凝膠強度。所以,添加KC和KC+KCl都可以有效提高魚糜凝膠的凝膠強度,且加入K+的KC效果更好。
圖1 不同添加量的κ-卡拉膠/K+凝膠體系-魚糜復合凝膠的凝膠強度
圖2顯示了魚糜凝膠持水性在添加和不添加KC/KC+KCl的情況下受到的影響。持水性是凝膠系統(tǒng)最重要的功能特性之一,持水性的高低與肉的味道、嫩度、顏色和肉質的其他特征密切相關。魚糜凝膠的持水性主要由蛋白質和水之間的相互作用以及這些相互作用的數(shù)量來決定[19]。持水性越好,表示更多的水被結合或者保留在魚糜凝膠網(wǎng)絡中。
圖2 不同添加量的κ-卡拉膠/K+凝膠體系-魚糜復合凝膠的持水性
添加KC和KC+KCl可以使得魚糜凝膠的持水性得到明顯的改善,并且在相同添加物的組中,持水性隨著添加量的增加而上升。在添加物相同的同一組之間,添加量為0.4%和0.7%的雜魚魚糜凝膠持水性之間的差異不顯著(P>0.05)。但是,當添加量達到1%時,添加KC和KC+KCl的魚糜凝膠的持水性分別達到71.7%和85.1%,與對照組魚糜凝膠的持水性相比差異顯著(P<0.05)。κ-卡拉膠是親水膠體,分子結構中有許多親水的基團能夠與水發(fā)生作用。在90 ℃高溫下,κ-卡拉膠呈液體狀態(tài)進入魚糜凝膠的孔隙中發(fā)生內聚相互作用,冷卻后形成的片段可以結合水分嵌入凝膠網(wǎng)絡中。魚糜凝膠網(wǎng)絡對水分的保持主要取決于凝膠的強度,MAO等[20]研究發(fā)現(xiàn),當魚糕形成的凝膠網(wǎng)絡致密時,凝膠強度會增加,此時魚糕的持水性比較高。因此,添加適當?shù)摩?卡拉膠在魚糜中可以保留住更多的水分。在相同添加量水平下,KC組和KC+KCl組兩者之間都表現(xiàn)出顯著的差異(P<0.05)。K+的存在進一步加強了魚糜和κ-卡拉膠的協(xié)同關系,使得形成的凝膠網(wǎng)絡孔隙中嵌入更多結合了水的κ-卡拉膠凝膠片段,因此KC+KCl比KC對魚糜凝膠持水性的提升更顯著。
該實驗闡明了κ-卡拉膠和κ-卡拉膠+KCl對雜魚魚糜凝膠形成能力的影響。儲能模量(G′)通常用作凝膠形成的指標,用于研究魚糜凝膠動態(tài)流變學特性。
含有和不含有不同添加量的KC或KC+KCl的雜魚魚糜的儲能模量(G′)隨溫度的變化情況如圖3所示。在升溫過程中,對照組樣品的G′通常由3個階段組成,呈現(xiàn)出先升高后降低再升高的趨勢。對于含有KC或KC+KCl的魚糜,觀察到和空白樣品相似的儲能模量曲線。添加了KC或KC+KCl的凝膠樣品顯示出比空白樣品更高的G′。由于溫度開始升高,20~32 ℃為凝膠預備階段,在這個階段中,內源性谷氨酰胺轉移酶催化S1亞片段的展開和變性,導致肌球蛋白頭部-頭部相互作用從而形成蛋白質聚集體的早期階段[21],表明G′的增加是因為在低溫下通過氫鍵形成了初步的蛋白質網(wǎng)絡結構,并且蛋白質分子之間發(fā)生了交聯(lián)[22]。32~53 ℃為凝膠劣化階段,當溫度達到53 ℃時,G′達到最低點,由于內源性蛋白水解酶的作用,肌球蛋白輕鏈亞基解離使得魚糜的黏性增強,從而導致G′的降低。53~90 ℃為凝膠強化階段,此時G′再次增加,這可能是由于蛋白質分子之間的交聯(lián)數(shù)量由于解離而得到增加,以及發(fā)生了變性的肌球蛋白重鏈和肌動球蛋白,共同導致了熱不可逆的凝膠網(wǎng)絡形成[23]。由圖3可知,隨著添加量的增加,同一組添加物的G′隨著添加量的增加而增加,并且顯著高于空白樣品的G′。