劉付松 陳翠莎 孫佩 劉莎 韋中蘭 劉小琪 吳發(fā)明

中圖分類號 R917 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）14-1677-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.14.03

摘 要 目的：建立同時測定黨參藥材中黨參炔苷、丁香苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量的方法，并比較不同品種及采收期黨參藥材中上述5種成分的含量。方法：采用高效液相色譜法（HPLC）。色譜柱為Inertsil ODS-3，流動相為乙腈-水（梯度洗脫），檢測波長為210 nm（黨參炔苷）、220 nm（蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、丁香苷）、276 nm（蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅰ），流速為0.8 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為20 μL。結(jié)果：黨參炔苷、丁香苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為44.30～886.00 μg/mL（r=0.999 7）、6.50～130.03 μg/mL（r=0.999 6）、4.47～89.46 μg/mL（r=0.999 5）、2.53～50.50 μg/mL（r=0.999 4）、5.64～112.80 μg/mL（r=0.999 5）;定量限分別為2.446 0、0.168 0、0.248 1、0.065 7、0.099 8 μg/mL，檢測限分別為1.352 0、0.067 2、0.005 4、0.006 3、0.007 3 μg/mL;精密度、穩(wěn)定性（24 h）、重復(fù)性、耐用性試驗的RSD均小于2%;加樣回收率分別為98.87%～100.62%（RSD=0.73%，n=6）、98.46%～101.54%（RSD=1.15%，n=6）、98.32%～101.12%（RSD=1.19%，n=6）、96.83%～104.16%（RSD=2.62%，n=6）、97.87%～100.99%（RSD=1.07%，n=6）。含量分別為33.78～431.82、0～20.60、0.44～3.68、0～10.83、0.27～73.40 μg/g。黨參炔苷含量由高到低為黨參>川黨參>素花黨參>洛黨參;丁香苷為黨參>素花黨參>川黨參，在洛黨參中未檢出;蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅰ為素花黨參>洛黨參>黨參>川黨參;蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅱ為黨參>素花黨參，在川黨參和洛黨參中未檢出;蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ為黨參>素花黨參>洛黨參>川黨參。6～10月采收的黨參藥材中均以黨參炔苷含量最高;6～10月蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅰ含量均較低;8月蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅱ未檢出;9月蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅱ含量較低，且丁香苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅱ在部分樣品中未檢出。結(jié)論：所建HPLC法操作簡單、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于同時測定黨參藥材中5種有效成分的含量;不同品種及采收期黨參藥材中5種有效成分含量存在較大差異。

關(guān)鍵詞 黨參;黨參炔苷;丁香苷;蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅰ;蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅱ;蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ;高效液相色譜法;品種;采收期;含量測定

Comparative Study on Contents of 5 Active Ingredients in Different Varieties and Harvesting Periods of Codonopsis Radix

