翟衛(wèi)帥，樊 潤，王曉明，李基云，劉 曉，劉德俊，劉志海,，汪 洋，張啟迪

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109 ； 2. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193)

碳青霉烯類藥物是臨床上治療多重耐藥革蘭陰性菌感染的特效藥物之一[1]。但2009年在印度發(fā)現(xiàn)攜帶新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶(NDM-1)的細(xì)菌(“超級細(xì)菌”，Superbug)[2-3]，幾乎能對所有β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥(包括被認(rèn)為是“最后一道防線”的碳青霉烯類)，曾一度引起人們的恐慌[4]。迄今為止，世界上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了OXA、KPC、VIM、IMP、NDM等數(shù)十種碳青霉烯酶，其中NDM是流行范圍最廣和藥物水解活性最好的金屬β-內(nèi)酰胺酶[5]。令人擔(dān)憂的是，NDM已發(fā)現(xiàn)了21種變異體，且有向更強(qiáng)耐藥性進(jìn)化的趨勢[6-7]。

近15年以來，銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和腸桿菌等各類碳青霉烯類耐藥菌(Carbapenem-resistant bacteria，CRB)已在全球廣泛傳播，并表現(xiàn)出嚴(yán)重的多重耐藥性，臨床治療時(shí)可選擇的有效抗菌藥物少，且治療難度巨大，被視為是進(jìn)入“后抗菌藥物時(shí)代(無抗菌藥物可用的時(shí)代)”的重要標(biāo)志[8-9]。特別是碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌(Carbapenem-resistant enterobacteriaceae，CRE)不再局限于院內(nèi)傳播，還在各種環(huán)境中傳播，危害嚴(yán)重[10-11]。盡管國內(nèi)外均未批準(zhǔn)碳青霉烯類藥物在動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)上使用，但這并沒有阻止畜禽源CRE的出現(xiàn)與蔓延[11]?，F(xiàn)有證據(jù)表明，攜帶多重耐藥細(xì)菌的昆蟲和候鳥是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥基因跨地區(qū)快速傳播的重要原因之一[5]，尤其是蒼蠅[1]。蒼蠅是一種雜食性昆蟲，能夠在不同環(huán)境中傳播病毒、細(xì)菌等各種病原，是人類疾病傳播的重要媒介之一[12-13]，也是肉雞養(yǎng)殖場內(nèi)產(chǎn)NDM碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌(NDM-carbapenem-resistant enterobacteriaceae，NDM-CRE)傳播的重要媒介之一[1, 14]。但是現(xiàn)有報(bào)道僅有養(yǎng)殖場中蒼蠅傳播一些多重耐藥菌的零星報(bào)道[1, 12-13]，并沒有養(yǎng)殖場外蒼蠅中NDM-CRE的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究擬通過對2016年9月-2017年9月期間山東青島某肉雞養(yǎng)殖場周邊蒼蠅中NDM-CRE流行情況的調(diào)查，明確蒼蠅NDM-CRE在養(yǎng)殖場外傳播的作用，為進(jìn)一步闡明蒼蠅將NDM-CRE傳播至肉雞養(yǎng)殖場分子機(jī)制奠定材料基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持，同時(shí)也為細(xì)菌耐藥性的傳播與控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 2016年9月-2017年9月期間，在山東青島某規(guī)?；怆u養(yǎng)殖場周邊約15～25 m遠(yuǎn)設(shè)置8～10個(gè)采樣點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)間隔10～15 m遠(yuǎn)，并利用粘蠅板收集蒼蠅樣本。當(dāng)粘蠅板上蒼蠅數(shù)量大于10只時(shí)，用消毒鑷子夾取蒼蠅樣本置于E-swab管中，每個(gè)點(diǎn)采3個(gè)樣品。

1.2 主要試劑 KPC顯色培養(yǎng)基及增補(bǔ)劑，均購自鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司；腦心浸液培養(yǎng)液、腦心浸液瓊脂、M-H瓊脂、M-H肉湯，均購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；E-swab管，購自上海富雪生物技術(shù)有限公司；2×TaqMaster Mix (Dye Plus),購自南京諾唯贊生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 抗菌藥物 氨芐西林(AMP)、阿莫西林/克拉維酸鉀(2∶1)(AMC)、頭孢唑啉(CZO)、頭孢西丁(FOX)、頭孢噻呋(CEF)、美羅培南(MEM)、氨曲南(ATM)、恩諾沙星(NOR)、慶大霉素(GEN)、四環(huán)素(TET)、土霉素(OTC)、替加環(huán)素(TGC)、氟苯尼考(FFC)、氯霉素(CHL)、多黏菌素E(COL)、復(fù)方新諾明(SXT)，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.4 細(xì)菌分離及保存 增菌：從E-swab管中吸取10 μL樣本液于1 mL無藥的BHI肉湯中，37 ℃過夜靜置培養(yǎng)；分離：用無菌接種環(huán)蘸取培養(yǎng)后菌液于含0.04 μg/mL增補(bǔ)劑的KPC顯色培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，37 ℃靜止培養(yǎng)14～16 h；初純化：根據(jù)KPC顯色培養(yǎng)基說明書挑取不同顏色的單克隆于含1 μg/mL美羅培南的腦心浸液瓊脂劃線，37 ℃過夜培養(yǎng)；純化及保存：挑取單克隆于含1 μg/mL美羅培南的1 mL BHI肉湯中，37 ℃過夜靜置培養(yǎng)，加500 μL 60%的甘油，保存于-80 ℃冰箱中。

