畢夢(mèng)迪，歐陽(yáng)銘珊，黎 旭，張秀瓊，尹萍萍，蔡林蘅，武 攀，李寶坤

（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子832000）

乳酸菌是一類能夠發(fā)酵碳水化合物并且產(chǎn)生乳酸的無(wú)芽孢、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌[1]。近年來(lái)，大量的研究都證實(shí)了乳酸菌具有益生特性，特別是在改善人體腸道微環(huán)境方面發(fā)揮重要作用[2-3]。食品加工過(guò)程中，特別是諸如傳統(tǒng)發(fā)酵香腸、發(fā)酵酸魚、火腿、醬油、奶酪、泡菜等發(fā)酵食品的制備過(guò)程中往往會(huì)加入大量的食用鹽，賦予產(chǎn)品風(fēng)味和抑制雜菌的同時(shí)延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期[4-6]，但高濃度的鹽在一定程度上會(huì)抑制發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌的生長(zhǎng)，鹽脅迫會(huì)損傷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致胞內(nèi)各種代謝紊亂甚至細(xì)胞死亡[7-8]，但是最近的研究顯示，鹽脅迫具有提高鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）的富硒能力的作用[9]。

新疆擁有牧草地面積約0.511億km2，是我國(guó)重要的畜牧業(yè)大省[10]，其中伊犁牧區(qū)是新疆最主要的畜牧業(yè)基地之一。新疆少數(shù)民族有收集動(dòng)物乳制作發(fā)酵奶制品的傳統(tǒng)，從牧區(qū)奶制品和環(huán)境中挖掘菌種資源并加以保護(hù)成為一項(xiàng)重要工作[11-12]，蔣艾廷等[13]從新疆塔城傳統(tǒng)酸奶中篩選出具有優(yōu)良產(chǎn)酸性能的30株乳酸菌，并對(duì)其自溶度和蛋白酶活力進(jìn)行了研究；金丹等[14]從新疆塔城地區(qū)酸馬奶中分離了53株乳酸菌，并篩選出5株能耐受13%乙醇的乳酸菌；張亞川等[15]從新疆伊犁州乳品中初步分離純化出71株乳酸菌，并從中篩選出3株符合酸乳發(fā)酵菌種要求的德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）。目前研究主要集中于乳酸菌的生理特性、生理學(xué)功能及其在工業(yè)中的應(yīng)用，對(duì)高滲情況下乳酸菌發(fā)酵性能的研究較少，而乳酸菌發(fā)酵劑的生產(chǎn)性能（包括產(chǎn)香性、產(chǎn)粘性、產(chǎn)酸性）和抗逆性（耐酸耐膽鹽能力）直接關(guān)系到最終發(fā)酵制品的性能，同時(shí)也是影響產(chǎn)品質(zhì)量的一個(gè)因素。

本研究利用傳統(tǒng)分離技術(shù)從新疆牧區(qū)土壤中篩選耐鹽乳酸菌，通過(guò)形態(tài)觀察及分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定，并對(duì)其發(fā)酵特性，特別是在高滲環(huán)境下（7%、8%NaCl）的發(fā)酵性能（耐酸耐膽鹽能力）進(jìn)行研究，以期獲得發(fā)酵性能好和抗逆性強(qiáng)的優(yōu)良發(fā)酵乳酸菌菌株，為高鹽發(fā)酵食品的商業(yè)發(fā)酵劑開發(fā)提供研究基礎(chǔ)，確保發(fā)酵乳等制品有一定的活菌數(shù)，食用后能在腸道中定植。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

土樣來(lái)源于新疆維吾爾自治區(qū)伊犁哈薩克自治州額敏縣牧區(qū)，具體信息見表1。

表1 土樣來(lái)源Table 1 Source of soil samples

1.1.2 試劑

無(wú)水乙醇（純度≥99.7%）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；細(xì)菌基因組總脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：北京天根生化科技有限公司；豬膽鹽（純度≥90%）：上海麥克林生化科技有限公司；革蘭氏染液：北京索萊寶生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS液（固）體培養(yǎng)基：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。含碳酸鈣的MRS（CaCO3-MRS）固體培養(yǎng)基：MRS固體培養(yǎng)基中添加1.5%的碳酸鈣。

