李余潤(rùn) 王馨 楊麗英 楊斌 寧玲 董志淵

摘 ? ?要：原生質(zhì)體是進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序和基因編輯研究的理想材料。為了研究不同酶解時(shí)間對(duì)燈盞花原生質(zhì)體分離的影響，采用纖維素酶1%+果膠酶0.3%+半纖維素酶0.5%酶液處理愈傷組織懸浮細(xì)胞2，3，4，5，6 h，纖維素酶0.5%+果膠酶0.2%+離析酶0.5%酶液處理幼葉4，6，8，10，12，14，16 h。結(jié)果表明，不同酶解時(shí)間，燈盞花懸浮細(xì)胞和幼葉的原生質(zhì)體產(chǎn)量及活力均差異顯著。懸浮細(xì)胞酶解5 h，原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力達(dá)到最高，分別為3.73×105個(gè)·g-1 、75.84%;幼葉酶解12 h，原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，達(dá)到1.17×106個(gè)·g-1，酶解10 h，原生質(zhì)體活力最高，為80.98%。葉片的原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力明顯高于懸浮細(xì)胞。

關(guān)鍵詞：燈盞花;原生質(zhì)體;酶解時(shí)間;產(chǎn)量;活力

中圖分類號(hào)：S567.2 ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.06.004

Abstract： Protoplast is an ideal material for single-cell sequencing and gene editing. In order to optimize enzymatic hydrolysis times for the protoplast isolation of Erigeron breviscapus， suspension cells were incubated in an enzyme solution containing 1% cellulase， 0.3% pectinase and 0.5% hemicellulase for the 2，3，4，5，6 h and young leaves were incubated in an enzyme solution containing 0.5% cellulase， 0.2% pectinase and 0.5% macerozyme for the 4，6，8，10，12，14，16 h. The results showed enzymatic hydrolysis times significantly affect protoplast yield and viability. Five-hour enzyme incubation produced the maximum yield （3.73×105 protoplasts·g-1） and viability（75.84%） of protoplasts from suspension cells. Using young leaves as materials， the maximum yield（1.17×106 protoplasts·g-1） of the protoplasts was obtained at 12 h and the maximum viability（80.98%） was obtained at 10 h. The yield and viability of protoplasts from young leaves were both higher than those from suspension cells.

Key words： Erigeron breviscapus; protoplast; enzymatic hydrolysis time; yield; viability

燈盞花（Erigeron breviscapus）為菊科飛蓬屬多年生草本植物，全草入藥，具有祛風(fēng)散寒、活血通絡(luò)止痛等功效[1]。藥理研究表明，燈盞花含有黃酮、咖啡酸酯、揮發(fā)油等有效成分，具有神經(jīng)保護(hù)、心腦血管保護(hù)、抗氧化、抗癌以及抗炎等藥理作用[2]。以燈盞花為主要原料，已生產(chǎn)出燈盞花素片、燈盞細(xì)辛膠囊、燈盞細(xì)辛注射液以及燈盞花素注射液等藥品[3]。

燈盞花原料種植中，主要采用種子進(jìn)行育苗[4]。異花授粉、自交不親和的繁育特性造成種植群體遺傳變異大，有效成分的不穩(wěn)定[5-7]。生產(chǎn)中，急需一種高效的單株無(wú)性快繁技術(shù)，培育基因型一致、遺傳穩(wěn)定的種苗。目前，以燈盞花葉片為外植體，初步建立了愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化增殖及壯苗生根的快繁體系，但不定芽誘導(dǎo)系數(shù)較低[8-9]。關(guān)于愈傷組織離體再生形成不定芽的機(jī)制仍不清楚。因此，有必要分離葉片及其愈傷組織細(xì)胞，進(jìn)行不同類型細(xì)胞脫分化、再生能力差異研究，為提高植株再生效率、優(yōu)化無(wú)性快繁技術(shù)提供理論依據(jù)。

植物原生質(zhì)體是指脫去細(xì)胞壁，由質(zhì)膜所包圍的具有生活力的細(xì)胞。由于沒(méi)有細(xì)胞壁的阻礙，原生質(zhì)體更容易從外界攝入DNA，更容易進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位[10-11]、基因編輯[12-13]等方面研究;同時(shí)，原生質(zhì)體呈游離狀態(tài)，為單細(xì)胞測(cè)序研究，從單細(xì)胞水平分析植物發(fā)育的分子機(jī)制提供了可能[14]。目前，關(guān)于燈盞花原生質(zhì)體的研究未見(jiàn)報(bào)道。

酶解是分離植物原生質(zhì)體的主要方法。纖維素酶、半纖維素酶降解細(xì)胞壁中的纖維素、半纖維素，果膠酶降解連接細(xì)胞的中膠層。本研究以愈傷懸浮細(xì)胞、離體植株幼嫩葉片為材料，采用酶解法，分離制備燈盞花原生質(zhì)體，試驗(yàn)比較酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量、活力的影響，為下一階段開展細(xì)胞異質(zhì)性、離體再生機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

