陳夢婷，魯元星，張力，唐玲*

1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院神經(jīng)康復(fù)科，重慶 400050；2重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院體檢中心，重慶 401331；

3重慶醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，重慶 400016

睡眠是大腦的高級功能，充足的睡眠是健康的基本條件。睡眠障礙可影響機(jī)體固有的生物節(jié)律，出現(xiàn)認(rèn)知、情緒、免疫功能改變及體內(nèi)激素、遞質(zhì)的變化，還可能引發(fā)其他器官系統(tǒng)疾病[1-3]。目前有研究認(rèn)為，睡眠障礙是一種神經(jīng)興奮/抑制功能失衡導(dǎo)致的臨床疾病[4]。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)及谷氨酸(glutamate，Glu)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)最重要的抑制/興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，不同腦區(qū)的GABA、Glu含量以及相關(guān)受體參與了不同時期的睡眠轉(zhuǎn)換，在睡眠中發(fā)揮著非常重要的作用[5]。越來越多的證據(jù)表明，瘦素等調(diào)節(jié)食欲的因子與睡眠時間也有密切關(guān)聯(lián)。瘦素是一種主要由白色脂肪組織合成分泌的多肽類激素，主要作用于下丘腦弓狀核區(qū)域，在調(diào)節(jié)糖、脂肪的能量代謝過程中發(fā)揮著重要作用[6-7]。瘦素基因缺乏小鼠常表現(xiàn)為睡眠結(jié)構(gòu)及節(jié)律紊亂，睡眠轉(zhuǎn)換次數(shù)增加，而體內(nèi)補(bǔ)充瘦素可增加睡眠深度[8]。但瘦素影響睡眠的機(jī)制目前尚不十分清楚。本研究利用多平臺水環(huán)境法建立睡眠剝奪小鼠模型，研究瘦素對睡眠剝奪小鼠下丘腦氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)及相關(guān)通路蛋白的影響，探討瘦素影響睡眠的可能機(jī)制，旨在為臨床睡眠障礙的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及材料 SPF級6周齡雄性C57BL/6J小鼠24只，體重(20±5) g，購自重慶醫(yī)科大學(xué)，飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心，給予充足的飲用水和飼料，每只小鼠飼養(yǎng)在規(guī)格為25 cm×15 cm×14 cm的鼠籠中。小鼠飼養(yǎng)符合標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件：室溫(22±2) ℃，光照周期12 h/12 h。實(shí)驗(yàn)開始前飼養(yǎng)7 d使小鼠充分適應(yīng)飼養(yǎng)條件。所有動物實(shí)驗(yàn)均符合并且嚴(yán)格遵守中國動物保護(hù)協(xié)會的準(zhǔn)則。瘦素(美國Genscript公司，批號：Z03158-5)；GABA受體(GABAARα1)抗體(英國Abcam公司，貨號Ab109364)；谷氨酸脫羧酶67(glutamic acid decarboxylase-67，GAD67)抗體(美國Proteintech公司，貨號BC002815)；GAPDH內(nèi)參抗體(美國Proteintech公司，貨號BC004109)。GABA、Glu的ELISA檢測試劑盒購自武漢Cloud-Clone Corp公司(貨號CEA900Ge、CES122Ge)，瘦素ELISA試劑盒購自武漢博士德公司(貨號AD2760MO)；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Pierce公司。

1.2 睡眠剝奪模型的建立及分組 采用改良多平臺水環(huán)境法建立睡眠剝奪動物模型[9]。將實(shí)驗(yàn)小鼠放置于水平臺睡眠剝奪箱內(nèi)(50 cm×35 cm×18 cm)，內(nèi)含9個圓形小平臺(高10.0 cm，直徑1.5 cm，高于水面以上0.5 cm)，水溫保持在18～20 ℃，平臺均間隔4.0 cm；利用小鼠畏水以及在水中無法進(jìn)入睡眠的生活習(xí)性，讓小鼠站立在平臺上，當(dāng)小鼠進(jìn)入快動眼睡眠期(REM)時，因全身肌張力降低引起低頭、觸水，以此來達(dá)到睡眠剝奪的目的。小鼠可自由從一個平臺跳躍到另一個平臺來實(shí)現(xiàn)自由走動，但不能同時跨立在兩個平臺上。各組小鼠均可自由獲取食物及飲用水。實(shí)驗(yàn)開始前先將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為對照組、睡眠剝奪組、瘦素補(bǔ)充組，每組8只。對照組設(shè)置水環(huán)境不剝奪睡眠；睡眠剝奪組利用改良多平臺水環(huán)境法建立小鼠睡眠剝奪模型[10]，每天睡眠剝奪20 h，連續(xù)剝奪7 d；瘦素補(bǔ)充組在每次剝奪當(dāng)天8:00 am及8:00 pm予以瘦素1.3 mg/(kg·d)腹腔給藥；對照組小鼠活動及睡眠不受任何干擾。

