李麗 程煜 袁建琴

摘 ? ?要：為了探尋枯草芽孢桿菌S6菌中對(duì)棉花枯萎病菌有拮抗作用的蛋白，將S6菌進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，初步提取得到了粗蛋白提取液。粗提液經(jīng)硫酸銨沉淀、Sephadex G-50脫鹽、Sephadex G-100凝膠層析、DEAE-52纖維素離子交換層析，得到了對(duì)棉花枯萎病菌有高效拮抗作用的蛋白質(zhì)，純化倍數(shù)達(dá)17。形成分離純化S6菌株的棉花枯萎病菌拮抗蛋白的可靠技術(shù)路線，為研究和生產(chǎn)防治棉花枯萎病菌的生物制劑提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：棉花枯萎病;拮抗蛋白;分離純化;芽孢桿菌

中圖分類號(hào)：S476 ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.06.002

Abstract： In order to study the protein of the bacterial strain （S6） which was identified as bacillus could antagonistic against cotton fusarium wilts efficiently， S6 bacteria was cultured by liquid fermentation， and crude protein extract was obtained by preliminary extraction. The crude extract was purified by ammonium sulfate precipitation， Sephadex G-50 desalting， Sephadex G-100 gel chromatography， DEAE-52 cellulose ion exchange chromatography， the protein with high antagonistic effect on cotton fusarium wilt was obtained， and the purification multiple reached 17 times. The reliable technical route for separating and purifying cotton fusarium wilt antagonistic protein of S6 strain was formed，which provided a theoretical basis for the research and production of biological agents for controlling cotton fusarium wilt.

Key words： cotton fusarium wilt; antagonistic protein; isolation and purification; bacillus

棉花枯萎病菌由尖孢鐮刀菌萎蔫?；停‵usarium oxysporum f.sp.vasinfectum）引起，它們使棉花萎蔫致死，且極難防治，造成的經(jīng)濟(jì)損失也最慘重[1-3]。抗病育種由于高抗種質(zhì)資源缺乏，育種方法單一等原因，致使育種工作進(jìn)展緩慢[2];化學(xué)藥劑防治效果差，還會(huì)加重環(huán)境污染，可形成抗逆性很強(qiáng)的微菌核[4]。因此，開辟新的防病措施已成為當(dāng)務(wù)之急，而生物防治以其無毒無害等優(yōu)點(diǎn)給棉花枯萎病的防治帶來了新的希望[5]?？菸∩兰?xì)菌中比較有前途的種類是嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophila）[6]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[7-9]、熒光假單胞桿菌（Pseudomonas fluorescens）[10]等?？咕鞍椎姆蛛x提取和研究，是以不同分離提純技術(shù)的組合形成的分離方案為基礎(chǔ)的?，F(xiàn)行的蛋白分離技術(shù)主要有以下幾種：硫酸銨沉淀法、凝膠色譜法、離子交換層析法、SDS-PAGE法、高效液相色譜法等。

本研究利用傳統(tǒng)研究技術(shù)與現(xiàn)代微生物技術(shù)結(jié)合從土壤中篩選到有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高效拮抗菌株枯草芽孢桿菌S6菌，采用分子生物學(xué)手段分離純化對(duì)棉花枯萎病菌有拮抗作用的蛋白質(zhì)，目的是形成分離純化該蛋白的技術(shù)路線，為其應(yīng)用于微生物農(nóng)藥，有效防治枯萎病提供理論依據(jù)和應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 尖孢鐮刀菌（F. oxysporum） ，由中國農(nóng)科院簡桂良教授惠贈(zèng);枯草芽孢桿菌（B.subtilis）S6由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室自主篩選，從湖南、廣西、北京等地采集辣椒、黃瓜、煙草等根際周圍土樣中自主篩選。

1.1.2 培養(yǎng)基[11] LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基：培養(yǎng)S6菌;PDA（Potato Dextrose Agar）培養(yǎng)基：培養(yǎng)棉花枯萎病菌株，測(cè)定抗菌活性。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 S6菌的活化與指標(biāo)平板的制作 S6菌用劃線法涂布于LB培養(yǎng)基活化，培養(yǎng)過夜，挑取單菌落劃平板，再次活化，放入4 ℃冰箱備用。挑取枯萎病菌單菌落，用劃線分別法接種于PDA固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，挑取枯萎病菌接于PDA液體培養(yǎng)基，28 ℃以200 r·min-1在搖床培養(yǎng)24 h，用紗布過濾后，取含孢子的培養(yǎng)液稀釋0.5 mL，均勻涂布于剛凝固的PDA固體培養(yǎng)基，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，然后放入4 ℃冰箱備用。

