馬榮花 簡(jiǎn)生燕 祁淑英 王莉云 熊正方 沈源春

既往諸多文獻(xiàn)報(bào)道，30～35歲以后隨著年齡的增加?jì)D女的生育力逐漸下降，在使用輔助生殖技術(shù)助孕治療中，年齡更是影響臨床妊娠率的重要因素之一[1]。關(guān)于高齡患者年齡的界值，國(guó)內(nèi)大多數(shù)研究是以38歲為界[2]，國(guó)外有的文獻(xiàn)認(rèn)為女性37歲是臨界年齡。不同地區(qū)，因環(huán)境因素、飲食差異或人們生活水平等因素的不同，高齡界限也因地而異。本文以青海省人民醫(yī)院就診的不孕癥患者為研究對(duì)象，界定了凍融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer，F(xiàn)ET)妊娠結(jié)局下降的年齡界限，并分析了年齡對(duì)FET患者妊娠結(jié)局的影響。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

1.選擇2014年2月—2017年12月就診于青海省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行FET的不孕癥患者810例，共825個(gè)周期，記錄患者年齡及妊娠結(jié)局(臨床妊娠為陽(yáng)性)?；颊吣挲g范圍21～45歲，平均(33.5±5.0)歲，妊娠404例，妊娠率37.8%。以年齡為橫坐標(biāo)，不同年齡階層移植人數(shù)(左)和妊娠率為縱坐標(biāo)(右)，繪制年齡-妊娠率曲線圖，描述本中心行FET患者的年齡與妊娠率的關(guān)系，并通過(guò)繪制ROC曲線確定影響妊娠率的年齡節(jié)點(diǎn)。

2.選擇其中2017年1月—12月的就診于青海省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行FET的不孕癥患者282例，共282個(gè)周期。根據(jù)年齡分為<36.5歲組和≥36.5歲組。<36.5歲組患者210例，年齡范圍21～36歲，平均(30.0±2.2)歲，≥36.5歲組72例，年齡范圍36～45歲，平均(37.0±3.4)歲，比較兩組患者的妊娠率、早期流產(chǎn)率及活產(chǎn)率，并進(jìn)一步采用多元回歸分析尋找兩組患者FET妊娠結(jié)局的影響因素。

3.納入標(biāo)準(zhǔn)：2014年2月—2017年12月,在本中心行體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET )助孕，并保存有卵裂期凍胚的所有患者。

4.排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在子宮解剖異常、宮腔息肉、子宮內(nèi)膜結(jié)核、子宮內(nèi)膜炎、輸卵管積水等可導(dǎo)致移植失敗的患者；(2)排除患有乳腺疾病、激素依賴性腫瘤、不明原因的陰道出血、血栓栓塞疾病等禁用雌激素的患者；(3)排除子宮內(nèi)膜異位癥的患者。

5.卵泡輸出率(Follicular output rate，F(xiàn)ORT)定義：為B超監(jiān)測(cè)下人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)日16～22 mm卵泡數(shù)與自然月經(jīng)周期第3天3～8 mm竇卵泡數(shù)比值[3]。

二、方法

1.子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案：(1)自然周期。對(duì)月經(jīng)規(guī)律、既往有排卵、子宮內(nèi)膜無(wú)損傷的患者應(yīng)用自然周期方案，于月經(jīng)第8～9天開始陰道彩超監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育和內(nèi)膜生長(zhǎng)情況，當(dāng)卵泡直徑>16 mm時(shí)每天測(cè)尿黃體生成激素(luteinizing hormone，LH)值，當(dāng)尿LH陽(yáng)性時(shí)注射HCG 5000 u誘導(dǎo)排卵，排卵后第1天內(nèi)膜向分泌期轉(zhuǎn)化，給予地屈孕酮片(達(dá)芙通，10毫克/片，荷蘭蘇威制藥公司生產(chǎn))，每日兩次，每次10 mg，聯(lián)合微?；S體酮軟膠囊(安琪坦，法杏大藥廠，法國(guó)，100毫克/粒)，每次200 mg，每日兩次，排卵后第3天上午進(jìn)行FET。當(dāng)天上午空腹抽取肘靜脈血測(cè)定雌二醇(estradiol,E2)和孕酮值(progesterone,P)。(2)激素替代周期。對(duì)月經(jīng)不規(guī)律、既往無(wú)排卵、子宮內(nèi)膜偏薄(<7 mm)的患者應(yīng)用激素替代方案(除外說(shuō)明書中使用激素有禁忌癥的患者)，于月經(jīng)第3天給予口服雌二醇片(2/10 mg,荷蘭蘇威(上海雅培)制藥有限公司)，2 mg/d，根據(jù)陰道超聲下內(nèi)膜厚度調(diào)整激素用量，每3天逐漸加量，最大可增加至4～6 mg/d，若內(nèi)膜仍<7 mm則聯(lián)合給予雌二醇片 [1/10 mg，荷蘭蘇威(上海雅培)制藥有限公司] 0.5/mg，每晚睡前陰道放置，最大可增加至2 mg/d，月經(jīng)第14～16天陰超監(jiān)測(cè)內(nèi)膜厚度及形態(tài)，若內(nèi)膜厚度≥8 mm，誘導(dǎo)內(nèi)膜向分泌期轉(zhuǎn)化，給予雌二醇地屈孕酮片口服 [2/10 mg，荷蘭蘇威(上海雅培)制藥有限公司]，總劑量與內(nèi)膜轉(zhuǎn)化前服用雌二醇片相同，聯(lián)合微?；S體酮軟膠囊陰道給藥，每次200 mg，每日兩次。若月經(jīng)第21天內(nèi)膜仍未達(dá)標(biāo)，則放棄本周期。內(nèi)膜轉(zhuǎn)化第5天上午行FET，當(dāng)天上午空腹抽取肘靜脈血測(cè)定E2和P值。解凍和移植均由副主任醫(yī)師以上職稱大夫操作(移植管型號(hào)：T-1821011-S，太平洋康泰科學(xué)儀器有限公司)。