1.3 各組小鼠外周血瘦素水平檢測 建模成功后，取每組小鼠各8只，先將10%的肝素(0.1 ml/10 g)注入腹腔，15 min后采血，為使血液不易凝固，乙醚麻醉后快速摘去眼球取血液標(biāo)本于1 ml EP管中，4 ℃離心15 min(3000 r/min)，取上清液，按照ELISA試劑盒說明書測定瘦素含量。

1.4 各組小鼠下丘腦中GABA及Glu水平檢測 末次給藥30 min取血完成后，將小鼠斷頭處死，快速剝離腦組織，以視交叉為前界、乳頭體為后界、左右下丘腦溝為側(cè)界確定下丘腦位置，取1 mm深度左右的下丘腦組織，用生理鹽水沖洗下丘腦表面的殘余血液，用濾紙吸出表面多余的水分。按組織重量:生理鹽水為1:9的比例制備下丘腦10%組織勻漿，離心(4 ℃，12 000×g，10 min)獲取上清液。根據(jù)試劑盒說明書的方法檢測組織上清液中的GABA、Glu水平。

1.5 Western blotting檢測各組小鼠下丘腦GABAARα1、GAD67蛋白含量 末次給藥后30 min取小鼠下丘腦樣品稱重。按重量體積比例(1:9)向樣品中添加預(yù)冷裂解緩沖液，混合均勻后在冰上超聲勻漿，研磨至渾濁狀態(tài)后冰上靜置1 h。待組織充分溶解后在4 ℃超低溫離心機(jī)中對勻漿液進(jìn)行離心(12 000 r/min，15 min)，收集上清液。腦組織中蛋白質(zhì)濃度采用BCA法測定，目標(biāo)蛋白質(zhì)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上1 h。然后用封閉緩沖液(含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液)封閉2 h，將封閉緩沖液棄去，采用3% BSA-TBST稀釋一抗，GABAARα1按比例1:2000稀釋成4 ml，GAD67按比例1:2000稀釋成4 ml，4 ℃孵育過夜。第2天取出PVDF膜，室溫孵育30 min。TBST洗膜10 min×3次。采用BSA-TBST稀釋二抗，山羊抗兔IgG(H+L)用HRP按1:4000稀釋，室溫輕搖60 min。TBST洗膜15 min×3次，最后加入ECL超敏化學(xué)發(fā)光液以顯色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)以表示，在滿足方差齊性的條件下，多組樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 睡眠剝奪對小鼠體重及血漿瘦素水平的影響睡眠剝奪前，對照組與睡眠剝奪組小鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。從實(shí)驗(yàn)開始后的第1天，睡眠剝奪組小鼠體重逐漸減輕。在睡眠剝奪4、7 d后，睡眠剝奪組小鼠體重[分別為(18.28±0.44) g，(17.75±0.75) g]較對照組[分別為(21.71±0.71) g，(22.03±0.42) g]明顯減輕(P<0.05，P<0.01)，瘦素補(bǔ)充組體重[分別為(17.07±0.25) g，(15.10±0.38) g]較對照組及剝奪組小鼠均明顯減輕(P<0.01，P<0.05)。睡眠剝奪組小鼠皮毛失去光滑，表現(xiàn)出一定興奮性行為，對光線和聲音特別敏感，表現(xiàn)輕微躁狂，攻擊性強(qiáng)，提示造模成功。ELISA檢測結(jié)果顯示，睡眠剝奪組小鼠血漿瘦素水平[(359.14±16.69) pg/ml]明顯低于對照組[(483.81±21.72) pg/ml]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而瘦素補(bǔ)充組小鼠血漿瘦素水平[(1124.00±19.87) pg/ml]明顯高于對照組和睡眠剝奪組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.2 外源性補(bǔ)充瘦素對睡眠剝奪小鼠下丘腦GABA、Glu水平的影響 ELISA檢測結(jié)果顯示，與對照組[(152.37±8.14) ng/g]相比，睡眠剝奪組小鼠下丘腦GABA水平[(111.31±2.96) ng/g]明顯降低(P<0.01)；瘦素補(bǔ)充組小鼠下丘腦GABA水平[(132.19±3.38) ng/g]明顯高于睡眠剝奪組(P<0.05)，但與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；睡眠剝奪組、瘦素補(bǔ)充組小鼠下丘腦Glu水平[分別為(686.56±10.01) ng/g、(668.64±9.93) ng/g]明顯高于對照組[(577.11±16.36) ng/g，P<0.05]，而瘦素補(bǔ)充組與睡眠剝奪組Glu水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 外源性補(bǔ)充瘦素對睡眠剝奪小鼠下丘腦GAD67、GABAARα1蛋白表達(dá)的影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組(1.09±0.13)相比，睡眠剝奪組小鼠下丘腦中GAD67表達(dá)(0.68±0.06)明顯降低，而瘦素補(bǔ)充組小鼠下丘腦中的GAD67水平(1.39±0.19)較睡眠剝奪組及對照組均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組(0.99±0.07)比較，睡眠剝奪組小鼠下丘腦GABAARα1表達(dá)水平(0.69±0.07)明顯降低，而瘦素補(bǔ)充組小鼠下丘腦GABAARα1水平(1.33±0.14)明顯高于睡眠剝奪組及對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