1.2.2 粗蛋白的提取、分級(jí)沉淀與拮抗活性驗(yàn)證[12]將S6菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)36 h。收集發(fā)酵液分裝于200 mL離心管8 000 r·min-1離心10 min去除菌體，取上清即為蛋白粗提液。粗提液中緩慢加入粉末狀硫酸銨使其飽和度達(dá)40%，于4 ?℃冰箱中靜置30 min，后10 000 r·min-1離心15 min，分離上清液，沉淀溶于5 mL 0.05 mol·L-1、pH 值7.2的磷酸緩沖液中，即為40%硫酸銨沉淀蛋白粗提液。取上一步離心后的上清液，加入硫酸銨使飽和度達(dá)到70%，按同樣方法處理，即得到70%硫酸銨沉淀蛋白粗提液。用同樣方法處理，即可得到100%硫酸銨沉淀蛋白粗提液。接不同濃度的硫酸銨沉淀蛋白粗提液于PDA平板，在PDA平板上將枯萎病菌接種于平板中央，28 ℃培養(yǎng)24 h在菌絲周圍打孔，將待測(cè)的活性物質(zhì)注入孔內(nèi)，每孔約200 μL，28 ℃下再培養(yǎng)，觀察抑菌狀況及抑菌圈大小，重復(fù)3次。蛋白活性（mm2·mg-1）=抑菌圈面積/蛋白含量[13-14]。1.2.3 拮抗蛋白的純化 （1）Sephadex G-50除鹽。將預(yù)處理過的Sephadex G-50用0.05 mol·L-1的磷酸緩沖液（pH值 7.2）平衡后裝柱（26 mm×300 mm），上樣量6 mL，再用同樣磷酸緩沖液洗脫，流速為50 mL·h-1，洗脫液分部收集，繪制洗脫曲線。收集洗脫峰，用鈉氏試劑檢測(cè)無鹽，裝入透析袋中用聚乙二醇6 000濃縮至6 mL左右。

（2）Sephadex G-100分離蛋白。將預(yù)處理過的Sephadex G-100用同樣的磷酸緩沖液平衡后裝柱，上樣量6 mL，用同樣的磷酸緩沖液洗脫，流速為50 mL·h-1，洗脫液分部收集，繪制洗脫曲線。用鈉氏試劑檢測(cè)各洗脫峰為無鹽，分別裝入透析袋中用聚乙二醇6 000濃縮至5 mL左右。

（3）DEAE-52纖維素純化蛋白。將經(jīng)過凝膠過濾的經(jīng)平板檢驗(yàn)有活性的蛋白液加入離子交換柱，用含0.1～0.6 mol·L-1 NaCl的0.05 mol·L-1 pH值為7.2的磷酸緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，流速為50 mL·h-1，洗脫液分部收集，繪制洗脫曲線。用鈉氏試劑檢測(cè)各洗脫峰為無鹽，分別裝入透析袋中用聚乙二醇6 000濃縮至5 mL左右。

（4）用平板打孔法測(cè)定各合并管拮抗活性，保留具有拮抗活性的峰管。留存250 μL樣品作為試驗(yàn)對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 分級(jí)沉淀粗蛋白的拮抗活性對(duì)比

對(duì)粗蛋白進(jìn)行分級(jí)沉淀，粗蛋白液、40%沉淀蛋白、70%沉淀蛋白、100%沉淀蛋白質(zhì)量濃度分別為12.65，51.12，26.25，8.83 g·L-1。把它們分別接于棉花枯萎病菌指示平板中，對(duì)照為pH值為7.2的0.05 mol·L-1的磷酸緩沖液，觀察抑菌情況（圖1）。

根據(jù)抑菌結(jié)果，分別測(cè)定了抑菌圈直徑并計(jì)算了各抑菌圈的蛋白活性（表1）。結(jié)果顯示：粗蛋白提取液以及3種鹽析蛋白均有抑菌活性，100%硫酸銨沉淀蛋白的棉花枯萎病菌的抑菌圈最小，蛋白活性最弱;70%硫酸銨沉淀蛋白作用的棉花枯萎病菌的抑菌圈最大，蛋白活性也最強(qiáng);40%硫酸銨沉淀蛋白的棉花枯萎病菌有較好抑制作用，但不如70%硫酸銨沉淀蛋白作用明顯。由此可知，70%硫酸銨沉淀蛋白粗提液抑制效果最佳，可作為下一步研究對(duì)象。

2.2 Sephadex G-50除鹽

選經(jīng)70%硫酸銨鹽析的S6菌的蛋白，經(jīng)Sephadex G-50層析脫鹽，280 nm檢測(cè)，得到1個(gè)峰形陡的蛋白峰（圖2）。

2.3 Sephadex G-100分離蛋白并檢測(cè)活性

脫鹽后的蛋白再用Sephadex G-100分離純化，得到2個(gè)峰（圖3），收集體積分別為12 mL和60 mL，濃縮為5 mL左右，峰一蛋白的質(zhì)量濃度1.01 g·L-1、峰二蛋白的質(zhì)量濃度3.21 g·L-1。用打孔法檢測(cè)拮抗性，觀察抑菌情況（圖4）。

