趙行宇，張漠，朱志華，侯建成，劉勃，張巍

吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林省吉林市 132013

宮頸癌的發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的第二位[1-3]，其發(fā)生與人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染有關(guān)[4-5]。HPV有多種亞型，其中HPV16及HPV18亞型被稱為高風(fēng)險亞型[6]。從機(jī)制上講，這些高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)與宮頸癌的侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)[7]。6-姜烯酚是一種由生姜中提取的酚醛酮單體成分，具有抗氧化、抗炎及抗腫瘤等多種生物效應(yīng)[8-11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，6-姜烯酚對HPV陰性的C33A細(xì)胞及HPV陽性的HeLa細(xì)胞的生長均有抑制作用，且對HeLa細(xì)胞的抑制作用更明顯(尚未發(fā)表)。在腫瘤細(xì)胞的生長與轉(zhuǎn)移過程中，鈣離子依賴的細(xì)胞黏附素——鈣黏蛋白(cadherin)及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)發(fā)揮了重要作用，但其具體機(jī)制仍不清楚。因此，本研究通過分析6-姜烯酚作用前后E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、MMP-2、MMP-9水平的變化，探討6-姜烯酚對兩種宮頸癌細(xì)胞(C33A細(xì)胞、HeLa細(xì)胞)侵襲、遷移的影響及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 HeLa細(xì)胞(HPV陽性)、C33A細(xì)胞(HPV陰性)購自中國上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。6-姜烯酚購自美國Sigma公司，純度為97%；RPMI 1640培養(yǎng)基、細(xì)胞裂解緩沖液購自碧云天公司(中國杭州)；胎牛血清(FBS)、胰酶(美國紐約州格蘭德島cGMP認(rèn)證工廠)；基質(zhì)膠(Matrigel)購自美國BD公司。兔抗人E-cadherin、N-cadherin、MMP-2、MMP-9及內(nèi)參β-actin抗體購自美國Epotomics公司；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在37 ℃、5%CO2條件下，將HeLa細(xì)胞及C33A細(xì)胞分別與含10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基共同孵育。胰酶消化細(xì)胞，并用緩沖液漂洗2次。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%時，將細(xì)胞傳代培養(yǎng)24 h，然后用6-姜烯酚處理。

1.2.2 MTS法測定細(xì)胞生存能力 將細(xì)胞在96孔板中鋪板(約1×104個細(xì)胞)24 h，然后分別用5、10、20、50 μmol/L的6-姜烯酚繼續(xù)培養(yǎng)24 h，采用MTS法檢測細(xì)胞活力，用來確定下一步實(shí)驗(yàn)檢測使用的濃度。后續(xù)實(shí)驗(yàn)以10 μmol/L的6-姜烯酚繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，分為0、24、48、72 h組，用MTS法檢測細(xì)胞活力。用酶標(biāo)儀(Apollo LB 9110；Berthold Technologies GmbH，德國)在492 nm波長下測量其吸光度值。

1.2.3 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲力 將基礎(chǔ)凝膠(50 mg/L)和無血清RPMI 1640培養(yǎng)基按1:3的比例稀釋，然后取100 μl稀釋的Matrigel基質(zhì)膠放置在上腔室中，并在37 ℃下保持無菌過夜，以確保Matrigel完全聚合。為了進(jìn)行侵襲測定，收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞(2×105/ml)，將200 μl細(xì)胞懸液添加至每孔的上室中，并補(bǔ)充300 μl的RMPI 1640培養(yǎng)基。在這兩次檢測中，將500 μl含10%FBS的RMPI 1640添加到下腔室中。然后用10 μmol/L的6-姜烯酚于37 ℃分別處理細(xì)胞24、48 h，以未處理組作為對照。侵入下腔室的細(xì)胞被固定在聚甲醛下，在甲醇中滲透并用結(jié)晶紫染色。拍照并計(jì)算穿過未覆蓋膜的侵襲細(xì)胞的數(shù)量。選取任意4個視野中的細(xì)胞計(jì)數(shù)并取其平均數(shù)。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移力 取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，以2×105/ml密度接種在24孔板中。當(dāng)細(xì)胞融合至約80%時，以無血清的RMPI 1640替換后，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h。當(dāng)細(xì)胞生長到完全融合時，采用10 μl注射器尖端刮擦每個孔的單層細(xì)胞。造成劃痕后，用PBS沖洗2次，然后沿著劃痕的邊緣使用倒置顯微鏡觀察并拍照。以未加藥組為對照，加藥組用10 μmol/L的6-姜烯酚繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后，在倒置顯微鏡下觀察刮擦愈合的程度并照相，沿劃痕邊緣等間距取3處測量劃痕寬度，取平均值。傷口愈合率(%)=(0 h劃痕寬度－觀察時間點(diǎn)的劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%，以此反映細(xì)胞的遷移能力。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Western blotting分析E-cadherin、N-cadherin、MMP-2及MMP-9蛋白的表達(dá) 收集細(xì)胞并在RIPA緩沖液中裂解。4 ℃、12 000×g離心20 min提取總蛋白。將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在5%脫脂奶粉中封閉2 h，然后加入一抗MMP-2、MMP-9、E-cadherin及N-cadherin(均1:2 000稀釋)4 ℃過夜，培養(yǎng)24 h后，在TBST緩沖液中洗膜5次，然后與HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1:10 000稀釋)在室溫下培養(yǎng)2 h，TBST緩沖液沖洗5次后，使用化學(xué)發(fā)光液反應(yīng)1 min，ECL發(fā)光儀掃描，用灰度軟件計(jì)算灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 6 -姜烯酚對宮頸癌細(xì)胞生存的影響 用不同濃度6-姜烯酚培養(yǎng)人宮頸癌細(xì)胞24 h后，可見HeLa細(xì)胞及C33A細(xì)胞的活力均隨6-姜烯酚濃度的增加而逐漸降低。與0 μmol/L 6-姜烯酚組比，5、10、20及50 μmol/L 6-姜烯酚組的細(xì)胞活力明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；同一濃度下HeLa細(xì)胞活力較C33A細(xì)胞降低更明顯(圖1A)。10 μmol/L 6-姜烯酚培養(yǎng)24、48、72 h后，HeLa細(xì)胞及C33A細(xì)胞的活力隨作用時間延長而逐漸降低；同一時點(diǎn)的HeLa細(xì)胞活力較C33A細(xì)胞降低更明顯(圖1B)。