燈盞花（Erigeron breviscapus）植株取自云南省昆明市盤龍區(qū)，用于愈傷組織的誘導(dǎo)及懸浮培養(yǎng);種子采自云南省彌渡縣，用于無(wú)菌苗的培養(yǎng)。

1.2 方 法

1.2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)及懸浮培養(yǎng) 取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲害的植株葉片，消毒后切成約（0.5×0.5）cm的方塊，接種到固體培養(yǎng)基（MS + 2， 4-D 2.0 mg·L-1+ BA 0.5 mg·L-1+ 活性炭2 g·L-1）上，25 ℃黑暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)形成愈傷組織。繼代2次后，選取淺黃色、疏松的愈傷組織1 g，轉(zhuǎn)入50 mL液體培養(yǎng)液（MS+酸水解酪蛋白500 mg·L-1+ 2，4-D 1.0 mg·L-1+TDZ 0.2 mg·L-1）中。25 ℃黑暗條件下，120 r·min-1培養(yǎng)3 d，獲得懸浮細(xì)胞。

1.2.2 無(wú)菌苗培養(yǎng) 選取飽滿種子，接種在固體培養(yǎng)基（1/2 N6 + 酸水解酪蛋白1 g·L-1 + NAA 0.5 mg·L-1 + 活性炭2 g·L-1）上，培養(yǎng)獲得離體植株。葉片用于原生質(zhì)體的分離。

1.2.3 酶解時(shí)間篩選 ? 懸浮細(xì)胞過(guò)60目細(xì)胞篩后，800 r·min-1離心5 min，吸除上清液，保留底部細(xì)胞層，加入10 mL酶液（纖維素酶1%+果膠酶0.3%+半纖維素酶0.5%）。25 ℃黑暗條件下，60 r·min-1酶解處理2，3，4，5，6 h。

稱取生長(zhǎng)旺盛的離體植株幼嫩葉片0.7 g，切成1～2 mm寬的細(xì)條，放入10 mL酶液（纖維素酶0.5% +果膠酶0.2% + 離析酶0.5%）中。25 ℃黑暗條件下，60 r·min-1酶解處理4，6，8，10，12，14，16 h。

1.2.4 原生質(zhì)體純化收集 酶解結(jié)束后，70 μm尼龍濾網(wǎng)過(guò)篩，收集酶液，500 r·min-1離心5 min，棄上清。沉積于底部的原生質(zhì)體用13% CPW洗滌液（27.2 mg·L-1 KH2PO4、101.0 mg·L-1 KNO3、1 480.0 mg·L-1 CaCl2、246.0 mg·L-1 MgSO4、0.16 mg·L-1 KI、0.025 mg·L-1 CuSO4、13%（m·V-1）甘露醇，pH值 6.0）懸浮清洗，置換3次（800 r·min-1，5 min）。液體培養(yǎng)液重懸保存。

1.2.5 原生質(zhì)體的產(chǎn)量測(cè)定 采用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定原生質(zhì)體產(chǎn)量，重復(fù)3次。統(tǒng)計(jì)中央大方格內(nèi)25個(gè)中方格的原生質(zhì)體數(shù)目，根據(jù)如下公式計(jì)算原生質(zhì)體密度、原生質(zhì)體產(chǎn)量：

原生質(zhì)體的密度（個(gè)·mL-1）= 中央大方格內(nèi)的原生質(zhì)體數(shù)×10×1 000

原生質(zhì)體產(chǎn)量（個(gè)·g-1） =（原生質(zhì)體密度×懸浮液總體積）/用于分離原生質(zhì)體的材料鮮質(zhì)量

1.2.6 原生質(zhì)體的活力檢測(cè) 采用二乙酸熒光素（FDA）-酚番紅花紅雙染色法檢測(cè)原生質(zhì)體活力，重復(fù)3次。取純化后的原生質(zhì)體懸浮液20 μL于載玻片上，依次加入2 μL 1%FDA和0.1% 酚番紅花紅染色液，室溫靜置孵育2 min，熒光顯微鏡下藍(lán)光激發(fā)鏡檢，發(fā)綠色熒光的原生質(zhì)體具有活性，呈紅色的無(wú)活性。隨機(jī)選取細(xì)胞數(shù)目大于10的5個(gè)視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。采用如下公式統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體活力：

原生質(zhì)體活力（%）= 發(fā)綠色熒光的原生質(zhì)體數(shù)/原生質(zhì)體總數(shù)×100

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和相關(guān)性分析，Origin 2017軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解時(shí)間對(duì)懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體分離的影響