LIU Fusong1，CHEN Cuisha1，SUN Pei2，LIU Sha1，WEI Zhonglan1，LIU Xiaoqi1，WU Faming1（1. College of Pharmacy， Zunyi Medical University， Guizhou Zunyi 563003， China; 2. Industrial Crop Research Institute， Sichuan Academy of Agriculture Sciences， Chengdu 610300， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of the contents of codonopatin， syringin， atractylenolide Ⅰ， atractylenolide Ⅱ and atractylenolide Ⅲ， and to compare the contents of above 5 components in different varieties and harvesting periods of Codonopsis Radix. METHODS： HPLC method was used. The column was Inertsil ODS-3 with mobile phase consisted of acetonitrile-water （gradient elution） at the flow rate of 0.8 mL/min. The detection wavelengths were 210 nm （codonopatin）， 220 nm （syringin， atractylenolide Ⅱ， atractylenolide Ⅲ）， 276 nm （atractylenolideⅠ）. The column temperature was set at 30 ℃， and the sample size was 20 μL. RESULTS： The linear range of codonopatin， syringin， atractylenolide Ⅰ， atractylenolide Ⅱ and atractylenolide Ⅲ were 44.30-886.00 μg/mL （r=0.999 7）， 6.50-130.03 μg/mL （r=0.999 6）， 4.47-89.46 μg/mL （r=0.999 5）， 2.53-50.50 μg/mL （r=0.999 4）， 5.64-112.80 μg/mL （r=0.999 5）; the limits of quantification were 2.446 0， 0.168 0， 0.248 1， 0.065 7， 0.099 8 μg/mL， and detection limits were 1.352 0， 0.067 2， 0.005 4， 0.006 3， 0.007 3 μg/mL; RSDs of precision， stability （24 h）， repeatability and durability tests were all less than 2%; the recoveries were 98.87%-100.62% （RSD=0.73%， n=6）， 98.46%-101.54% （RSD=1.15%， n=6）， 98.32%-101.12% （RSD=1.19%， n=6）， 96.83%-104.16% （RSD=2.62%， n=6）， 97.87%-100.99% （RSD=1.07%， n=6）. The average contents were 33.78-431.82，0-20.60，0.44-3.68，0-10.83，0.27-73.40 μg/g. The content of codonopatin was in descending order was as follows as Codonopsis pilosula>C. tangshen>C. pilosula Nannf. var. modesta （Nannf.） L. T. Shen>ecotypic variety of C. tangshen. The content of syringin in descending order was C. pilosula>C. pilosula Nannf. var. modesta （Nannf.） L. T. Shen>C. tangshen， but it was not detected in ecotypic variety of C. tangshen. The content of atractylenolide Ⅰ in descending order was C. pilosula Nannf. var. modesta （Namf.） L. T. Shen>ecotypic variety of C. tangshen>C. pilosula>C. tangshen. The content of atractylenolide Ⅱ in C. pilosula was higher than C. pilosula Nannf. var. modesta （Nannf.） L. T. Shen， but was no detected in C. tangshen and ecotypic variety of C. tangshen. The content of atractylenolide Ⅲ in descending order was C. pilosula>C. pilosula Nannf. var. modesta （Nannf.） L. T. Shen>ecotypic variety of C. tangshen>C. tangshen. In Codonopsis Radix collected from Jul. to Oct.， the content of codonopatin was the highest; the content of atractylenolide Ⅰ was lower in sample collected from Jun. to Oct.; atractylenolide Ⅱ was not detected in sample collected in Aug.; the contents of atractylenolide Ⅰ and atractylenolide Ⅱ were the lower in sample collected in Sept.， and syringin and atractylenolide Ⅱ were not detected in some samples. CONCLUSIONS： The established HPLC method is simple， accurate， highly sensitive and reproducible. It can be used to simultaneously determine 5 active ingredients contents of Codonopsis Radix; there are great difference in contents of 5 active ingredients in different varieties and harvesting periods of Codonopsis Radix.

KEYWORDS? ?Codonopsis Radix; Codonopatin; Syringin; Atractylenolide Ⅰ; Atractylenolide Ⅱ; Atractylenolide Ⅲ; HPLC; Variety; Harvesting period; Content determination

黨參（Codonopsis Radix）為桔?？浦参稂h參[Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.]、素花黨參[C. pilosula Nannf. var. modesta（Nannf.）L. T. Shen]或川黨參[C. tangshen Oliv.]的干燥根[1];洛黨參（Ecotypic variety of C. tangshen）為桔?？浦参锎h參（C. tangshen Oliv.）生態(tài)型變種的干燥根，是黨參藥材的重要地方栽培品種之一[2]。黨參是我國常用的傳統(tǒng)補益類中藥，味甘、性平，具有補中益氣、健脾益肺、除煩止渴之功效，可用于治療脾肺虛弱、氣短心悸、食少便溏、內(nèi)熱消渴等癥[1]。該藥主要含有糖類、半萜內(nèi)酯類、聚炔類、苷類及萜類等化學(xué)成分[3-6]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黨參具有調(diào)節(jié)血糖、促進造血功能、抗缺氧、抗應(yīng)激、抗疲勞、增強機體免疫力、延緩衰老、調(diào)節(jié)胃收縮、保護胃腸道黏膜及抗?jié)兊茸饔肹7-9]。聚炔類成分黨參炔苷為黨參的指標(biāo)性成分，常用于評價黨參質(zhì)量[10];苷類成分丁香苷具有一定的體內(nèi)外抗腫瘤活性[11];半萜內(nèi)酯類成分蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅰ～Ⅲ為黨參的特征性成分，具有明顯的抗炎活性[12]。