1.5 細(xì)菌種屬鑒定與耐藥基因檢測 細(xì)菌基因組提取按照天根生化科技(北京)有限公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。細(xì)菌種屬鑒定通過16S rRNA測序并與NCBI數(shù)據(jù)庫相應(yīng)序列比對確認(rèn)，通過PCR方法檢測所有NDM-CRE分離株攜帶的關(guān)鍵耐藥基因(引物序列信息見表1)并測序確認(rèn)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，測序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。

1.6 藥敏試驗(yàn)及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 參考CLSI(Clinical and laboratory standards institute，美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會)[15]和EUCAST(European committee on antimicrobial susceptibility testing，歐洲藥敏試驗(yàn)聯(lián)合委員會)[16]推薦的微量肉湯稀釋法與判定標(biāo)準(zhǔn)，測定NDM-CRE分離株對氨芐西林等16種抗菌藥物的敏感性，以ATCC25922為質(zhì)控菌株。

表1 本研究中用到的PCR引物序列信息Table 1 PCR primers for this research

2 結(jié)果

2.1 NDM-CRE分離鑒定 2016年9月-2017年9月對青島某肉雞養(yǎng)殖場周邊進(jìn)行了4次蒼蠅采集，共收集了120份樣本。利用KPC顯色培養(yǎng)基篩選鑒定出31株CRB(分離率為25.8%)，經(jīng)16S rRNA種屬鑒定出16株為CRE(分離率為13.3%)、15株為非腸桿菌科細(xì)菌(分離率為12.5%)(表2)。對16株CRE進(jìn)行blaNDM基因檢測發(fā)現(xiàn),所有分離株均為NDM陽性，分別是大腸桿菌10株(分離率為8.3%)，弗氏檸檬酸桿菌5株(分離率為4.2%)，肺炎克雷伯菌1株(分離率為0.8%)。

表2 120份蒼蠅樣本中CRB的分離鑒定結(jié)果Table 2 Isolation and identification of CRB in 120 fly samples

2.2 NDM分型 對16株NDM-CRE分離株進(jìn)行NDM亞型鑒定，發(fā)現(xiàn)僅有NDM-5與NDM-9兩種亞型(表3)，62.5%(10株)的分離株為NDM-5，37.5%(6株)的分離株為NDM-9。10株NDM-5菌株分別是弗氏檸檬酸桿菌5株、大腸桿菌4株和肺炎克雷伯菌1株；6株NDM-9分離株均為大腸桿菌。

2.3 抗菌藥物敏感性測試 對16株CRE分離株進(jìn)行16種抗菌藥物敏感性測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有分離株除了對替加環(huán)素敏感外，對氨芐西林、阿莫西林-克拉維酸鉀(2∶1)、美羅培南、頭孢唑啉、頭孢西丁、頭孢噻呋、四環(huán)素、土霉素和復(fù)方新諾明均耐藥；對氟苯尼考、氯霉素、慶大霉素、恩諾沙星和氨曲南的耐藥率高，分別為93.8%(15/16)、93.8%(15/16)、87.5%(14/16)、87.5%(14/16)和46.7%(7/16)(表3)； 18.8%(3/16)的分離株對多黏菌素E耐藥。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，所有分離株至少耐11種抗菌藥物(圖1)。其中，以耐14種抗菌藥物的菌株數(shù)量最多(6株，占37.5%)，其次是耐13種抗菌藥物的菌株(5株，占31.3%)。

2.4 其他類型耐藥基因 對16株CRE分離株進(jìn)行12種關(guān)鍵耐藥基因的檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有分離株均能夠檢測出5種或5種以上的耐藥基因(表3)。耐藥基因檢測結(jié)果顯示，所有分離株均攜帶β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM-1基因，分別有31.3%(5/16)和12.5%(2/16)的分離株攜帶blaCTX-M-15和blaCTX-M-132基因；氨基糖苷類耐藥基因rmtB與四環(huán)素類耐藥基因tet(A)的檢出率均為56.3%(9/16)，同時(shí)有25%(4/16)的分離株還同時(shí)攜帶有四環(huán)素類耐藥基因tet(A)和tet(B)；酰胺醇類耐藥基因floR和磺胺類耐藥基因sul1的檢測率也為100%(16/16)，同時(shí)還有93.8%(15/16)的磺胺類耐藥菌株同時(shí)攜帶sul1和sul2基因，有43.8%(7/16)的菌株同時(shí)攜帶sul1、sul2和sul3基因；多黏菌素耐藥基因mcr-1的檢測率為18.8%(3/16)。

