常金梅 何詠 張魯斌

摘 ?要：為了探討采后菠蘿黑心病發(fā)病過程中活性氧的代謝途徑，以‘巴厘菠蘿為材料，將其貯藏在25?℃條件下，觀察黑心病的發(fā)病情況，每隔3 d對整果果肉以及健康部位和患病部位的果肉組織進(jìn)行取樣，測定果實(shí)發(fā)病率以及果肉褐變度，對發(fā)病過程中脂氧合酶（LOX）活性和丙二醛（MDA）含量進(jìn)行了測定，同時對活性氧代謝起關(guān)鍵作用的抗壞血酸（AsA）、谷胱甘肽（GSH）、類黃酮含量以及活性氧清除相關(guān)酶（POD、CAT、SOD）活性進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，菠蘿果實(shí)在貯藏第6天開始發(fā)病，到15 d時，發(fā)病率為100%，褐變度在第6～9天時增長最快;在黑心病發(fā)病過程中，與健康部位相比，患病組織伴隨著LOX活性的升高，MDA的積累，同時出現(xiàn)AsA的下降、類黃酮含量的顯著增加，且患病組織POD、CAT酶活性快速下降，但谷胱甘肽含量和SOD酶活性幾乎沒有變化。由此可推斷，在采后菠蘿黑心病發(fā)病過程中，AsA、類黃酮、POD、CAT在活性氧代謝中起關(guān)鍵作用。

關(guān)鍵詞：菠蘿;黑心病;活性氧代謝中圖分類號：S668.3??????文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Metabolism of Reactive Oxygen Species During Development of Black Heart Disease in Post-harvest Pineapple

CHANG Jinmei^1，2，3， HE Yong¹， ZHANG Lubin^{1，2，3*}

1. Lingnan Normal University， Zhanjiang， Guangdong 524091， China; 2. South Subtropical Crops Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences?/?Key Laboratory of Hainan Province for Postharvest Physiology and Technology of Tropical Horticultural Products， Zhanjiang， Guangdong 524091， China; 3. Jiaying University / Guangdong Provincial Key Laboratory of Conservation and Precision Utilization of Characteristic Agricultural Resources in Mountainous Areas， Meizhou， Guangdong 514000， China

Abstract： In order to explore the metabolism pathway of reactive oxygen species （ROS） related to the development of black heart disease in postharvest pineapple， ‘Paris pineapple as the material was stored at room temperature and observed for the incidence of black heart disease. The pulp along the equator and the pulp of healthy and diseased parts were sampled separately every 3 days. The incidence of black heart disease and the browning degree of pulp were tested. At the same time， the activities of lipoxygenase （LOX）， and the key enzymes of ROS metabolism （POD， CAT， SOD）， and the contents of malondialdehyde （MDA）， ascorbic acid （AsA）， flavonoids and glutathione （GSH） were tested during the course of the storage. The results showed that the black heart disease of pineapple appeared at the 6th day and the incidence rate increased to 100% at the 15th day. From the 6th day to the 9th day， the browning was the fastest. Compared with healthy parts， the diseased tissue was accompanied by increase of LOX activity and MDA accumulation， significant decrease in AsA content and POD， CAT activities， and rapid increase in flavonoid content. The glutathione content and SOD activity did not change significantly. It could be inferred that AsA， flavonoids， POD and CAT play key roles in ROS metabolism during the development of black heart disease in post-harvest pineapple.

Keywords： pineapple; black heart disease; metabolism of reactive oxygen

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.07.020

菠蘿[Ananas comosus（L.）Merr]是我國南方的特色水果，也是我國熱區(qū)主要經(jīng)濟(jì)作物。其種植效益和出口貿(mào)易情況直接關(guān)系到熱區(qū)農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)收入^[1]。采后菠蘿主要以鮮果形式在國內(nèi)市場銷售，但采后果實(shí)貯藏和運(yùn)輸過程中容易發(fā)生黑心病，特別是我國主栽品種‘巴厘，其貨架期僅為3～5?d^[2]，之后果肉均出現(xiàn)不同程度的褐色或黑褐色病變，嚴(yán)重影響菠蘿產(chǎn)業(yè)和進(jìn)出口貿(mào)易發(fā)展。菠蘿黑心病表現(xiàn)為菠蘿外部無任何癥狀，橫剖后果心周圍果肉褐變，通常是小果先出現(xiàn)半透明的水漬狀或淺褐色的小斑點(diǎn)，隨著發(fā)病程度的加深，褐色斑點(diǎn)互相聯(lián)結(jié)成一片，并向果髓發(fā)展，最終果髓甚至果肉都變?yōu)楹诤稚?sup>[3-5]。嚴(yán)重影響果實(shí)的品質(zhì)，使果實(shí)喪失商品價值，對菠蘿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成極大的危害^[6-7]。