黨參營養(yǎng)豐富、應(yīng)用廣泛，具有極大的食用和藥用價值[13]。但因無序采挖，其野生資源面臨枯竭，目前市場上流通的黨參多為人工栽培品種[14]。有研究表明，由于基原、產(chǎn)地、采收期的不同以及栽培、產(chǎn)地加工的不規(guī)范，使得黨參藥材中各種有效成分的含量存在較大差異，從而導(dǎo)致其質(zhì)量受到嚴(yán)重影響[15-19]。2015年版《中國藥典》（一部）僅對黨參進行了定性鑒別[1]，且方法簡單，無法滿足現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)發(fā)展的質(zhì)量控制要求。雖然，有學(xué)者對黨參中有效成分的含量進行了檢測[10-12]，但指標(biāo)較少。根據(jù)中醫(yī)理論，中藥藥效的發(fā)揮是多種成分共同作用的結(jié)果，其含量高低將直接影響中藥療效，因此僅以2～3種有效成分為指標(biāo)并不能全面反映黨參的整體質(zhì)量[20-21]。為此，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定了不同品種及采收期黨參藥材中黨參炔苷、丁香苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量，旨在為其質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括二元泵、自動進樣器、二極管陣列紫外檢測器（美國 Agilent 公司）;ME-204E型萬分之一電子分析天平、XPE-26型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）;SK250H型超聲波清洗機（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）;Milli-Q Advantage A10 型超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

丁香苷對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號：wkq16060805，純度：98.00%）;黨參炔苷對照品（批號：MUST-16062207，純度：98.88%）、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對照品（批號：MUST-17030201，純度：99.99%）、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ枺篗UST-17030202，純度：99.99%）、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品（批號：MUST-16032203，純度：99.99%）均由成都曼斯特生物科技有限公司提供;甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

25批黨參藥材（編號：DS1～DS19、SH1～SH2、CD1～CD2、LD1～LD2）經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院姚秋陽副教授鑒定，分別為桔?？浦参稂h參[C. pilosula（Franch.）Nannf.）]、素花黨參[C. pilosula Nannf. var. modesta（Nannf.）L. T. Shen]、川黨參（C. tangshen Oliv.）以及栽培品種洛黨參（Ecotypic variety of C. tangshen）的干燥根。黨參藥材來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～3 min，3.5%A;3～20 min，3.5%A→14%A;20～35 min，14%A→23%A;35～60 min，23%A→72%A;60～76 min，72%A→95%A）;檢測波長：210 nm（黨參炔苷）、220 nm（蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、丁香苷）、276 nm（蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅰ）;流速：0.8 mL/min;柱溫：30 ℃;進樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取黨參炔苷、丁香苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品各適量，分別置于5 mL量瓶中，加30%甲醇溶解并稀釋至刻度，得各單一對照品貯備液。精密量取上述各單一對照品貯備液適量，置于同一10 mL量瓶中，加30%甲醇稀釋至刻度，制得上述5種成分質(zhì)量濃度分別為886.00、130.03、89.46、50.50、112.80 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取黨參藥材適量，粉碎。精密稱取上述粉末約1.0 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入30%甲醇30 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率：400 W，頻率：50 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用30%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 空白對照溶液 以30%甲醇為空白對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液、空白對照溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，各成分理論板數(shù)按蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ計均不低于3 000，分離度均大于3，空白對照對測定無干擾，詳見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.25、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，分別置于5 mL量瓶中，加入30%甲醇稀釋并定容，得5個不同質(zhì)量濃度的系列線性工作溶液，另取“2.2.1”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，結(jié)果見表2。

2.5 定量限與檢測限考察

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，用甲醇倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計算定量限、檢測限。結(jié)果，黨參炔苷、丁香苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的定量限分別為2.446 0、0.168 0、0.248 1、0.065 7、0.099 8 μg/mL，檢測限分別為1.352 0、0.067 2、0.005 4、0.006 3、0.007 3 μg/mL。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液2.0 mL，置于5 mL量瓶中，加入30%甲醇稀釋并定容，制得黨參炔苷、丁香苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ質(zhì)量濃度分別為354.40、52.01、35.78、20.20、45.12 μg/mL的溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，上述5種成分峰面積的RSD分別為0.35%、0.18%、1.03%、0.64%、1.11%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：DS9）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、16、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，黨參炔苷、丁香苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ峰面積的RSD分別為0.15%、0.29%、1.81%、0.54%、0.21%（n=7），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗

取黨參藥材（編號：DS9）粉碎，精密稱取上述粉末適量，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品中5種成分的含量。結(jié)果，黨參炔苷、丁香苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的平均含量分別為335.54、11.87、3.01、8.02、24.41 μg/g，RSD分別為0.41%、0.98%、1.15%、0.84%、1.32%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的黨參藥材（編號：DS9）粉末適量，共6份，精密加入已知含量的黨參炔苷、丁香苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ各單一對照品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.10 耐用性試驗

