李朝英，鄭 路，2*

（1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，廣西 憑祥 532600；2.廣西友誼關(guān)森林生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家定位觀測(cè)研究站，廣西 憑祥 532600 ）

磷是植物生長(zhǎng)所需的大量元素之一，土壤中磷對(duì)植物營(yíng)養(yǎng)有重要作用。準(zhǔn)確測(cè)定土壤磷含量對(duì)于了解土壤供磷容量，合理施肥，有著直接的指導(dǎo)意義［1-3］。土壤全磷消解方法主要有硫酸-高氯酸消解法和堿溶法等，傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法為鉬銻抗比色法。鉬銻抗比色法的試劑加入及酸度調(diào)整等均由人工操作，測(cè)定結(jié)果易受人為因素影響而存在檢測(cè)誤差。檢測(cè)操作繁瑣費(fèi)時(shí)，人員工作強(qiáng)度大，效率低，難以準(zhǔn)確高效地完成批量樣品的檢測(cè)任務(wù)［4-6］。近年來(lái)，有研究結(jié)合磷鉬藍(lán)比色法原理，利用流動(dòng)分析儀代替人工測(cè)定土壤全磷。流動(dòng)分析儀由蠕動(dòng)泵連續(xù)定量輸送試劑和待測(cè)樣，按一定順序注入管路中，并由均勻的氣泡隔開(kāi)成一個(gè)個(gè)獨(dú)立的小片斷。顯色混合液經(jīng)比色檢測(cè)，檢測(cè)器將信號(hào)傳入電腦，通過(guò)軟件自動(dòng)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，處理數(shù)據(jù)，出具報(bào)告。流動(dòng)分析儀因試劑和待測(cè)樣的加入量準(zhǔn)確，顯色時(shí)間、溫度等顯色反應(yīng)條件控制一致，避免了人工檢測(cè)的操作誤差，提高了檢測(cè)精度。張英利等［7］提出了流動(dòng)分析儀測(cè)定硫酸-高氯酸消解法土壤全磷的方法，吳玉萍等［8］提出了流動(dòng)分析儀測(cè)定硝酸-高氯酸-氫氟酸消解法土壤全磷和全鉀的方法，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%，回收率均在97%～103%，準(zhǔn)確性較高。同時(shí)，流動(dòng)分析儀的高度自動(dòng)化極大地提升了檢測(cè)效率，降低了人員工作強(qiáng)度，適用于大量樣品的檢測(cè)分析［9］。但是，由于流動(dòng)分析儀測(cè)定全磷的方法是結(jié)合土壤消解法特點(diǎn)和磷鉬藍(lán)比色法要求，以及流動(dòng)分析儀檢測(cè)技術(shù)而確定相應(yīng)的檢測(cè)條件，由此建立的測(cè)定方法具有一定的專(zhuān)一性。堿熔法與硫酸-高氯酸消解法的消解體系截然不同，消解液成分及酸度差異較大。流動(dòng)分析儀測(cè)定硫酸-高氯酸消解法土壤全磷的方法不適用于堿熔法土壤全磷的測(cè)定。目前，利用流動(dòng)分析儀測(cè)定堿熔法土壤全磷含量的報(bào)導(dǎo)甚少，流動(dòng)分析儀代替人工測(cè)定堿熔法土壤全磷的可行性不明確。

研究表明，硫酸-高氯酸消解法對(duì)酸性土壤消解不充分。堿熔法是土壤全磷消解的標(biāo)準(zhǔn)方法之一，對(duì)各類(lèi)土壤均能消解充分，可聯(lián)合檢測(cè)全磷和全鉀，且避免使用具有強(qiáng)氧化性及易爆特性的高氯酸，有利于安全、準(zhǔn)確、高效地檢測(cè)［9-11］，但堿熔法測(cè)定土壤全磷的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)少有關(guān)注。因此，利用流動(dòng)分析儀測(cè)定堿熔法土壤全磷含量的方法討論不僅是土壤全磷測(cè)定方法的完善與補(bǔ)充，而且對(duì)充分開(kāi)發(fā)流動(dòng)分析儀的檢測(cè)功能和利用堿熔法的優(yōu)勢(shì)，滿(mǎn)足多種檢測(cè)需求有著重要意義。鑒此，本實(shí)驗(yàn)利用流動(dòng)分析儀測(cè)定堿熔法土壤全磷含量，并與傳統(tǒng)的鉬銻抗比色法相比，探討流動(dòng)分析儀測(cè)定堿熔法土壤全磷含量的可行性，以期為準(zhǔn)確高效地檢測(cè)批量土壤全磷提供參考與指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 儀器