1.2 儀器與設(shè)備

TC-512聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀：英國(guó)Techne公司；T100 Power Pac Universal電泳儀、Universal Hood ⅡGel DOC XR凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)BioRad公司；CX21FS1光學(xué)顯微鏡：日本Olympus公司；LAC-5040S標(biāo)準(zhǔn)型pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；Bnp-9272智能生化培養(yǎng)箱：上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；5424R高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；Synergy 2多功能酶標(biāo)儀：美國(guó)BIOTEK儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離

稱取1.0 g土壤樣品，加入10 mL無(wú)菌生理鹽水，混勻，靜置10 min后取上清液1 mL加至20 mL含有7% NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h。取菌液在CaCO3-MRS平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)48 h[16]。挑取溶鈣圈較大、革蘭氏染色為陽(yáng)性、接觸酶試驗(yàn)為陰性并具有乳酸菌典型形態(tài)學(xué)特征的菌落，在MRS固體培養(yǎng)基上再次劃線分離純化后斜面保存?zhèn)溆肹17]。

1.3.2 篩選耐鹽乳酸菌的篩選

將分離純化得到的乳酸菌菌株進(jìn)行活化并培養(yǎng)16～18 h后，以2%（V/V）的接種量分別接種至NaCl含量為7%、8%、9%、10%的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，通過(guò)培養(yǎng)基渾濁情況的變化篩選出耐鹽乳酸菌[18]。

1.3.3 耐鹽乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)DNA提取試劑盒說(shuō)明書步驟提取目標(biāo)耐鹽乳酸菌菌株的DNA，以其為模板，采用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）對(duì)篩選菌株的16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：10×Buffer 2.5 μL，10 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）0.5 μL，10 μmol/L引物各0.5 μL，Taq酶1.25 U，模板2 μL，雙蒸水（ddH2O）定容至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異性。將電泳檢測(cè)合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序基因序列提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對(duì)分析，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA序列，采用軟件Mega5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 篩選菌株在高滲環(huán)境下的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸能力

按2%的接種量將活化培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的菌株分別接種于含7%、8%NaCl的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，每隔2 h取樣在波長(zhǎng)600 nm條件下測(cè)定樣品的OD600nm值和pH值，繪制乳酸菌的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸曲線。

1.3.5 篩選菌株在高滲環(huán)境下的耐酸、耐膽鹽脅迫能力

耐酸性能的測(cè)定：將活化好的篩選菌株按2%的接種量分別接種到含7%、8%NaCl，pH值為3.0、4.6的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，每隔2 h取樣在波長(zhǎng)600 nm條件下測(cè)定樣品的OD600nm值，繪制乳酸菌的生長(zhǎng)曲線，并且每隔2 h取樣，測(cè)定pH值，繪制產(chǎn)酸變化曲線。

耐膽鹽性能的測(cè)定：將活化好的篩選菌株按2%的接種量分別接到含7%、8% NaCl，0.10%、0.15%膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，每隔2 h取樣在波長(zhǎng)600 nm條件下測(cè)定樣品的OD600nm值，繪制乳酸菌的生長(zhǎng)曲線，并且每隔2 h取樣，測(cè)定pH值，繪制產(chǎn)酸變化曲線。

1.3.6 篩選菌株耐鹽性能的測(cè)定

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)末期的菌液，按2%的接種量分別接種于含10%和12%NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下脅迫3 h后進(jìn)行涂布于MRS固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)（N），同時(shí)對(duì)接種液進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)（N0），計(jì)算存活率，其計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鹽乳酸菌菌株的分離與篩選

從27個(gè)土壤樣品中共分離純化得到64株疑似乳酸菌，通過(guò)篩選共獲得4株耐鹽乳酸菌，編號(hào)分別為a、b、c、d。4株乳酸菌均能在含8%NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其中菌株c能夠在含9%NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，在含10%NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中4株菌的生長(zhǎng)被明顯抑制。