3 討 論

睡眠、能量代謝及晝夜節(jié)律系統(tǒng)經(jīng)過幾百萬年的共同進(jìn)化，使機(jī)體與環(huán)境的協(xié)調(diào)達(dá)到最佳狀態(tài)，并維持多種分子與生理過程間的內(nèi)部協(xié)調(diào)。大量研究證實(shí)，能量平衡與睡眠-覺醒密切相關(guān)，而瘦素是聯(lián)系睡眠-覺醒周期與能量平衡的關(guān)鍵分子[11]。

圖1 各組小鼠下丘腦GAD67、GABAARα1蛋白表達(dá)(Western blotting)Fig.1 Expressions of GAD67 and GABAARα1 protein in hypothalamus of each group of mice (Western blotting)

瘦素是白色脂肪合成的多肽類激素，主要發(fā)揮控制食欲、促進(jìn)能量消耗的作用。瘦素分泌進(jìn)入血液后，部分與瘦素結(jié)合蛋白結(jié)合，通過血腦屏障進(jìn)入腦組織并與其多種形式的瘦素受體結(jié)合發(fā)揮作用[12]。瘦素受體廣泛分布于大腦，其中部分表達(dá)瘦素受體的神經(jīng)核團(tuán)與睡眠覺醒相關(guān)的神經(jīng)核團(tuán)重疊。在下丘腦外側(cè)區(qū)，瘦素反應(yīng)性GABA能神經(jīng)元的一個子集投射至促覺醒神經(jīng)元(orexin能神經(jīng)元)，這表明瘦素反應(yīng)性神經(jīng)元可通過抑制orexin能神經(jīng)元而發(fā)揮促睡眠作用[13]。人體的瘦素分泌具有晝夜節(jié)律，表現(xiàn)為夜間分泌逐漸增多，至清晨達(dá)最高峰，白天分泌減少[14]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，睡眠不足或紊亂的患者瘦素水平、峰值、升降幅度均明顯下降，而在正常睡眠恢復(fù)后瘦素水平又會升高[15-16]。瘦素基因缺陷的小鼠也表現(xiàn)為睡眠微覺醒次數(shù)增加，睡眠期轉(zhuǎn)換次數(shù)增加[17]，而將人源重組瘦素注入大鼠體內(nèi)后慢波睡眠比例增加，睡眠質(zhì)量和結(jié)構(gòu)明顯改善[18]。本研究中，與對照組相比，睡眠剝奪組小鼠體重明顯減輕，血清瘦素水平明顯降低。由此可見，無論在人體還是動物中，睡眠時間與瘦素水平均有著極為密切的關(guān)系。