采用纖維素酶1% + 果膠酶0.3% + 半纖維素酶0.5%的酶液處理懸浮細(xì)胞2，3，4，5，6 h。結(jié)果表明，未經(jīng)酶解的懸浮細(xì)胞單個(gè)或多個(gè)粘連成團(tuán)，細(xì)胞形狀不規(guī)則，多呈卵形、月型、橢圓形;酶解2 h，細(xì)胞開始分離，形成少量圓形的原生質(zhì)體;酶解3，4 h，隨酶解時(shí)間延長(zhǎng)，原生質(zhì)體產(chǎn)量、活力均逐漸增加;酶解5 h，形成少量細(xì)胞碎片，原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力達(dá)到最高，分別為3.73×105個(gè)·g-1、75.84%;酶解6 h，細(xì)胞碎片明顯增多，產(chǎn)量和活力均逐漸下降（圖1）。方差分析表明，不同酶解時(shí)間，原生質(zhì)體產(chǎn)量、活力差異顯著（P<0.05）。酶解5 h的原生質(zhì)體產(chǎn)量、活力均顯著高于其它4個(gè)酶解時(shí)間。相關(guān)性分析表明，原生質(zhì)體的產(chǎn)量與活力存在顯著性相關(guān)（r = 0.949，P<0.05）。

2.2 酶解時(shí)間對(duì)幼葉原生質(zhì)體分離的影響

采用纖維素酶0.5% + 果膠酶0.2% + 離析酶0.5%的酶液處理幼葉4，6，8，10，12，14，16 h。結(jié)果表明，酶解4 h，細(xì)胞主要呈團(tuán)狀，形成的原生質(zhì)體數(shù)量較少;酶解6，8，10，12 h，隨酶解時(shí)間延長(zhǎng)，原生質(zhì)體產(chǎn)量逐漸增加，其中酶解12 h，原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，達(dá)到1.17×106個(gè)·g-1，酶解14，16 h，細(xì)胞碎片增加，原生質(zhì)體產(chǎn)量逐漸下降。同時(shí)，酶解4，6，8，10 h，原生質(zhì)體活力逐步增加，酶解10 h，原生質(zhì)體活力最高，為80.98%，酶解12，14，16 h，原生質(zhì)體活力逐漸下降（圖2）。方差分析表明，不同酶解時(shí)間，原生質(zhì)體產(chǎn)量、活力差異顯著（P<0.05），酶解10 h的原生質(zhì)體活力極顯著地高于其它6個(gè)酶解時(shí)間。

3 討論與結(jié)論

3.1 原生質(zhì)體產(chǎn)量及活力變化規(guī)律

酶解時(shí)間是影響原生質(zhì)體分離的重要因素。酶解時(shí)間短，原生質(zhì)體不能完全分離，產(chǎn)量較低;酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)， 細(xì)胞易破碎和失活， 原生質(zhì)體產(chǎn)量、活力也較低[15-18]。本研究也獲得相似的結(jié)果。采用不同酶解時(shí)間處理燈盞花懸浮細(xì)胞和幼葉，原生質(zhì)體的產(chǎn)量及活力差異顯著，均呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)，其中懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體的產(chǎn)量與活力變化達(dá)到顯著相關(guān)性。

3.2 材料對(duì)酶解時(shí)間的影響

材料是影響酶解時(shí)間的重要因素。幼嫩材料如子葉、幼葉等，適宜酶解時(shí)間一般較短，大約為6～10 h[19-22]。愈傷組織可能受繼代次數(shù)的影響，適宜酶解時(shí)間變幅較大。以大豆（Glycine max）繼代培養(yǎng)15～20 d 的愈傷組織分離制備原生質(zhì)體，酶解5 h原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力最高[23]。而苜蓿（Medicago sativa）繼代10～12次的愈傷組織，需酶解12 h有活力的原生質(zhì)體產(chǎn)量才能達(dá)到最大值[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，燈盞花懸浮細(xì)胞和幼葉的原生質(zhì)體產(chǎn)量、活力以及適宜酶解時(shí)間存在較大差異。懸浮細(xì)胞酶解5 h，原生質(zhì)體產(chǎn)量、活力達(dá)到最高值，而幼葉酶解10 h原生質(zhì)體活力最高，酶解12 h原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，其原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力普遍高于懸浮細(xì)胞。該研究結(jié)果可能與兩種材料的組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞活力差異有關(guān)。懸浮細(xì)胞為單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)，能與酶液充分接觸，所需酶解時(shí)間較短，較長(zhǎng)酶解時(shí)間，易造成原生質(zhì)體破碎。同時(shí)，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中可能發(fā)生的活力下降情況，影響了原生質(zhì)體的活力。幼葉只能逐層接觸酶液，其適宜的酶解時(shí)間較長(zhǎng)。由于幼葉取自活體植株，細(xì)胞活力較強(qiáng)，分離制備的原生質(zhì)體活力也可能較高。

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