圖1 16株NDM-CRE分離株多藥耐藥性情況Fig.1 Multidrug resistance of 16 NDM-CRE isolates

3 討論

目前，國內(nèi)外關(guān)于蒼蠅源NDM-CRE的報(bào)道較少。有限的報(bào)道顯示，我國肉雞養(yǎng)殖場內(nèi)蒼蠅的流行率為25.8%(31/120)[1, 14]，比本研究中肉雞養(yǎng)殖場外的分離率13.3%(16/120)略高，且介于養(yǎng)殖場肉雞中NDM-CRE的分離率(3.1%～33.2%)[1, 23]；這可能與肉雞養(yǎng)殖場中還有其他的傳播媒介(如狗、家燕等[1, 5, 14])有關(guān)，亦可能是養(yǎng)殖場中攜帶NDM-CRE的蒼蠅向養(yǎng)殖場周邊擴(kuò)散的緣故，或者是養(yǎng)殖場外攜帶NDM-CRE的蒼蠅進(jìn)入場內(nèi)并在肉雞中定植后克隆傳播引起的。此外，現(xiàn)有研究表明，養(yǎng)殖場內(nèi)雞源CRE主要是大腸桿菌和肺炎克雷伯菌，蒼蠅中流行菌屬主要為大腸桿菌[1, 5, 14]；本研究則發(fā)現(xiàn)蒼蠅中弗氏檸檬酸桿菌是僅次于大腸桿菌的流行菌株，說明弗氏檸檬酸桿菌可能是蒼蠅中NDM-CRE的主要流行菌株之一，這可能與蒼蠅的采食習(xí)性有關(guān)。值得注意的是，本研究中蒼蠅攜帶的blaNDM-5與blaNDM-9兩種耐藥基因與我國肉雞養(yǎng)殖場內(nèi)雞與蒼蠅中攜帶的NDM-CRE的主要流行型一致[1, 5, 14]，這說明了肉雞養(yǎng)殖場周邊蒼蠅是NDM-CRE的重要儲庫和傳播媒介，它的存在可能進(jìn)一步促進(jìn)了NDM-CRE的跨區(qū)域傳播，加劇了細(xì)菌耐藥性擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)于雞源CRE也僅有零星報(bào)道，有研究表明，我國7省15個(gè)肉雞養(yǎng)殖場中產(chǎn)NDM-5型CRE菌株對碳青霉烯類、頭孢類、青霉素類、氟喹諾酮類、磺胺類抗菌藥物完全耐藥(18/18)，對酰胺醇類(88.9%，16/18)、氨基糖苷類(44.4%，8/18)和多黏菌素(33.3%，6/18)抗菌藥物的耐藥率也比較高[23]；劉志海的研究也發(fā)現(xiàn)，NDM型CRE菌株(100%，45/45)對碳青霉烯類、頭孢類、青霉素類和氟喹諾酮類抗菌藥物完全耐藥，對氨基糖苷類和多黏菌素的耐藥率分別達(dá)到了82.2%(37/45)、66.7%(30/45)[5]。這些報(bào)道均顯示，我國雞源NDM陽性CRE分離株具有相當(dāng)嚴(yán)重的多重耐藥性，這與本研究中肉雞養(yǎng)殖場外蒼蠅中攜帶的分離株耐藥性極其相似，究其原因則是這些分離株攜帶了多重耐藥基因或是同時(shí)攜帶多種耐藥基因的緣故。值得注意的是，多黏菌素是臨床上治療CRE等多重耐藥革蘭陰性菌的保留用藥，但近年來由于可轉(zhuǎn)移黏菌素耐藥因子MCR的出現(xiàn)和蔓延[22]，導(dǎo)致腸桿菌對其耐藥率不斷上升，進(jìn)一步加劇了治療CRE等多重耐藥菌株感染時(shí)的抗菌藥物選擇危機(jī)。本研究發(fā)現(xiàn)了3株多黏菌素耐藥的CRE菌株，這需要引起高度重視。

由于細(xì)菌耐藥機(jī)制比較復(fù)雜，同一耐藥表型可能有多種耐藥機(jī)制引起[5]，因此在本研究中僅對CRE菌株常見的12種關(guān)鍵耐藥基因(除blaNDM外)進(jìn)行了檢測。耐藥基因檢測結(jié)果表明，所有分離株至少攜帶有5種耐藥基因，有的甚至多達(dá)9種耐藥基因，甚至有些有耐藥表型的菌株未能夠檢測到相應(yīng)耐藥基因，表現(xiàn)出了較為復(fù)雜的耐藥機(jī)制。尤其需要引起重視的是蒼蠅中有3株同時(shí)攜帶了耐藥基因blaNDM和mcr-1的CRE分離株，一旦這些菌株通過蒼蠅傳遞給食品或是人類，將會對食品安全與人類健康造成較大風(fēng)險(xiǎn)。因此，養(yǎng)殖業(yè)中需要對養(yǎng)殖場內(nèi)外環(huán)境中的蒼蠅等傳播媒介予以消滅，以達(dá)到對耐藥基因這一新型環(huán)境污染物的控制，降低養(yǎng)殖業(yè)對環(huán)境的污染和公共衛(wèi)生安全的風(fēng)險(xiǎn)。