趙江林，陳林，劉鈺浩，鄭彥伯，陳安均，劉興艷，侯曉艷，張志清

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625014)

類胡蘿卜素是天然色素的總稱，是一種呈黃色、橙紅色或者紅色的多烯類化合物，已被 FAO和 WHO等國際組織認(rèn)定為 A類營養(yǎng)色素，廣泛應(yīng)用于食品、藥品和化妝品等領(lǐng)域[1-2]。類胡蘿卜素主要存在于一些高等植物和微生物中，人體自身不能合成，主要從日常膳食中攝取[3]。能夠合成類胡蘿卜素的微生物較多，主要有酵母菌、霉菌、藻類和光合細(xì)菌等，其中酵母菌主要是紅酵母屬中的膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)、深紅酵母(Rhodotorularubra)及小紅酵母[Rhodotorulaminuta(Saito)Harrison]等具有產(chǎn)類胡蘿卜素的能力[4-5]。類胡蘿卜素也是類異戊二烯化合物的前體物質(zhì)，能夠形成多種香氣物質(zhì)(如2,2,6-三甲基環(huán)己酮、芳樟醇、β-大馬酮和β-紫羅蘭酮等)，而此類物質(zhì)又是果酒中的一種重要的香氣成分，在果酒釀造中具有重要作用[6]。

近幾年，對(duì)于獼猴桃釀造果酒的研究越來越多，主要集中在利用獼猴桃不同品種釀造果酒、獼猴桃專用釀酒酵母的篩選、降酸、防止VC損失和香氣不足等方面，其中酸度較高和香氣不足是獼猴桃果酒存在的主要問題[7]。針對(duì)獼猴桃酒香氣不足這一方面，有研究者提出利用非釀酒酵母和釀酒酵母混合發(fā)酵，既能豐富獼猴桃酒中的香氣成分，也能提高它的發(fā)酵速率[8]。王星辰[9]研究了膠紅酵母和釀酒酵母混合發(fā)酵對(duì)葡萄酒的增香效果，得出混合發(fā)酵能顯著提高葡萄酒中品種香氣(C6-化合物、C13-去甲類異戊二烯和萜烯類)和發(fā)酵類香氣(高級(jí)醇、乙酸酯、脂肪酸乙酯、脂肪酸及苯乙基類)的含量。孫明雪等[10]通過調(diào)控類異戊二烯合成途徑，來提高釀酒酵母中芳樟醇的產(chǎn)量，從而增加果酒中香氣物質(zhì)的含量。ANDRIANI等[11]研究了葡萄酒中類異戊二烯含量的變化，發(fā)現(xiàn)β-大馬酮的含量從發(fā)酵結(jié)束到陳釀3個(gè)月后顯著增加。MENDES-PINTO[12]論述了葡萄酒中類胡蘿卜素與類異戊二烯化合物之間的關(guān)系，提出了開發(fā)傳感模型來探究葡萄酒中某些化學(xué)成分和芳香化合物。王琦[13]研究了枸杞酒發(fā)酵過程中類胡蘿素降解產(chǎn)物對(duì)香氣的影響，并構(gòu)建了枸杞酒香氣質(zhì)量評(píng)價(jià)模型，研究類異戊二烯化合物對(duì)枸杞酒的香氣的貢獻(xiàn)，枸杞發(fā)酵后共檢測(cè)出8種類異戊二烯化合物，其中7種的氣味活性值均>1，對(duì)枸杞酒的香氣均有貢獻(xiàn)。

但是紅酵母在獼猴桃酒中的應(yīng)用尚未見報(bào)道，所以本文對(duì)該株產(chǎn)類胡蘿卜素的酵母進(jìn)行鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化，使其和釀酒酵母混合發(fā)酵，研究其對(duì)獼猴桃酒風(fēng)味的影響，為獼猴桃酒的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與菌種來源

秦美獼猴桃，購于雅安市雨城區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

菌株J36從四川農(nóng)興源農(nóng)業(yè)開發(fā)有限責(zé)任公司-欣妙酒莊發(fā)酵罐酒腳中分離所得，于(4±1)℃冰箱中保藏。

釀酒酵母：EC1118活性干酵母，上?？奠称凤嫎I(yè)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

YPD培養(yǎng)基：稱取40 g/L葡萄糖，10 g/L蛋白胨，10 g/L酵母膏，溶解于1 000 mL蒸餾水中，115 ℃滅菌20 min。

無水葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、NaCl、偏重亞硫酸鉀、NaOH、檸檬酸、無水Na2CO3、CuSO4·5H2O、KI、碘、領(lǐng)苯二甲酸氫鉀、硫代硫酸鈉等為分析純，萬科化學(xué)試劑公司；乙醇、乙酸正丁酯、甲醇、4-甲基-2-戊醇等為色譜純，上海阿拉丁試劑公司。