2.胚胎質(zhì)量評(píng)級(jí)：本實(shí)驗(yàn)納入的胚胎均為D3卵裂期胚胎，胚胎質(zhì)量評(píng)級(jí)參考 Brourn Hall Clinic胚胎評(píng)分系統(tǒng)[4]。Ⅰ級(jí)：卵裂球大小均勻，形態(tài)規(guī)則，具有完整的透明帶，胞質(zhì)均勻清晰，胞質(zhì)沒有顆?，F(xiàn)象，碎片0～5%之間；Ⅱ級(jí)：卵裂球大小略不均勻，形態(tài)欠規(guī)則，胞質(zhì)可有顆粒現(xiàn)象，碎片占6%～20%；Ⅲ級(jí)：卵裂球大小明顯不均勻，形態(tài)明顯不規(guī)則，胞質(zhì)可有顆?，F(xiàn)象，碎片21%～50%；Ⅳ級(jí)：卵裂球大小嚴(yán)重不均勻，胞質(zhì)可有嚴(yán)重顆?，F(xiàn)象，碎片大于50%。將D3天卵裂球數(shù)目≥6個(gè)的Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)胚胎定義為優(yōu)質(zhì)胚胎。復(fù)蘇方法按本中心胚胎培養(yǎng)室玻璃化冷凍復(fù)蘇的操作常規(guī)進(jìn)行。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)，年齡與妊娠率的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析,并繪制ROC曲線，計(jì)算曲線下面積(AUC)。部分研究對(duì)象以妊娠結(jié)局為因變量，以年齡、FORT、優(yōu)質(zhì)胚胎率、子宮內(nèi)膜厚度、移植日雌激素及孕激素水平為自變量進(jìn)行一般性多元線性回歸分析，模型的參數(shù)估計(jì)采用最小二乘法，衡量每一個(gè)自變量對(duì)因變量的作用大小，采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、FET妊娠率隨年齡增長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)：隨著年齡增長(zhǎng)，F(xiàn)ET妊娠率逐漸降低，且36歲后下降明顯(見圖1)，年齡與妊娠率的相關(guān)系數(shù)為-0.204，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由ROC曲線可知，F(xiàn)ET患者年齡與妊娠率的Cut-off值為36.5歲，若≥36.5歲，則妊娠率呈下降趨勢(shì)(AUC為0.825，靈敏度73.7%，特異度6.4%)(見圖2)。

圖1 年齡-妊娠率趨勢(shì)圖Figure 1 Age-pregnancy rate trend chart

圖2 年齡與妊娠率的關(guān)系Figure 2 The relationship between age and pregnancy rate

二、不同內(nèi)膜準(zhǔn)備方案對(duì)兩組患者妊娠率的影響：對(duì)于不同年齡組的患者，自然周期及人工周期2種子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案的妊娠率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 比較不同內(nèi)膜準(zhǔn)備方案對(duì)兩組患者妊娠率的影響Table 1 Comparison of pregnancy outcomes of different endometrial preparation schemes(%)