電子分析天平（萬(wàn)分之一）；AA3 流動(dòng)分析儀（配置MT7 模塊，AACE 操作軟件）；UV756 紫外分光光度計(jì)；烘箱；馬弗爐；高溫電爐。

1.2 樣品

2018 年8 月采集于廣西友誼關(guān)森林生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家定位觀測(cè)研究站設(shè)置在青山實(shí)驗(yàn)場(chǎng)人工林10 個(gè)樣地。樣地處于中國(guó)林科院熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心青山實(shí)驗(yàn)場(chǎng)（21°57′～22.19°N，106°39 ～106°59′E）。屬南亞熱帶季風(fēng)氣候，日照充足，降水充沛。年均溫度20.5 ～21.7℃，年 降 水 量1 200～1 500 mm，主要地貌類(lèi)型以低山丘陵為主，地帶性土壤為赤紅壤。每個(gè)樣點(diǎn)剖面層次為0 ～20 cm。10 個(gè)土樣風(fēng)干后碾壓過(guò)1.68 mm 篩，以四分法取得對(duì)角土樣，再碾壓處理過(guò)0.3 mm 篩，密封于聚丙烯袋中，編號(hào)樣1 ～10。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)土樣［GBW（E）0070043（0.86 g/kg±0.07 g/kg）］編號(hào)為 S1。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 土壤樣品消解

稱(chēng)取土壤樣品及標(biāo)準(zhǔn)土樣0.2 g 鋪于鎳坩堝底部，加2 ～3 滴無(wú)水乙醇潤(rùn)濕土樣，加固體氫氧化鈉2 g 平鋪在土樣表面。坩堝放于高溫電爐加熱，氫氧化鈉熔融后，將坩堝加蓋放于馬弗爐中加熱，400℃保持20 min，繼續(xù)加熱到720℃保持45 min。待降溫后取出坩堝，加入約10 mL 水，在電爐上低溫加熱，溶解坩堝內(nèi)的熔塊，用8 mL 的 4.5 mol/L硫酸將坩堝內(nèi)及蓋子清洗干凈，再用熱水沖洗坩堝，沖洗物皆順漏斗進(jìn)入容量瓶?jī)?nèi)，再加5 滴1∶1濃鹽酸，冷卻后，用水定容至50 mL?？瞻撞患油寥溃喜僮?。

1.3.2 方法回收率實(shí)驗(yàn)

土壤樣1、7 為一組，兩個(gè)土壤樣各稱(chēng)0.2 g，共稱(chēng)6 組。3 組土壤各加入0.1%的磷酸二氫鉀0.5 mL，3 組土壤各加入1%的磷酸二氫鉀0.25 mL，6 組土壤低溫烘干后，加2 ～3 滴無(wú)水乙醇潤(rùn)濕土樣品，加入氫氧化鈉2 g，后續(xù)加熱消解同1.3.1 操作。消解液經(jīng)檢測(cè)后，回收率計(jì)算公式：全磷回收率=（加標(biāo)后磷濃度-樣品磷濃度）/加標(biāo)磷濃度×100%

1.3.3 流動(dòng)分析儀法

1.3.3.1 試劑 進(jìn)樣清洗液（硫酸5.3 mL，58.5 g氯化鈉，溶解定容至1 000 mL），0.3 mol/L 氫氧化鈉（12 g 氫氧化鈉溶于1 000 mL 水中），系統(tǒng)清洗液（0.5 g 十二烷基硫酸鈉加入250 mL 去離子水中），鉬酸銨溶液（1.0 g 鉬酸銨、0.05 g 酒石酸銻鉀及9.5 mL 硫酸，定容100 mL），抗壞血酸溶液（1.5 g 抗壞血酸溶于100 mL 水中），所用試劑均為分析純級(jí)別。

1.3.3.2 儀器條件 流速60 個(gè)/h，進(jìn)樣：清洗液=3∶1，進(jìn)樣時(shí)間48 s，清洗時(shí)間24 s，儀器默認(rèn)設(shè)置基線和漂移校正，自動(dòng)基線參比為5%，比色濾光片波長(zhǎng)為660 nm。土壤全磷含量小于5 mg/L，選擇低濃度吸樣管進(jìn)樣。