1.3 儀器與設(shè)備

D-37520離心機(jī)，Thermo Fisher；PHS-3C型酸度計(jì)，杭州奧立龍儀器有限公司；SPX-250生化培養(yǎng)箱，上海申賢恒溫設(shè)備廠；HR40-IIA2生物安全柜，南京溫諾儀器設(shè)備有限公司；CX21雙目光源生物顯微鏡，奧林巴斯有限公司；7890A/59750氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀，Agilent Technologies。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 菌種活化

菌株J36活化：將試管斜面保存的菌株J36在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基中純化3次，挑取2環(huán)接種于裝有10 mL酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose，YPD)培養(yǎng)液的試管中，28 ℃，120 r/min搖床暗箱培養(yǎng)24 h。然后按照10%的接種量接種于裝有100 mL YPD培養(yǎng)液的三角瓶(250 mL)中，28 ℃，120 r/min搖床暗箱培養(yǎng)3 d，用無菌生理鹽水將菌落總數(shù)調(diào)至約1×107CFU/mL，備用。

釀酒酵母活化：稱取1g EC1118活性干酵母，接種于裝有100 mL YPD培養(yǎng)液的三角瓶(250 mL)中，28 ℃，120 r/min搖床暗箱培養(yǎng)1 d，4 000 r/min離心10 min，去上清液，用無菌生理鹽水將沉淀懸浮，并利用顯微鏡計(jì)數(shù)法將菌落總數(shù)調(diào)至約1×107CFU/mL，備用。

1.4.2 菌株J36的鑒定

將活化好的菌液送往成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序后在NCBI網(wǎng)站中利用 BLAST 程序進(jìn)行同源序列比較分析，挑選幾株相似度較高和較低的菌株，在Clustal XP軟件中進(jìn)行序列比對(duì)，采用 MEGAX64 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[14]。

1.4.3 菌株J36的基本特性分析

1.4.3.1 溫度適應(yīng)范圍

將J36種子液按2%的接種量接種，分別置于15、18、21、24、27和30 ℃的溫度下培養(yǎng)，每隔24 h取樣，利用稀釋平板涂布法測(cè)定生長(zhǎng)曲線。

1.4.3.2 pH適用范圍

分別用檸檬酸和無水Na2CO3將培養(yǎng)基的pH調(diào)至2、3、4、5和6，將J36種子液按2%的接種量接種，每隔24 h取樣，利用稀釋平板涂布法測(cè)定生長(zhǎng)曲線。

1.4.3.3 SO2耐受性

用偏重亞硫酸鈉將SO2質(zhì)量濃度調(diào)至100、150、200、250和300 mg/L，將J36種子液按2%的接種量接種，每隔24 h取樣，利用稀釋平板涂布法測(cè)定生長(zhǎng)曲線。

1.4.3.4 酒精耐受性

用無水乙醇將酒精體積分?jǐn)?shù)調(diào)為8%、10%、12%、14%和16%，將J36種子液按2%的接種量接種，每隔24 h取樣，利用稀釋平板涂布法測(cè)定生長(zhǎng)曲線。

1.4.4 菌株J36和釀酒酵母混合發(fā)酵對(duì)獼猴桃酒風(fēng)味物質(zhì)的影響

樣品前處理：新鮮獼猴桃去皮打漿，加入100 mg/kg的果膠酶，于40 ℃培養(yǎng)箱中酶解4 h，用偏重亞硫酸鈉將SO2調(diào)整到80 mg/kg，離心，備用。

獼猴桃酒釀造：將獼猴桃汁用白砂糖調(diào)節(jié)可溶性固形物至24 °Brix，接入菌株J36和釀酒酵母，選取最佳發(fā)酵條件進(jìn)行獼猴桃酒的釀造，并以釀酒酵母單菌種發(fā)酵作為對(duì)照組(由于菌株J36不具有酒精發(fā)酵能力，故不設(shè)對(duì)照組)；主發(fā)酵期間，每天搖勻2～3次，每隔24 h稱重并測(cè)定可溶性固形物，當(dāng)可溶性固形物不再變化時(shí)，及時(shí)倒灌，將獼猴桃酒和酵母泥與沉淀分離，然后將酒裝滿，置于陰涼、干燥、通風(fēng)處陳釀30 d，測(cè)定獼猴桃酒中的基本理化指標(biāo)和揮發(fā)性成分，探究菌株J36和釀酒酵母混合發(fā)酵對(duì)獼猴桃酒品質(zhì)的影響。