2.2 耐鹽乳酸菌菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察

對(duì)篩選出的4株耐鹽乳酸菌菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果見圖1。

圖1 耐鹽乳酸菌的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)Fig. 1 Colony and cell morphology of salt tolerant lactic acid bacteria

由圖1可知，在MRS固體培養(yǎng)基上，4株耐鹽乳酸菌的菌落均呈乳白色，并且中央隆起具有濕潤(rùn)表面，邊緣整齊，呈乳白色，革蘭氏染色結(jié)果均為陽(yáng)性，個(gè)體微小，周身無(wú)鞭毛與芽孢，符合乳酸菌基本特征。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

4株耐鹽乳酸菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

圖2 基于16S rDNA基因序列耐鹽乳酸菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of salt tolerant lactic acid bacteria based on 16S rDNA gene sequences

由圖2可知，菌株a、b、c與海氏腸球菌（Enterococcus hirae）聚于一支，親緣關(guān)系最近；菌株d與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）聚于一支，親緣關(guān)系最近，因此鑒定菌株a、b、c均為為海氏腸球菌（Enterococcus hirae），菌株d為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

2.3 耐鹽乳酸菌的發(fā)酵特性

2.3.1 耐鹽乳酸菌的生長(zhǎng)特性

鄔慧穎[19]研究鹽脅迫響應(yīng)基因?qū)w分裂增殖的影響結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫響應(yīng)基因膜轉(zhuǎn)運(yùn)體基因feoA的缺失會(huì)使遲滯期被延長(zhǎng)并影響菌體的分裂增殖。由圖3可知，L.plantarumdd在7%NaCl含量下的最終OD600nm值為1.866，而在8% NaCl含量下的最終OD600nm值為0.760，E. hiraea、b、c在7%NaCl含量下的最終OD600nm值分別為0.898、0.773、0.873，而在8%NaCl含量下的最終OD600nm值分別為0.105、0.086、0.117，結(jié)果表明，隨著NaCl含量的增加，各菌株的生長(zhǎng)受到了不同程度的抑制，其中L.plantarumdd的生長(zhǎng)特性相對(duì)于其他三株更好，E.hiraea、b、c差別不大。

圖3 在NaCl含量7%（a）及8%（b）條件下耐鹽乳酸菌的生長(zhǎng)曲線Fig. 3 Growth curves of salt tolerant lactic acid bacteria under 7% (a)and 8% (b) NaCl concentration conditions

2.3.2 耐鹽乳酸菌的產(chǎn)酸特性

由圖4可知，隨著NaCl含量的升高，各菌株的產(chǎn)酸速率明顯降低。L.plantarumd在7%NaCl含量下的最終pH值為3.48，在8%NaCl含量下的最終pH值為3.79，E.hiraea、b、c在7%NaCl含量下的最終pH值分別為4.01、4.08、3.97，而在8%NaCl含量下的最終pH值分別為4.99、5.09、4.63，結(jié)果表明，隨著NaCl含量的增加，各菌株的產(chǎn)酸受到了不同程度的抑制。其中L.plantarumdd的產(chǎn)酸特性相對(duì)于其他三株更好，E.hiraea、b、c差別不大。

圖4 耐鹽乳酸菌在NaCl含量7%（a）及8%（b）條件下的產(chǎn)酸曲線Fig. 4 Acid production curves of salt tolerant lactic acid bacteria under 7% (a) and 8% (b) NaCl concentration conditions

2.3.3 耐鹽乳酸菌的耐酸性能研究

圖5 pH3.0時(shí)耐鹽乳酸菌在NaCl含量7%（a）及8%（b）條件下的生長(zhǎng)曲線Fig. 5 Growth curves of salt tolerant lactic acid bacteria under 7% (a)and 8% (b) NaCl concentration conditions at pH 3.0

圖6 pH4.6時(shí)耐鹽乳酸菌在NaCl含量7%（a）及8%（b）條件下的生長(zhǎng)曲線Fig. 6 Growth curves of salt tolerant lactic acid bacteria under 7% (a)and 8% (b) NaCl concentration conditions at pH 4.6