睡眠剝奪對人體的生理功能影響廣泛，特別是對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的影響更為明顯[19]。研究顯示，在睡眠剝奪期間，大鼠的攝食量明顯增加，但體重卻有所下降，表明睡眠剝奪期間的大鼠處于高能量消耗狀態(tài)。隨著睡眠剝奪時間的延長，大鼠的生理變化更加明顯，10 d后會因全身衰竭而落水死亡[20]。為了更有效地觀察睡眠剝奪引起的生理變化，為睡眠機(jī)制研究提供更客觀的依據(jù)，本研究采用改良多平臺水環(huán)境法建立睡眠剝奪模型，以7 d為睡眠剝奪周期，設(shè)計(jì)水環(huán)境無睡眠剝奪為對照組，對下丘腦主要的興奮/抑制性神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行檢測及分析。結(jié)果顯示，睡眠剝奪可導(dǎo)致下丘腦內(nèi)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)Glu明顯增多而抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA明顯減少；補(bǔ)充瘦素對睡眠剝奪小鼠下丘腦內(nèi)Glu水平無明顯影響，但可顯著提升GABA水平，提示瘦素主要通過調(diào)節(jié)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA而發(fā)揮睡眠調(diào)節(jié)作用。相關(guān)研究表明，GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，睡眠促進(jìn)神經(jīng)元系統(tǒng)幾乎均由GABA能神經(jīng)元組成，在睡眠中發(fā)揮著極為關(guān)鍵的調(diào)控作用[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，外源性補(bǔ)充GABA可通過增加腦部慢波從而提高睡眠中的深睡眠比例來改善睡眠質(zhì)量[5]。因而，提升GABA含量可能是瘦素參與調(diào)節(jié)睡眠的重要機(jī)制。

腦內(nèi)的GABA主要是由谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶作用脫羧而成，在谷氨酸脫羧酶的作用下，將谷氨酸轉(zhuǎn)化為GABA[21]。谷氨酸脫羧酶以GAD65及GAD67兩種亞型形式存在[22-23]。研究表明，GAD67比GAD65對GABA的變化更敏感，GAD67負(fù)責(zé)大腦中超過90%的GABA合成及釋放，普遍存在于GABA能神經(jīng)元胞質(zhì)中，主要負(fù)責(zé)GABA的合成[24-26]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，瘦素在提高下丘腦內(nèi)GABA含量的同時，上調(diào)了GAD67蛋白的表達(dá)水平，這提示瘦素可能通過上調(diào)GABA合成酶的表達(dá)而提高GABA的含量。

GABA主要通過與其受體特異性結(jié)合而在突觸之間快速產(chǎn)生抑制作用。因此，GABA發(fā)揮抑制效應(yīng)不僅需要上游神經(jīng)元正常獲取及釋放GABA神經(jīng)遞質(zhì)，也需要下游神經(jīng)元具有相應(yīng)數(shù)量的GABA受體以完成信息的傳遞[27-28]。GABAA受體是失眠研究中的常用指標(biāo)，其中A受體以GABAARα1亞型最多[29]。有研究表明，在對氯苯丙氨酸造模的失眠大鼠模型中，GABA及GABAARα1的表達(dá)會明顯減少[30]。同樣本研究的動物模型也表明，睡眠剝奪導(dǎo)致小鼠GABAARα1表達(dá)降低，而瘦素可明顯上調(diào)睡眠剝奪小鼠下丘腦內(nèi)GABAARα1受體的表達(dá)。這一調(diào)節(jié)效應(yīng)也將增強(qiáng)對GABA抑制性神經(jīng)信號的傳遞，可能在瘦素對睡眠結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，瘦素可上調(diào)睡眠剝奪小鼠下丘腦內(nèi)GABA關(guān)鍵合成酶GAD67的表達(dá)、升高下丘腦GABA含量、提高下丘腦GABAARα1蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而影響失眠小鼠的睡眠情況。雖然對瘦素作用于GABA神經(jīng)元的詳細(xì)下游分子機(jī)制仍需進(jìn)一步深入探討，但本研究結(jié)果提示，瘦素可能是通過調(diào)節(jié)GABA的合成及信號傳遞從而參與睡眠調(diào)控的，為睡眠-覺醒機(jī)制與能量代謝研究提供了新資料。