1.3.3.3 流動(dòng)分析儀-MT7 模塊管路 由圖1 可見(jiàn)10 個(gè)管路所對(duì)應(yīng)的試劑溶液依次為進(jìn)樣清洗液、空氣、0.3 mol/L 氫氧化鈉、水、空氣、0.3 mol/L 氫氧化鈉、消解液進(jìn)樣、鉬酸銨溶液、抗壞血酸溶液、水。

1.3.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 抽取100 mg/L 磷標(biāo)準(zhǔn)液0、0.10、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mL， 由1.3.1中的消解空白液定容至25 mL，配制得磷濃度為0、0.40、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，在上述條件下檢測(cè)，建立全磷的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=1.001x-0.007（R2=0.999 8）。

1.3.4 鉬銻抗比色法

1.3.4.1 試劑 鉬銻抗顯色劑（153 mL 硫酸倒入水中，攪拌冷卻，倒入溶有10 g 鉬酸銨的水溶液中，將硫酸溶液倒入，加入5 g/L 酒石酸銻鉀100 mL，水定容1 L 后即得鉬銻抗貯存液。檢測(cè)前取100 mL 鉬銻抗貯存液加入1.5 g 抗壞血酸，攪拌溶解即得顯色劑），2，4 一二硝基酚，0.5 mol/L 硫酸，2 mol/L 氫氧化鈉。以上試劑均為分析純級(jí)別。

1.3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 抽取10 mg/L 磷標(biāo)準(zhǔn)液0、0.25、0.50、1.00、2.00、3.00 mL，加入5 mL 空白，配制磷濃度為0、0.10、0.20、0.40、0.80、1.20 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。加入1 滴2，4 一二硝基酚，逐滴加入2 mol/L 氫氧化鈉至溶液變?yōu)榈S色，再逐滴加0.5 mol/L 硫酸至溶液變?yōu)闊o(wú)色，再加入一滴2 mol/L 氫氧化鈉，溶液變?yōu)榈S色。加入2.5 mL顯色劑，定容25 mL，搖勻，靜置40 min，于紫外分光光度計(jì)波長(zhǎng)700 nm 處檢測(cè)，建立全磷的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=1.801x-0.003 2（R2=0.999 8）。

1.3.4.3 抽取1.3.1、1.3.2 中適量土壤消解液，按

1.3.4.2 調(diào)整酸堿度，加顯色劑，定容及檢測(cè)。

圖1 AA3 流動(dòng)分析儀-MT7 模塊管路圖

1.4 數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、繪圖，進(jìn)行t檢驗(yàn)-成對(duì)雙樣本均值分析，利用直線方程進(jìn)行回歸分析，檢驗(yàn)相關(guān)系數(shù)的顯著性。流動(dòng)分析儀重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，選擇3 個(gè)土壤，對(duì)其全磷分別重復(fù)測(cè)定5 次。測(cè)量值Xi 的算術(shù)平均值為樣品全磷的估計(jì)值，標(biāo)準(zhǔn)偏差用貝塞爾公式計(jì)算，即：

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)分析儀與鉬銻抗比色法的比較

由圖2 可見(jiàn)，流動(dòng)分析儀與鉬銻抗比色法測(cè)定11 個(gè)土壤樣品，每個(gè)土壤樣品的同一消解液均測(cè)定3 次，全磷含量分別在0.190 ～0.885、0.197 ～0.838 g/kg， 流動(dòng)分析儀與鉬銻抗比色法測(cè)定的全磷含量平均值分別為0.414 2、0.408 6 g/kg。

由表1 可見(jiàn)，兩種方法的測(cè)定結(jié)果經(jīng)t檢驗(yàn)，雙尾P（T ≤t）=0.525 4，無(wú)顯著性差異。流動(dòng)分析儀與鉬銻抗比色法測(cè)定的全磷含量進(jìn)行相關(guān)性分析，兩種方法呈極顯著性的線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R=0.990 0。由圖3 可見(jiàn)，兩種方法測(cè)定結(jié)果的回歸直線方程y（流動(dòng)分析儀-P）=1.060 6x（鉬銻抗比色法-P）-0.019 1。