取黨參藥材（編號：DS9）粉碎，精密稱取上述粉末適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件分別以不同流速（0.6、0.8、1.0 mL/min）、不同柱溫（25、30、35 ℃）進樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品中5種成分的含量。結(jié)果，5種成分含量的RSD均小于3%，表明方法耐用性良好。

2.11 樣品含量測定

取25批黨參藥材粉碎，精密稱取上述粉末適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品中5種成分的含量。每批樣品平行測定3次，結(jié)果見表4（表中，“-”表示未檢出）。

2.12 不同品種黨參藥材中5種有效成分含量的動態(tài)變化

不同品種黨參藥材中5種有效成分的含量存在差異。黨參炔苷含量由高到低為黨參>川黨參>素花黨參>洛黨參;丁香苷為黨參>素花黨參>川黨參，在洛黨參中未檢出;蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅰ為素花黨參>洛黨參>黨參>川黨參;蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅱ為黨參>素花黨參，在川黨參和洛黨參中均未檢出;蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ為黨參>素花黨參>洛黨參>川黨參，詳見圖2（因黨參炔苷含量過大，約為其他成分的20倍，可能會影響整體視圖效果，故將該成分含量縮小20倍，縮小后不影響其含量變化趨勢）。

2.13 不同采收期黨參藥材中5種有效成分含量的動態(tài)變化

6～10月采收的黨參藥材中均以黨參炔苷含量最高;6～10月蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅰ含量普遍較低;8月蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅱ未檢出;9月蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅱ含量較低，且丁香苷（LD1～LD2）、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅱ（SH1、CD1～CD2、LD1～LD2）在部分樣品中未檢出，詳見圖3（因黨參炔苷含量過大，約為其他成分的15倍，在圖中會影響整體視圖效果，故將黨參炔苷含量縮小15倍，縮小后不影響含量變化趨勢）。

3 討論

本課題組在前期預(yù)試驗中，對5種待測成分在200～400 nm全波長范圍內(nèi)進行了紫外光譜掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黨參炔苷在210 nm，蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、丁香苷在220 nm，蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅰ在276 nm波長處均有較強吸收，且對應(yīng)色譜峰峰形、分離度均較好，故選擇多波長進行檢測。本課題組分別對甲醇-水、乙腈-水等不同流動相體系進行了考察。結(jié)果顯示，以乙腈-水為流動相進行梯度洗脫時，流動相洗脫能力強，各成分分離效果較好，基線平穩(wěn)，出峰穩(wěn)定且峰形尖銳，故選擇乙腈-水為流動相。同時，本課題組還對不同提取溶劑（30%甲醇、70%甲醇、甲醇）進行了考察。結(jié)果顯示，以30%甲醇為提取溶劑時，各成分色譜峰峰面積均高于其他提取溶劑，故選擇30%甲醇為提取溶劑。此外，本課題組還對不同超聲提取時間（30、45、60 min）進行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲60 min時的峰面積低于超聲30、45 min，而超聲30、45 min提取時的峰面積差異不大，故考慮到節(jié)約時間和成本，本研究最終選擇超聲提取時間為30 min。

不同品種黨參藥材中5種有效成分含量存在較大差異，黨參中黨參炔苷、丁香苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量整體高于其他品種，素花黨參中蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅰ含量較高。究其原因可能與不同產(chǎn)地和不同來源黨參受品種、氣候、生長環(huán)境、土壤、水分、施肥及栽培方式等多種因素的影響有關(guān)[22-23]。6～10月采收的黨參藥材中均以黨參炔苷含量最高;6～10月蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅰ含量較低，8月蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅱ未檢出，9月丁香苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅱ含量較低。究其原因可能與不同采收期環(huán)境中生態(tài)因素（如土壤溫度、空氣溫度、空氣濕度、光合有效輻射等）會發(fā)生不同程度的變化等有關(guān)[24-25]。

綜上所述，本研究所建HPLC法操作簡單、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于同時測定不同品種及采收期黨參藥材中5種有效成分的含量;不同品種及采收期黨參藥材中5種有效成分的含量存在較大差異，基原和采收期可能是影響黨參質(zhì)量的因素之一。

參考文獻

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（收稿日期：2019-09-13 修回日期：2020-05-30）

（編輯：陳 宏）