三、年齡對(duì)FET妊娠結(jié)局的影響：<36.5歲組臨床妊娠率為51%，≥36.5歲組(33.3%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組早期流產(chǎn)率和活產(chǎn)率，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 比較不同年齡組患者FET妊娠結(jié)局Table 2 Comparison of FET pregnancy outcomes between different age groups (%)

四、影響患者不同年齡組FET妊娠結(jié)局的因素分析：進(jìn)一步分析2組患者妊娠結(jié)局的影響因素，一般多元線性回歸分析發(fā)現(xiàn)<36.5歲組患者的年齡、FORT、優(yōu)質(zhì)胚胎率、移植日子宮內(nèi)膜厚度是影響其成功率的主要因素，且移植日子宮內(nèi)膜厚度是最重要的影響因素，其余依次排序?yàn)閮?yōu)質(zhì)胚胎率、年齡及FORT。移植日雌二醇及孕酮對(duì)妊娠結(jié)局無(wú)影響。而≥36.5歲組患者的年齡、FORT、優(yōu)質(zhì)胚胎率、子宮內(nèi)膜厚度、移植日雌激素及孕激素水平是影響其成功率的主要因素，年齡為最重要因素，其余依次排序?yàn)閮?yōu)質(zhì)胚胎率、移植日子宮內(nèi)膜厚度、移植日雌激素水平及孕酮水平、FORT。見表3。

表3 兩組患者FET妊娠結(jié)局的影響因素Table 3 Influencing factors of FET pregnancy outcomesbetween the two groups

討 論

由于FET可以通過(guò)減少卵巢過(guò)度刺激綜合征的發(fā)生來(lái)提高累積妊娠率[5]，并且還能最大限度地減少移植胚胎的個(gè)數(shù)而成為輔助生殖技術(shù)的重要方法。眾多研究表明，年齡、優(yōu)質(zhì)胚胎率、移植日子宮內(nèi)膜厚度、卵泡輸出率、移植日雌激素和孕激素水平可影響FET妊娠結(jié)局。

年齡對(duì)FET妊娠結(jié)局有較大影響。WANG等[6]研究表明冷凍胚胎的妊娠率隨著年齡的增高而下降，特別是>40歲的患者。本研究通過(guò)年齡-妊娠趨勢(shì)圖發(fā)現(xiàn)，在21～45歲間行FET的患者中，21～30歲妊娠率上升，可達(dá)60%～80%。30～36歲雖有波動(dòng)，但也有較高的妊娠率，達(dá)50%～65%。而36歲以后的患者，妊娠率下降。由ROC曲線分析得出，年齡對(duì)FET患者妊娠率有預(yù)測(cè)價(jià)值，由軟件計(jì)算得出，患者妊娠率下降年齡的臨界值為36.5歲，曲線下面積為0.825，其95%的近似參考置信區(qū)間為(0.720，0.929)，敏感性73.7%，特異性80.4%。因此，本研究將36.5歲作為FET妊娠率下降的高齡界值。進(jìn)一步行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，隨著年齡增長(zhǎng)，臨床妊娠率逐漸下降，早期流產(chǎn)率逐漸增高，活產(chǎn)率逐漸下降(見表1)。年齡<36.5歲組臨床妊娠率達(dá)51%，年齡≥36.5組臨床妊娠率僅為33.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與王偉周[7]、馬曉娟[8]等研究結(jié)果大致相似，但年齡節(jié)點(diǎn)略有差異。王偉周等發(fā)現(xiàn)40～42歲婦女妊娠率降低。馬曉娟等研究發(fā)現(xiàn)年齡<35歲組臨床妊娠率高于年齡>35歲組。分析可能原因：(1)不同氣候的不同地理位置的地區(qū)，因新鮮促排周期受精率、卵裂率和胚胎質(zhì)量等不同，導(dǎo)致FET妊娠率不同。(2)本研究樣本量小，僅以2017年度的數(shù)據(jù)不足以代表整體，需收集更大的數(shù)據(jù)進(jìn)行研究證實(shí)。本研究回歸分析發(fā)現(xiàn)，<36.5歲組患者年齡與FET妊娠結(jié)局呈負(fù)相關(guān)，回歸系數(shù)為0.119?！?6.5組患者年齡與FET妊娠結(jié)局也呈負(fù)相關(guān)，回歸系數(shù)為0.868。相對(duì)而言，年齡對(duì)于≥36.5歲組患者妊娠率的影響程度高于<36.5歲組，說(shuō)明年齡對(duì)于高齡和非高齡婦女均有影響，而且對(duì)高齡婦女妊娠率的影響程度更大。年齡是無(wú)法改變的影響女性生殖能力的重要因素。Gianaroli[9]發(fā)現(xiàn)高齡是非整倍體發(fā)生的確定因素，非整倍體的異常會(huì)造成胚胎著床失敗，并致胚停、流產(chǎn)等。本研究發(fā)現(xiàn)，兩組早期流產(chǎn)率和活產(chǎn)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，考慮與兩組樣本量小，且樣本量懸殊有關(guān)系。