正常情況下，植物體內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生和清除保持動態(tài)平衡，植物在受到外界非生物逆境脅迫時，會造成細(xì)胞代謝的紊亂，誘導(dǎo)產(chǎn)生過量的ROS，引起細(xì)胞的氧化傷害，進(jìn)而破壞細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)，致使植物體內(nèi)的生物膜脂過氧化、DNA受損等多種毒害效應(yīng)發(fā)生，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，植物表現(xiàn)出局部壞死、褐變等癥狀^[8-11]。而植物體內(nèi)存在一套清除活性氧、防止其毒害的保護(hù)體系，包括酶促和非酶促2類防御保護(hù)系統(tǒng)，酶促保護(hù)系統(tǒng)中的保護(hù)酶系主要由超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）等組成;非酶促即是抗氧化物質(zhì)，主要包括抗壞血酸（AsA）、谷胱甘肽（GSH）、類黃酮等^[12-13]。本研究主要針對采后菠蘿黑心病發(fā)病過程中防御活性氧毒害的保護(hù)系統(tǒng)進(jìn)行了研究，旨在明確黑心病發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用的活性氧代謝途徑，為明確菠蘿黑心病發(fā)生的生理機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1??材料與方法

1.1 ?材料

品種為‘巴厘（Ananas comosus‘Comte de Paris），從田間采收七八成熟、大小均勻、無機(jī)械損傷的‘巴厘果實(shí)，保留頂芽，保留果柄長度1?cm，作為供試材料。將準(zhǔn)備好的菠蘿置于塑料籃中，用聚乙烯袋包裹塑料籃（不完全密封），在常溫（25?℃）下貯藏，及時觀察黑心病的發(fā)病情況并取樣。

1.2 方法

1.2.1 ?取樣方法??每個處理隨機(jī)取5個菠蘿，橫切果實(shí)赤道部果肉，厚度約1?cm，去果皮，切小塊，液氮速凍，用高速粉碎機(jī)碾成粉末狀，做標(biāo)記后于?80?℃保存;病健部分開取樣時，健康部位指赤道部位距果皮0.5?cm果肉，發(fā)病部位指果梗與果肉交接處。每處理重復(fù)3次。

1.2.2 ?褐變度和發(fā)病率的測定??參照張墨英等^[14]的方法加以改進(jìn)：稱取樣品1?g，加入10?mL 95%乙醇，4000?r/min下離心15?min，取上清液在420?nm下測吸光度值，重復(fù)3次。發(fā)病率測定：每隔3?d測定一次，每次取貯藏菠蘿30個切開觀察是否發(fā)病，發(fā)病率=發(fā)病果數(shù)/菠蘿總數(shù)×100%。

1.2.3??脂氧合酶活性測定 ?粗酶液提?。簠⒖缄惱ニ傻?sup>[15]的方法并有所改進(jìn)，取樣品2?g，加入10?mL預(yù)冷的pH?7.0，0.05?mol/L的磷酸緩沖液，4?℃，15?000?r/min離心15?min，取上清液備用。脂氧化酶（LOX）活性測定：先配制反應(yīng)底物，在100 mg亞油酸鈉中加入等質(zhì)量的TritonX-100及4?mL無氧水，避免產(chǎn)生氣泡，用0.5?mol/L NaOH溶液滴定至溶液澄清，定容25?mL，保存于?18?℃，取反應(yīng)底物25?μL，加緩沖液2.775?mL，加粗酶液0.2?mL，混勻后于234?nm處測吸光度值，記錄1?min內(nèi)吸光度值的變化。以每分鐘每克組織鮮重引起A₂₃₄的變化為一個酶活單位（A?/min FW），重復(fù)3次。