添加量為1%時,魚糜的G′最大,這是因為更多的κ-卡拉膠使得凝膠網(wǎng)絡結構更加致密,導致網(wǎng)絡結構增強。添加量相同時,KC+KCl組的G′均高于KC組,并且初始值也都比KC組的初始值高,這是由于K+增強了κ-卡拉膠的凝膠化能力,形成硬且脆的凝膠,填充到凝膠的空隙中,從而進一步增強了魚糜凝膠的網(wǎng)絡結構,使得G′增加,這與先前添加KC和KC+KCl對魚糜凝膠強度的影響結果相符合,進一步說明了KC和KC+KCl可以作為活性填料填充到凝膠的孔隙中,增加魚糜的G′,特別是使用加入了K+的κ-卡拉膠時效果尤為明顯。
圖3 溫度對κ-卡拉膠/K+凝膠體系-魚糜流變特性的影響
蛋白質空間構象的基礎是蛋白質的二級結構,蛋白質的功能特性的變化與二級結構的變化密不可分[24]。研究蛋白質二級結構的常用方法之一就是FTIR,蛋白質酰胺Ⅰ帶(1 700~1 600 cm-1)對蛋白質二級結構的區(qū)域變化很敏感,所以具有較高的研究意義。表1是不同波數(shù)所對應的二級結構[25]。表2是根據(jù)各特征峰的面積計算出的二級結構的含量。
表1 不同波數(shù)對應的蛋白質二級結構
由表2可以看出,添加了κ-卡拉膠/K+凝膠體系的魚糜蛋白二級結構含量發(fā)生了一些變化。β-折疊的含量隨著添加量的增加而增加,蛋白質發(fā)生聚集并形成凝膠。α-螺旋含量的減少說明了肌球蛋白展開,疏水基團暴露,而疏水相互作用可以促進凝膠化進程,α-螺旋含量減少,魚糜蛋白凝膠的強度增加[26]。通常,α-螺旋含量的減少會導致凝膠持水性的降低。但是,冷卻后的κ-卡拉膠/K+凝膠體系成為結合水的凝膠片段嵌入蛋白質的三維網(wǎng)狀結構中[27],導致持水性并沒有因為α-螺旋含量的減少而降低,這與2.2中κ-卡拉膠/K+凝膠體系能提高魚糜凝膠持水性的結論相符合,而結合了水的κ-卡拉膠凝膠片段的嵌入使得蛋白質的三維網(wǎng)狀結構從無序變得有序,由表2也可以發(fā)現(xiàn)無規(guī)則卷曲的含量隨著κ-卡拉膠/K+凝膠體系的增加而降低,說明蛋白質的三維網(wǎng)狀結構從無序變得有序,而均勻有序的網(wǎng)絡結構可以提高凝膠的強度。因此,κ-卡拉膠/K+凝膠體系的添加可以改變魚糜蛋白的二級結構。添加KC+KCl比添加KC對于二級結構含量的變化的影響更大一些,一方面是因為K+可以改善κ-卡拉膠的凝膠特性,使得嵌入三維網(wǎng)狀結構的κ-卡拉膠凝膠片段具有更高的凝膠強度,從而使得凝膠網(wǎng)絡結構更強。另一方面可能是K+促進了加熱的魚糜蛋白發(fā)生交聯(lián),此時β-折疊的含量增加,從而使得凝膠網(wǎng)絡更加致密,提高了凝膠網(wǎng)絡的強度。
表2 添加和不添加κ-卡拉膠/K+凝膠體系對魚糜蛋白二級結構含量的影響 單位:%
掃描電子顯微鏡是觀察蛋白質微觀結構的常用手段之一。圖4是添加或不添加κ-卡拉膠/K+凝膠體系的魚糜蛋白的微觀結構圖。由圖4可以看出,空白對照組的空間結構不完整,斷裂較多孔隙較大并且表面非常粗糙;κ-卡拉膠/K+凝膠體系的添加使得魚糜凝膠網(wǎng)絡結構變得完整減少了斷裂,蛋白質之間相互交聯(lián)起來,表面變得光滑平整。隨著添加量的增加,魚糜凝膠網(wǎng)絡結構變得均勻有序,孔隙也變得更小,魚糜凝膠的網(wǎng)絡結構得到加強,凝膠強度得到提升。