圖2 流動(dòng)分析儀法與鉬銻抗比色法測(cè)定土壤全磷含量的比較

表1 流動(dòng)分析儀和鉬銻抗比色法測(cè)定土壤全磷含量的t 檢驗(yàn)（成對(duì)雙樣本均值分析）

圖3 流動(dòng)分析儀和鉬銻抗比色法測(cè)定土壤全磷含量的相關(guān)分析

2.2 流動(dòng)分析儀測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性與精密度分析

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行方法回收率檢驗(yàn)。2 組加標(biāo)的土壤樣品經(jīng)堿熔法消解后，每組采用流動(dòng)分析儀測(cè)定3 次。由表2 可見(jiàn)，流動(dòng)分析儀測(cè)定全磷含量的回收率在98.09%～102.89%。

在相同檢測(cè)條件下，使用流動(dòng)分析儀對(duì)3 個(gè)土壤的全磷，分別重復(fù)測(cè)定5 次，測(cè)定結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.20%～2.07%（表3）。

表2 流動(dòng)分析儀測(cè)定土壤全磷的加標(biāo)回收率結(jié)果

表3 流動(dòng)分析儀法測(cè)定土壤全磷含量重復(fù)性試驗(yàn)

3 討論

流動(dòng)分析儀測(cè)定堿熔法土壤全磷含量是利用磷鉬藍(lán)原理，消解液中的磷酸鹽和鉬酸銨在一定酸性條件形成藍(lán)色的磷鉬雜多酸，其Mo6+被還原劑抗壞血酸還原為Mo5+，生成鉬藍(lán)物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)中鉬銻抗比色法的顯色混合液的pH=0.94，流動(dòng)分析儀的顯色混合液的pH=0.95，兩種方法的H+濃度均為0.11 mol/L。兩種方法顯色酸度一致，與磷鉬藍(lán)的適宜顯色酸度一致［12-14］。

流動(dòng)分析儀測(cè)定堿熔法土壤全磷含量所用試劑較少，0.3 mol/L 氫氧化鈉管速為0.8 mL/min，鉬酸銨溶液和抗壞血酸溶液的管速均為0.23 mL/min。測(cè)定100 個(gè)樣品，0.3 mol/L 氫氧化鈉用量不超過(guò)200 mL，鉬酸銨溶液和抗壞血酸溶液用量均小于50 mL。鉬銻抗比色法按抽取5 mL 待測(cè)液，定容25 mL 計(jì)，每個(gè)樣品加入2 mol/L 氫氧化鈉量約2.5 mL，鉬酸銨和抗壞血酸的混合溶液量為2.5 mL。檢測(cè)100 個(gè)樣品，2 mol/L 氫氧化鈉用量約250 mL，鉬酸銨和抗壞血酸混合溶液用量約為250 mL。流動(dòng)分析儀測(cè)定堿熔法土壤全磷含量的試劑用量明顯小于鉬銻抗比色法的。使用流動(dòng)分析儀測(cè)定100 個(gè)土壤全磷含量的用時(shí)為4 h，人員只負(fù)責(zé)試劑配置，儀器參數(shù)設(shè)置工作；使用鉬銻抗比色法測(cè)定100 個(gè)土壤全磷含量的檢測(cè)用時(shí)達(dá)8 h 以上，人員工作包括試劑配制，抽取待測(cè)液，酸堿調(diào)整及定容，比色檢測(cè)等一系列繁雜內(nèi)容，人員工作強(qiáng)度較大。流動(dòng)分析儀的檢測(cè)效率是鉬銻抗比色法的2 倍以上，節(jié)省人工，節(jié)約試劑，且避免了人工操作引起的人為誤差，檢測(cè)準(zhǔn)確、高效、經(jīng)濟(jì)。

4 結(jié)論

流動(dòng)分析儀測(cè)定堿熔法土壤全磷含量的回收率在98.09% ～102.89%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.20%～2.07%。方法精密度及準(zhǔn)確性良好。與鉬銻抗比色法所測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差異。流動(dòng)分析儀與鉬銻抗比色法所測(cè)結(jié)果的的回歸直線方程y（流動(dòng)分析儀-P）=1.060 6x（鉬銻抗比色法-P）-0.019 1，R=0.990 0。流動(dòng)分析儀測(cè)定堿熔法土壤全磷所用試劑量少，檢測(cè)效率高，適用于批量土壤全磷的檢測(cè)分析。