卵泡輸出率已廣泛應(yīng)用于IVF-ET中卵巢對(duì)外源性Gn的反應(yīng)性及妊娠結(jié)局。張寧等[10]研究發(fā)現(xiàn)，IVF/ICSI周期中，優(yōu)質(zhì)胚胎率、胚胎種植率以及臨床妊娠率隨著FORT值的升高而逐漸升高，相關(guān)分析顯示FORT與可移植胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)呈正相關(guān)。從表2可知，F(xiàn)ORT與兩組患者妊娠率均呈正相關(guān)，<36.5歲組回歸系數(shù)為0.002，≥36.5歲組為0.015，兩者相關(guān)性相近，考慮FORT對(duì)FET患者妊娠結(jié)局的預(yù)測(cè)，仍受年齡影響，由于相關(guān)性均很低，說(shuō)明FORT對(duì)不同年齡段FET妊娠結(jié)局的預(yù)測(cè)性差，該指標(biāo)對(duì)ART妊娠結(jié)局的預(yù)測(cè)意義重在新鮮促排卵周期中。

胚胎質(zhì)量和子宮內(nèi)膜是影響FET妊娠結(jié)局的兩大重要因素。子宮內(nèi)膜容受性是指內(nèi)膜允許囊胚黏附、穿透并植入從而著床的狀態(tài)，是胚胎著床的必要條件[11]，是影響FET妊娠結(jié)局的重要因素。子宮內(nèi)膜厚度因其經(jīng)陰道超聲檢查簡(jiǎn)單無(wú)創(chuàng)的特點(diǎn)，已成為評(píng)價(jià)子宮內(nèi)膜容受性的間接指標(biāo)之一，為廣大學(xué)者認(rèn)可[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，兩組患者優(yōu)質(zhì)胚胎率與子宮內(nèi)膜厚度均與FET妊娠結(jié)果呈負(fù)相關(guān)，<36.5歲組回歸系數(shù)為0.245，≥36.5歲組為0.758，由此可知，對(duì)于36.5歲以上的患者，優(yōu)質(zhì)胚胎率和移植日子宮內(nèi)膜厚度對(duì)其成功率的影響更大，與周林燕[13]等研究結(jié)果一致。故對(duì)于高齡患者，可通過(guò)提高優(yōu)質(zhì)胚胎的植入率，提高移植日子宮內(nèi)膜的厚度，從而提高其妊娠結(jié)局。

研究發(fā)現(xiàn)在胚胎植入過(guò)程中適宜雌孕激素水平的協(xié)同作用可影響子宮內(nèi)膜容受性，與種植窗的開閉有關(guān)[14]，故是否移植日雌激素及孕激素越高，其妊娠率越高呢？項(xiàng)云改等[15]研究發(fā)現(xiàn)，自然周期和激素替代周期妊娠組和未妊娠組移植日雌激素水平均無(wú)明顯差異，妊娠組的血清P值水平均高于未妊娠組，另觀察人工周期FET妊娠率不隨E2水平的增高而增加。本研究發(fā)現(xiàn)，<36.5歲組患者移植日E2及P水平均與妊娠率無(wú)相關(guān)性，≥36.5歲組患者移植日E2及P值與妊娠率呈正相關(guān)，回歸系數(shù)分別為0.327、0.283，相關(guān)程度較高。由以上結(jié)果可推測(cè)，E2與P值對(duì)FET患者妊娠率的影響與年齡存在相關(guān)性，對(duì)于高齡女性，E2及P值增加，可增加子宮內(nèi)膜的厚度及其向分泌期的轉(zhuǎn)化，使子宮內(nèi)膜的種植窗與胚胎發(fā)育同步，有利于胚胎著床。因此，對(duì)于高齡女性，應(yīng)選擇激素替代周期，提高體內(nèi)雌激素及孕激素水平，增加胚胎著床率，提高FET妊娠率。

綜上所述，影響FET妊娠結(jié)局的因素諸多，且影響程度與年齡呈相關(guān)性。對(duì)于高齡婦女，年齡是影響其妊娠結(jié)局的最重要因素，故在行FET時(shí)應(yīng)根據(jù)患者年齡，選擇個(gè)體化治療方案，以獲得更好的結(jié)局。