圖1 6-姜烯酚對宮頸癌細(xì)胞生存的影響Fig.1 Effect of different concentrations of 6-gingerol on the survival of cervical cancer cells

2.2 6 -姜烯酚對宮頸癌細(xì)胞侵襲能力的影響 用10 μmol/L 6-姜烯酚處理HeLa細(xì)胞24 h及48 h、處理C33A細(xì)胞48 h后，細(xì)胞的侵襲能力均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而10 μmol/L 6-姜烯酚處理C33A細(xì)胞24 h后細(xì)胞的侵襲能力與未處理組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2)。

2.3 6 -姜烯酚對宮頸癌細(xì)胞遷移能力的影響 采用10 μmol/L 6-烯酚處理HeLa細(xì)胞24 h及48 h、處理C33A細(xì)胞48 h后，傷口愈合率均明顯高于對照組。10 μmol/L 6-姜烯酚處理C33A細(xì)胞24 h后，傷口愈合率與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖3)。

2.4 6 -姜烯酚對E-cadherin、N-cadherin、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響 10 μmol/L 6-姜烯酚處理HeLa細(xì)胞24 h后，細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)增加，而N-cadherin、MMP-2及MMP-9的表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；10 μmol/L 6-姜烯酚處理C33A細(xì)胞24 h后，細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)明顯增加，N-cadherin、MMP-2及MMP-9的表達(dá)與未處理組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖4)。

3 討 論

6-姜烯酚能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，包括結(jié)腸癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌及黑素瘤等[10,12-13]，但鮮見6-姜烯酚誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡的研究，且其誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制尚未充分闡明。腫瘤轉(zhuǎn)移是大多數(shù)癌癥患者死亡的主要原因。因此，找到抑制癌癥轉(zhuǎn)移的有效藥物非常重要。在腫瘤發(fā)生的最早階段，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是促使癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移的重要因素，因此，尋找能有效抑制EMT的藥物具有重要的臨床意義。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，6-姜烯酚可以劑量依賴性的方式降低HPV陽性宮頸癌細(xì)胞的活力，進(jìn)而抑制細(xì)胞的遷移及侵襲[14]。腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的另一個重要環(huán)節(jié)是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)及基底膜結(jié)構(gòu)屏障的降解及破壞，后者為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了有利條件[15]。MMP是ECM分解代謝的關(guān)鍵酶，MMP-2、MMP-9在腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[16-17]。為探討6-姜烯酚抑制宮頸癌細(xì)胞遷移及侵襲的相關(guān)機(jī)制，本研究進(jìn)一步分析了MMP-2及MMP-9在此過程中的變化，發(fā)現(xiàn)6-姜烯酚作用于HeLa細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的MMP-2及MMP-9蛋白表達(dá)下降，提示6-姜烯酚抑制HeLa細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移可能與抑制這兩種蛋白的表達(dá)有關(guān)。

圖2 10 μmol/L 6-姜烯酚作用24、48 h對宮頸癌細(xì)胞侵襲能力的影響(n=3)Fig.2 Effects of 10 μmol/L 6-gingerol for 24 h and 48 h on the invasion ability of cervical cancer cells (n=3)

圖3 6-姜烯酚作用24、48 h對宮頸癌細(xì)胞遷移能力的影響(n=3)Fig.3 Effects of 6-gingerol on the migration ability of cervical cancer cells after 24 h and 48 h treatment (n=3)

圖4 6-姜烯酚作用24 h對宮頸癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of 6-gingerol on epithelial-mesenchymal transition-related protein in cervical cancer cells

Cadherin-Switch理論認(rèn)為，間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化后的結(jié)果是E-cadherin的缺失及N-cadherin的增加，后者是影響腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移最重要的分子之一[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，6-姜烯酚對宮頸癌HeLa細(xì)胞中E-cadherin及N-cadherin的表達(dá)均可產(chǎn)生影響。6-姜烯酚處理使HeLa細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)明顯上調(diào)，而N-cadherin的表達(dá)則明顯下調(diào)。而以上對EMT相關(guān)蛋白的作用在HPV陰性的C33A細(xì)胞中并不明顯。

綜上所述，在人宮頸癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移過程中，6-姜烯酚對HPV陽性和陰性細(xì)胞的影響并不一致，6-姜烯酚對HPV陽性的HeLa細(xì)胞影響更大，其作用機(jī)制與MMP及鈣黏蛋白有關(guān)。本研究結(jié)果提示，整合在人宮頸癌細(xì)胞中的HPV序列及表達(dá)的相關(guān)蛋白參與了人宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程，對抑制宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及臨床治療具有重要價值。