1.5 分析方法

1.5.1 獼猴桃酒的理化指標(biāo)檢測(cè)

參考GB/T 15038—2006，對(duì)獼猴桃酒的理化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，酒精度采用密度瓶法，總糖用斐林滴定法，總酸的測(cè)定用酸堿滴定法，SO2的測(cè)定采用直接碘量法，VC用2,6-二氯靛酚滴定法。

1.5.2 獼猴桃酒的理化指標(biāo)檢測(cè)

固相微萃?。涸?5 mL的頂空瓶中加入1 g NaCl，4 mL酒樣和100 μL質(zhì)量濃度為1 788 mg/L的乙酸正丁酯作為內(nèi)標(biāo)，置于40 ℃水浴鍋中平衡10 min，然后將老化的固相微萃取頭插入頂空瓶中，萃取40 min，GC進(jìn)樣口解析5 min，對(duì)獼猴桃酒中的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析。

[3]參見萬明《白銀貨幣化與中外變革》，萬明主編:《晚明社會(huì)變遷問題與研究》，北京:商務(wù)印書館 2005年，第 144頁;吳承明:《市場(chǎng)·近代化·經(jīng)濟(jì)史論》，昆明:云南大學(xué)出版社 1996年，第 270頁。

氣相色譜的條件：分流方式為不分流，色譜柱為 19091S-433(30 m×0.25 mm)。程序升溫為 40 ℃保持8 min，以 5 ℃/min 的升溫速度升至200 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min 的升溫速度升至280 ℃，保持5 min。載氣為He，體積流量為1.2 mL/min，進(jìn)樣口溫度為250 ℃。

質(zhì)譜的條件：電離方式EI，電離電壓 70 eV，燈絲流量為 0.25 mA，連接桿溫度為280 ℃，電子倍增器電壓為1 500 V，掃描范圍為 30～350 AMU，離子源溫度為 250 ℃。

1.5.3 獼猴桃酒的理化指標(biāo)檢測(cè)

參照葡萄酒評(píng)比標(biāo)準(zhǔn)，邀請(qǐng)14名具有釀酒專業(yè)知識(shí)的人員，男生7名，女生7名，對(duì)陳釀后的獼猴桃酒進(jìn)行感官評(píng)定，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 感官評(píng)定表

1.5.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 9.0軟件分析，Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株J36的鑒定結(jié)果

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定

菌株J36在YPD培養(yǎng)基中，28 ℃，培養(yǎng)3 d，結(jié)果如圖1-A所示，菌落顏色為紅色，形狀為圓形，黏稠，表面光滑濕潤(rùn)，中央和邊緣顏色均一，易被挑起。菌株J36在YPE培養(yǎng)基中，28 ℃，搖床培養(yǎng)3 d后，菌液顏色為橙紅色。挑取少許菌液進(jìn)行涂片，并在顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖1-B所示，細(xì)胞顏色為亮白色，細(xì)胞為球形，單個(gè)或者成對(duì)，為出芽生殖。綜上所述，菌株J36具有酵母的典型特征，且菌落為紅色，故此判定菌株J36屬于紅酵母屬。

A-J36菌落形態(tài);B-J36在顯微鏡下的形態(tài)

將菌株J36ITS序列輸入NCBI網(wǎng)站的BLAST程序中，和GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對(duì)分析，利用MEGAX64軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示。將序列上傳至GenBank，獲得菌株J36的登錄號(hào)為SUB5943209。在BLAST中通過同源性比較得出，菌株J36與Rhodotorμlamucilaginosa的相似性為100%，從發(fā)育樹中可以看出，菌株J36與Rhodotorμlamucilaginosa的進(jìn)化關(guān)系最近，故此可以判定菌株J36屬于紅酵母屬中的膠紅酵母(Rhodotorμlamucilaginosa)。

圖2 菌株J36系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 菌株J36的基本特性分析

2.2.1 溫度適應(yīng)范圍

溫度是影響微生物生長(zhǎng)繁殖的重要因素，每種微生物都有其最適生長(zhǎng)溫度，溫度不同微生物細(xì)胞內(nèi)的生物活性物質(zhì)也會(huì)發(fā)生變化，如溫度升高，蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)發(fā)生變性，細(xì)胞逐漸死亡，溫度降低，微生物的生長(zhǎng)受到抑制[16]；如圖3所示，在15～30 ℃，隨著溫度升高，菌株J36的菌落總數(shù)也隨之增加，在27 ℃和30 ℃時(shí)，菌落總數(shù)相差不大，說明菌株J36的最適生長(zhǎng)溫度為27～30 ℃，在24 ℃時(shí)，培養(yǎng)96 h，其菌落總數(shù)能達(dá)到1×108CFU/mL；而在果酒發(fā)酵中，溫度過高，容易導(dǎo)致醋酸菌污染，在低溫下(20～25 ℃)果酒的香氣成分保留程度較高[17]，故而選擇24 ℃作為果酒發(fā)酵溫度。