圖7 pH3.0時(shí)耐鹽乳酸菌在NaCl含量7%（a）及8%（b）條件下的產(chǎn)酸曲線Fig. 7 Acid production curves of salt tolerant lactic acid bacteria under 7% (a) and 8% (b) NaCl concentration conditions at pH 3.0

由圖5可知，在7%和8%NaCl含量下，E.hiraea、b、c和L.plantarumd在pH 3.0的酸性環(huán)境，均未出現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)。結(jié)果表明，在pH 3.0的酸性環(huán)境，7%和8% NaCl含量下，E.hiraea、b、c和L.plantarumd 生長(zhǎng)均受到明顯抑制。

由圖6可知，在7%和8%NaCl含量下，L.plantarumd比E.hiraea、b、c更適應(yīng)pH 4.6的酸性環(huán)境，出現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)，同時(shí)8%NaCl含量使E.hiraea、b、c和L.plantarumd的生長(zhǎng)受到抑制。

由圖7可知，在7%和8%NaCl含量下，pH 3.0的酸性環(huán)境中E.hiraea、b、c和L.plantarumd幾乎不產(chǎn)酸，生長(zhǎng)受到明顯抑制。

圖8 pH4.6時(shí)耐鹽乳酸菌在NaCl含量7%（a）及8%（b）條件下的產(chǎn)酸曲線Fig. 8 Acid production curves of salt tolerant lactic acid bacteria under 7% (a) and 8% (b) NaCl concentration conditions at pH 4.6

由圖8可知，產(chǎn)酸情況的變化也應(yīng)證了OD600nm值的變化結(jié)果，在7%和8%NaCl含量下，pH 4.6的酸性環(huán)境中E.hiraea、b均在24 h開始產(chǎn)酸，但pH下降幅度不大。E.hiraec幾乎不產(chǎn)酸，生長(zhǎng)受到明顯抑制。L.plantarumd在培養(yǎng)2 h后pH值開始迅速降低，36 h后逐漸停止產(chǎn)酸，最終pH值分別下降至3.42和3.56。

結(jié)果表明，在7%、8%NaCl脅迫下，L.plantarumd的酸耐受性較好。

2.3.4 耐鹽乳酸菌的耐膽鹽性能研究

乳酸菌需能夠耐受胃液中的強(qiáng)酸與腸道內(nèi)的高濃度膽鹽，并在人體內(nèi)大量存活才能發(fā)揮其益生作用[20]。由圖9可知，在0.10%膽鹽脅迫下，在7%和8%NaCl含量條件下，E.hiraea、b、c具有較好的膽鹽脅迫抗性，且均在培養(yǎng)24 h達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，而L.plantarumd未有明顯生長(zhǎng)趨勢(shì)。海氏腸球菌中E.hiraec抗性最好，E.hiraeb最差，0.10%的膽鹽對(duì)L.plantarumd的抑制作用明顯。

圖9 0.10%膽鹽時(shí)耐鹽乳酸菌在NaCl含量7%（a）及8%（b）條件下的生長(zhǎng)曲線Fig. 9 Growth curves of salt tolerant lactic acid bacteria under 7% (a)and 8% (b) NaCl concentration conditions at 0.10% bile salt

圖10 0.15%膽鹽時(shí)耐鹽乳酸菌在NaCl含量7%（a）及8%（b）條件下的生長(zhǎng)曲線Fig. 10 Growth curves of salt tolerant lactic acid bacteria under 7% (a)and 8% (b) NaCl concentration conditions at 0.15% bile salt

由圖10可知，4株菌在0.15%膽鹽中的生長(zhǎng)趨勢(shì)與在0.10%膽鹽中類似，海氏腸球菌均能生長(zhǎng)而植物乳桿菌L.plantarumd未有明顯生長(zhǎng)趨勢(shì)，但值得指出的是，E.hiraec在7%NaCl含量下的生長(zhǎng)速度和對(duì)膽鹽的抗性要明顯優(yōu)于E.hiraea和E.hiraeb，而在8%NaCl含量下E.hiraec沒(méi)有表現(xiàn)出類似的優(yōu)勢(shì)，這說(shuō)明在面對(duì)膽鹽脅迫時(shí)，NaCl含量的改變可能會(huì)影響到菌株的脅迫抗性。