根據(jù)抑菌結(jié)果，分別測(cè)定了抑菌圈直徑并計(jì)算了各抑菌圈的蛋白活性（表2）。

由圖4與表2可知，G-100純化后的峰一蛋白與峰二蛋白對(duì)棉花枯萎病菌有拮抗活性，但峰二蛋白的抑制現(xiàn)象更為明顯，蛋白活性提高到11.74 mm2·mg-1，可作為進(jìn)一步純化對(duì)象。

2.4 DEAE-52纖維素純化蛋白并檢測(cè)活性

用DEAE-52纖維素分離純化經(jīng)Sephadex G-100分離后的峰二蛋白，得到2個(gè)洗脫峰，其洗脫體積分別為36 mL、20 mL，用PEG 6 000濃縮至5 mL，蛋白質(zhì)量濃度分別為1.20 g·L-1、0.81 g·L-1。

用打孔法檢測(cè)拮抗性，觀察抑菌情況（圖5）。根據(jù)抑菌結(jié)果，分別測(cè)定了抑菌圈直徑并計(jì)算了各抑菌圈的蛋白活性（表3）。

經(jīng)DEAE純化后峰一蛋白對(duì)棉花枯萎菌拮抗作用較強(qiáng)，蛋白活性提高到了21.58 mm2·mg-1。由此可知，初步得到了棉花枯萎病菌的拮抗蛋白（圖5、表3）。

2.5 純化效率

為了了解純化效率，計(jì)算了每一步的純化倍數(shù)（表4）。

從S6菌產(chǎn)生的粗蛋白對(duì)枯萎菌的蛋白活性為1.25，而經(jīng)過硫酸銨分段沉淀、G100、DEAE分離純化后蛋白活性提高到了21.58 mm2·mg-1。純化倍數(shù)達(dá)到了17倍。說明我們經(jīng)過一系列的分離純化得到了較純的對(duì)棉花枯萎菌有拮抗活性的蛋白，也說明我們的設(shè)計(jì)方案是可行的。該方案可用于拮抗枯萎菌蛋白的分離純化（表4）。

3 結(jié)論與討論

隨著對(duì)生態(tài)環(huán)境保護(hù)意識(shí)的提高，可以大規(guī)模生產(chǎn)的無毒、不破壞環(huán)境、已經(jīng)成為防治棉花枯萎病菌等病蟲害的主要方法之一。齊東梅等[15]從土貝母和臘腸等中藥和發(fā)酵食品中篩選出對(duì)棉花枯萎病菌有廣譜拮抗作用的芽孢桿菌29株，經(jīng)初步鑒定為枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。孫瑤等[16]從根際土壤中分離到對(duì)棉花枯萎病菌具有強(qiáng)烈拮抗細(xì)菌BDT-25，經(jīng)生理生化特征的鑒定證明為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。李術(shù)娜等[17]從棉花葉部組織中分離出LC-04菌株，實(shí)驗(yàn)證明菌株發(fā)酵液中含有對(duì)大麗輪枝菌有拮抗活性的蛋白質(zhì)類抗菌物質(zhì)，經(jīng)鑒定也是一株類芽孢桿菌。郝華昆等[18]分離得到對(duì)棉花枯萎病原真菌具有強(qiáng)烈抑制作用的菌株B110，經(jīng)鑒定也為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。本研究采用從湖南、廣西、北京等地采集的辣椒、黃瓜、煙草等根際周圍土樣中自主篩選的對(duì)枯萎病菌都有一定拮抗作用的S6菌，經(jīng)過檢測(cè)確定為芽孢桿菌。由此可知，芽孢桿菌普遍對(duì)枯萎病菌有一定的拮抗作用。

杜紅方[19]通過硫酸銨的分級(jí)沉淀、DEAE-Sephadex A-50與Sepharyl S-100，從LC105菌株的發(fā)酵液中得到了一種對(duì)棉花黃萎病菌具有拮抗作用的抗菌蛋白。胡明[20]確定硫酸銨分級(jí)沉淀在40%～60%范圍內(nèi)，經(jīng)過DEAE弱陰離子交換柱，并采用pH值 6.0的MES樣品緩沖液，用0～l mol·L-1的NaCI線性洗脫。再采用Sephacryl S-100凝膠的分子篩層析方法進(jìn)行分離，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果顯示獲得了一個(gè)純的蛋白組分。

本研究利用硫酸銨沉淀法初步分離了活性蛋白，而后采用凝膠層析和離子交換層析法進(jìn)行分離純化，拮抗棉花枯萎病菌的蛋白活性從最初的1.25 mm2·mg-1提高到了21.58 mm2·mg-1，純化倍數(shù)達(dá)17.2倍。說明本文采取的技術(shù)方法是合理的，可以用于S6菌中棉花枯萎病菌拮抗蛋白的分離提取。但所得蛋白是否單一還不得而知，要進(jìn)一步深入研究，需要采用更高級(jí)的分離技術(shù)，從而得到對(duì)棉花枯萎病菌的拮抗活性的特異蛋白。

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