圖3 菌株J36在不同溫度下的生長(zhǎng)曲線

2.2.2 pH值適用范圍

在果酒發(fā)酵中，pH值的大小直接影響酵母菌還原糖過程中所起催化作用的酶的活性，pH值太低或者太高都會(huì)使酶的活性下降，甚至變性而完全失活[18]。菌株J36在不同pH值中的生長(zhǎng)情況如圖4所示，隨著pH值逐漸減小，菌株J36的生長(zhǎng)明顯受到抑制，在pH 2～4時(shí)，生長(zhǎng)緩慢；96 h時(shí)，菌落總數(shù)達(dá)到最大，之后逐漸減少，并且在pH 2時(shí)，只能存活2～3 d。

圖4 菌株J36在不同pH值中的生長(zhǎng)曲線

2.2.3 SO2耐受性

SO2在果酒當(dāng)中起著至關(guān)重要的作用，比如作為防腐劑能夠抑制果酒在發(fā)酵過程中雜菌的生長(zhǎng)，作為抗氧化劑能夠抑制氧化酶的生成從而防止原料氧化，還有增酸、澄清和溶解等作用[19]；但是不同酵母菌對(duì)不同SO2濃度的耐受能力也不一樣，菌株J36在不同SO2濃度下的生長(zhǎng)情況如圖5所示，隨著SO2濃度的增加，菌株J36的菌落總數(shù)明顯減少，但在300 mg/L SO2質(zhì)量濃度下能夠正常生長(zhǎng)，說明菌株J36能夠耐受300 mg/L SO2。

2.2.4 酒精耐受性

菌株J36在不同酒精體積分?jǐn)?shù)中的生長(zhǎng)情況如圖6所示，菌落總數(shù)隨著時(shí)間延長(zhǎng)數(shù)量在不斷減少，說明酒精會(huì)對(duì)酵母細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，酒精濃度越高越明顯[20]，在16%酒精體積分?jǐn)?shù)下，從接種到發(fā)酵72 h，酵母數(shù)量急劇減少，96 h后酵母全部死亡；但是在12%酒精體積分?jǐn)?shù)時(shí)，卻表現(xiàn)出不同的特征，菌落總數(shù)總是大于8%和10%的酒精體積分?jǐn)?shù)，這可能和菌株J36的來源有關(guān)；在14%酒精體積分?jǐn)?shù)下，J36能夠存活1周左右。

圖6 菌株J36在不同酒精體積分?jǐn)?shù)中的生長(zhǎng)曲線

2.3 菌株J36和釀酒酵母混合發(fā)酵對(duì)獼猴桃酒風(fēng)味物質(zhì)的影響

2.3.1 基本理化指標(biāo)分析

獼猴桃酒的基本理化指標(biāo)分析如表2所示，和單菌種發(fā)酵相比，混合發(fā)酵對(duì)獼猴桃酒的酒精度、總糖和總酸影響不大，但對(duì)抗壞血酸的保留和總SO2有一定的影響。