從添加0.4% κ-卡拉膠的復合凝膠的微觀結構圖(圖4-a)可以看出,κ-卡拉膠在冷卻后形成的結合水分的片段嵌入了凝膠的網(wǎng)絡結構中,這樣既可以增強魚糜凝膠的凝膠強度,還可以提高魚糜凝膠的持水性。由圖4-a~圖4-g可以看出,當添加量相同時,κ-卡拉膠+KCl的魚糜凝膠結構更加均勻致密,孔隙也相對較小并且分布均勻。這可能是K+使得κ-卡拉膠的凝膠能力增強后,部分κ-卡拉膠與蛋白質的交聯(lián)程度進一步增強,從而形成了孔隙變小且均勻有序的三維網(wǎng)絡結構,提高了魚糜的凝膠強度。
a-空白對照組;b-添加0.4% κ-卡拉膠;c-添加0.4%κ-卡拉膠+KCl;d-添加0.7% κ-卡拉膠;e-添加0.7%κ-卡拉膠+KCl;f-添加1% κ-卡拉膠;g-添加1% κ-卡拉膠+KCl圖4 κ-卡拉膠/K+凝膠體系-魚糜復合凝膠的微觀結構圖(×5 000)
κ-卡拉膠/K+凝膠體系對魚糜蛋白聚集與降解的影響的SDS-PAGE圖譜如圖5所示。魚糜凝膠的蛋白網(wǎng)絡主要是由魚類的肌原纖維蛋白形成,而肌原纖維蛋白容易受到溫度的影響。魚糜蛋白中主要的蛋白是肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain,MHC,約200 kDa)和肌動蛋白(actin,約43 kDa)[28-29]。由圖5可以看出,魚糜漿未加熱處理時,可以看到清晰的MHC條帶和肌動蛋白條帶。90 ℃加熱30 min的樣品都發(fā)生了蛋白水解,由圖5可以看出強烈的蛋白水解作用,添加KC或KC+KCl的樣品的MHC均消失,與空白樣品結果相同。這個結果表明,蛋白質的ε-(γ-谷氨酰)賴氨酸分子之間的交聯(lián)由內源性轉谷氨酰胺酶誘導形成,非二硫鍵的共價鍵形成后在魚糜中起作用,使得肌原纖維蛋白被降解[30]。此外,還可以看出肌動蛋白條帶沒有發(fā)生明顯的變化。因此,添加κ-卡拉膠/K+凝膠體系對魚糜凝膠的蛋白質交聯(lián)沒有顯著影響。
圖5 κ-卡拉膠/K+凝膠體系對魚糜蛋白質SDS-PAGE條帶的影響
本實驗在魚糜中加入κ-卡拉膠/K+凝膠體系,從宏觀和微觀不同角度去探究魚糜凝膠特性的變化。結果表明,κ-卡拉膠/K+凝膠體系可以顯著提高魚糜凝膠的持水性、凝膠強度和魚糜的G′。這是由于κ-卡拉膠在混合凝膠體系中可能充當活性填料,填充在魚糜凝膠的空隙中,冷卻之后形成可以結合水分的凝膠片段。添加量的增加,使得更多的κ-卡拉膠填充到魚糜凝膠的空隙中,而且κ-卡拉膠/K+凝膠體系可能會與魚糜中的肌原纖維蛋白發(fā)生交聯(lián)從而強化了魚糜凝膠網(wǎng)絡。從SEM和FTIR的結果可知,κ-卡拉膠/K+凝膠體系的添加使得魚糜蛋白的二級結構發(fā)生改變,β-折疊含量增加,α-螺旋含量降低,使得魚糜蛋白的三維網(wǎng)絡結構變得光滑而且均勻致密。隨著κ-卡拉膠/K+凝膠體系添加量的增加,三維網(wǎng)絡結構中嵌入更多結合水分的凝膠片段,使得凝膠網(wǎng)絡結構得到增強。除此以外,由于卡拉膠具有蛋白質反應性,卡拉膠的強陰離子基團可以和蛋白質的極性部分發(fā)生反應,使得蛋白質和卡拉膠凝膠體系更好的結合在一起,從而提高魚糜凝膠的持水性、凝膠強度和G′,凝膠網(wǎng)絡結構得到增強。而添加K+可以使得影響更加顯著,這是因為K+可以增強κ-卡拉膠地凝膠化能力,形成硬且脆的凝膠,影響魚肉蛋白的凝膠性能。但是,κ-卡拉膠/K+凝膠體系對魚肉蛋白的聚合和降解都沒有顯著影響。