1.2.4 ?丙二醛含量測定??參照文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行測定。測定丙二醛（MDA）與硫代巴比妥酸（TBA）反應(yīng)后的OD₅₃₂、OD₆₀₀和OD₄₅₀，按公式C=6.45?（OD₅₃₂?OD₆₀₀）?0.56OD₄₅₀計算MDA（μmol/g）的含量。

1.2.5 ?抗壞血酸、類黃酮和谷胱甘肽含量的測定??參照賈君^[17]2，6-二氯靛酚的測定方法，取樣品1?g，加入40?mL 20?g/L的草酸，搖勻，靜置10?min，在冰上過濾，取濾液備用。用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)AsA滴定2，6-二氯靛酚，計算出1?mL 2，6-二氯靛酚相當(dāng)于AsA的質(zhì)量，然后取10?mL濾液，用已標(biāo)定的2，6-二氯靛酚進(jìn)行滴定，計算出AsA含量，重復(fù)3次，單位mg/100?g。類黃酮的含量測定參考張雪輝等^[18]的方法略加修改，取樣品2?g加入25?mL甲醇，超聲45?min，過濾，取濾液備用。以不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線，取濾液2.5?mL，加入0.5?mL NaOH，放置5?min，甲醇定容至10?mL，搖勻后在416?nm下測吸光度值，重復(fù)3次，單位mg/g。GSH的測定參考翟文慧等^[19]的紫外-可見分光光度法，取1?g樣品加入10?mL 0.1?mol/L的NaOH溶液，超聲10?min，定容至25?mL，混勻，過濾，留濾液備用。以不同濃度的GSH標(biāo)準(zhǔn)品溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，取1?mL濾液用0.1?mol/L的NaOH溶液定容至10?mL，在230?nm處測定吸光度值，重復(fù)3次，單位mg/g。

植物體內(nèi)存在酶促和非酶促2類防御活性氧毒害的保護(hù)系統(tǒng)，其中非酶促保護(hù)系統(tǒng)中AsA作為植物體內(nèi)重要的抗氧化劑，充當(dāng)抗氧化防御系統(tǒng)中的電子供體，參與催化細(xì)胞清除OH^-、O₂^-、H₂O₂等活性氧自由基，抵御自由基對細(xì)胞的傷害，同時保護(hù)果實(shí)內(nèi)的其他抗氧化成分^[22-26]。類黃酮和GSH均有清除植物體內(nèi)的自由基及活性氧，保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能的完整性，增強(qiáng)植物的抗逆性^[27]。本研究結(jié)果表明，在0～3?d時，AsA含量較高，黑心病未發(fā)生，可能是由于AsA減輕膜的受損傷程度，從第6天開始，AsA含量快速下降，黑心病出現(xiàn)。菠蘿果實(shí)在患病前后類黃酮含量變化波動比較大，患病之前類黃酮含量保持穩(wěn)定，患病后受逆境刺激，其含量迅速升高，以清除體內(nèi)自由基，保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性，之后隨著褐化的加重，自身生理機(jī)能遭到破壞，類黃酮含量下降。而GSH在整個發(fā)病過程中基本沒有波動，且患病部位和健康部位無差異。酶促保護(hù)系統(tǒng)中SOD、CAT和POD為清除活性氧的主要酶，SOD能催化體內(nèi)過量的O₂^-生成H₂O₂，而CAT和POD催化H₂O₂還原成H₂O^[28]。本研究結(jié)果顯示，POD、CAT在黑心病發(fā)病前后均出現(xiàn)了較大的波動，且患病組織與健康組織的酶活性均出現(xiàn)了較大的差異，推測POD、CAT在病害發(fā)生時均作出了響應(yīng)，而SOD活性在患病部位和健康部位基本沒有變化，由此可知，在菠蘿黑心病發(fā)病過程中，防御活性氧毒害的非酶促保護(hù)系統(tǒng)中，AsA和類黃酮起到了關(guān)鍵作用，而酶促保護(hù)系統(tǒng)中，POD、CAT起關(guān)鍵作用。

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