表2 獼猴桃酒的基本理化指標(biāo)分析

2.3.2 菌株J36和釀酒酵母混合發(fā)酵對(duì)獼猴桃酒風(fēng)味物質(zhì)的影響

由表3可知，將菌株J36和釀酒酵母混合發(fā)酵，并以獼猴桃原料中的揮發(fā)性成分和釀酒酵母單菌種發(fā)酵中的揮發(fā)性成分作對(duì)比，利用頂空固相微萃取技術(shù)和氣相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS)在獼猴桃原料和獼猴桃酒樣中共檢測(cè)出58種香氣物質(zhì)，香氣種類主要包括27種酯類，15種萜烯類，6種芳香族化合物和3種酸類等。在獼猴桃原料中主要有酯類9種，萜烯類3種；單菌種發(fā)酵中主要有酯類11種，萜烯類7種；混合發(fā)酵中主要有酯類22種，萜烯類10種。三者共有的物質(zhì)為正己酸乙酯、苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯、月桂酸乙酯、癸酸乙酯、大馬士酮、2,4-二叔丁基苯酚和油酸，這些物質(zhì)可能對(duì)獼猴桃香氣的典型性具有重要的作用。在獼猴桃原料中相對(duì)含量較高的主要是苯甲酸甲酯12.64%和苯甲酸乙酯2.56%；在單菌種發(fā)酵中相對(duì)含量較高的是苯甲酸甲酯18.37%，苯乙醇5.83%，辛酸乙酯3.16%，苯甲酸乙酯2.44%，正己酸乙酯1.17%，苯乙酸乙酯1.02%；在混合發(fā)酵中相對(duì)含量較高的是苯甲酸甲酯16.37%；9-癸酸乙酯7.73%，苯乙醇7.92%，癸酸乙酯5.52%，辛酸乙酯4.63%。由此可見，獼猴桃酒中的主要香氣成分為苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、苯乙醇、辛酸乙酯、正己酸乙酯和癸酸乙酯，這與郭靜等和劉拉平等[21-22]的研究結(jié)果基本一致。其中，苯甲酸甲酯具有濃郁的冬青油和尤南迦油香氣，苯乙醇主要貢獻(xiàn)玫瑰香、紫羅蘭香和茉莉花香，辛酸乙酯主要貢獻(xiàn)果香、菠蘿、梨和花香，苯甲酸乙酯主要貢獻(xiàn)果香，正己酸乙酯主要貢獻(xiàn)花香和果香，苯乙酸乙酯主要貢獻(xiàn)玫瑰和花香，9-癸酸乙酯和癸酸乙酯主要貢獻(xiàn)蠟味和果香。萜類物質(zhì)雖然相對(duì)含量較低，但是他們香味獨(dú)特，對(duì)獼猴桃風(fēng)味有積極的貢獻(xiàn)，如右旋萜二烯具有甜橙和柑橘類香氣，4-萜烯醇具有胡椒香、泥土香和木材類香氣，α-法尼烯具有青香、花香并伴有香脂香氣和大馬士酮具有復(fù)雜的花香、熱帶水果和煮蘋果香氣等。

表3 菌株J36和釀酒酵母混合發(fā)酵對(duì)獼猴桃酒風(fēng)味物質(zhì)的影響

3 感官評(píng)定

將14名品評(píng)員的品評(píng)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，對(duì)獼猴桃酒的色澤、香氣、口感和典型性4個(gè)方面進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，如圖7所示，在香氣和口感方面，釀酒酵母與菌株J36混合發(fā)酵的獼猴桃酒得分最高，具有獼猴桃酒的果香，酒體飽滿，口味協(xié)調(diào)；釀酒酵母單菌種發(fā)酵的獼猴桃酒果香果香較淡，酒體清淡；在色澤和典型性方面都沒有較大差別。綜合香氣物質(zhì)分析和感官品評(píng)結(jié)果，混合發(fā)酵不僅使獼猴桃酒的香氣更加豐富，對(duì)獼猴桃酒的品質(zhì)也有較大提升。

圖7 獼猴桃酒的感官分析雷達(dá)圖

4 結(jié)論

本研究將獼猴桃發(fā)酵罐中篩選的菌株J36進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和分析生物學(xué)鑒定，確定該株菌為膠紅酵母，然后對(duì)它的溫度、pH值、SO2和酒精度進(jìn)行耐受實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明菌株J36在24～30 ℃和pH 5～6均能較好生長(zhǎng)，能夠耐受質(zhì)量濃度為300 mg/L的SO2和體積分?jǐn)?shù)為14%的酒精。利用頂空固相微萃取(HS-SPME)和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MC)測(cè)定了獼猴桃原料和獼猴桃酒中的揮發(fā)性成分，共檢測(cè)出58種香氣物質(zhì)，香氣種類主要包括27種酯類，15種萜烯類，6種芳香族化合物和3種酸類等。同時(shí)，和釀酒酵母單菌種發(fā)酵相對(duì)比，混合發(fā)酵中的菌株J36產(chǎn)生的類胡蘿卜素能夠分解成多種萜烯類物質(zhì)，對(duì)獼猴桃酒的風(fēng)味有極大貢獻(xiàn)。感官分析得出，釀酒酵母與菌株J36混合發(fā)酵的獼猴桃酒香氣豐富，口味協(xié)調(diào)，感官評(píng)價(jià)最好；綜合香氣物質(zhì)分析和感官品評(píng)結(jié)果，混合發(fā)酵不僅使獼猴桃酒的香氣更加豐富，對(duì)獼猴桃酒的品質(zhì)也有較大提升。