圖11 0.10%膽鹽時(shí)耐鹽乳酸菌在NaCl含量7%（a）及8%（b）條件下的產(chǎn)酸曲線Fig. 11 Acid production curves of salt-tolerant lactic acid bacteria under 7% (a) and 8% (b) NaCl concentration conditions at 0.10% bile salt

由圖11可知，在0.10%膽鹽的環(huán)境中，E.hiraea、b在7%NaCl含量下培養(yǎng)2 h后產(chǎn)生大量有機(jī)酸，pH值迅速下降，12 h左右pH值趨于穩(wěn)定；在8%NaCl含量下，培養(yǎng)10 h左右pH值迅速下降，12～24 h期間，pH值的下降速率明顯減小。E.hiraec在7%NaCl含量下，培養(yǎng)6 h左右pH值迅速下降，24 h時(shí)產(chǎn)酸停止；在8%NaCl含量下，培養(yǎng)8 h左右pH值迅速下降，24 h左右產(chǎn)酸停止。L.plantarumd在7%和8%NaCl含量下產(chǎn)酸性能均優(yōu)于海氏腸球菌，但是在8%NaCl含量時(shí)，產(chǎn)酸在培養(yǎng)24 h后即停止。

由圖12可知，在0.15%膽鹽的環(huán)境中，7%NaCl含量下，E.hiraea、b在8 h左右pH值開始下降，24 h產(chǎn)酸停止；在8%NaCl含量下，E.hiraea、b、c的產(chǎn)酸曲線幾乎相同，12 h開始產(chǎn)酸，pH值迅速下降，24h左右pH值下降減緩。L.plantarumd在7%NaCl含量下，8 h左右pH值迅速下降，與其他3株菌不同的是12 h左右產(chǎn)酸停止，而在8%NaCl含量下，其延滯時(shí)間比海氏腸球菌更短。

圖12 0.15%膽鹽時(shí)耐鹽乳酸菌在NaCl含量7%（a）及8%（b）條件下的產(chǎn)酸曲線Fig. 12 Acid production curves of salt-tolerant lactic acid bacteria under 7% (a) and 8% (b) NaCl concentration conditions at 0.15% bile salt

結(jié)果表明，在7%、8%NaCl脅迫下，E.hiraea、b、c膽鹽耐受性較好。

2.4 耐鹽乳酸菌的耐鹽性能研究

對(duì)篩選出的耐鹽乳酸菌分別用10%與12%的NaCl脅迫3 h，進(jìn)一步考察其對(duì)NaCl的耐受性，結(jié)果見圖13。由圖13可知，4種耐鹽乳酸菌對(duì)鹽的耐受性差異顯著（P＜0.05）。在10%的NaCl含量下，E.hiraea、b、c、L.plantarumd的存活率分別為45.89%、60.69%、47.34%、41.58%；在12%的NaCl含量下，E.hiraea、b、c、L.plantarumd的存活率分別為43.72%、56.13%、39.24%、35.70%。由此可知，E.hiraeb對(duì)鹽的耐受性最好，E.hiraec和E.hiraea次之，L.plantarumd對(duì)鹽的耐受性最差。

圖13 耐鹽乳酸菌對(duì)鹽的耐受性Fig. 13 Tolerance of salt tolerant lactic acid bacteria to salt

3 結(jié)論

從新疆維吾爾自治區(qū)伊犁哈薩克自治州額敏縣的土壤樣品中分離出64株乳酸菌，從中篩選出4株耐鹽乳酸菌（a、b、c及d），通過(guò)形態(tài)觀察及分子生物學(xué)技術(shù)鑒定菌株a、b及c均為海氏腸球菌（Enterococcus hirae），菌株d為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。在高鹽脅迫（7%、8%NaCl）下，L.plantarumd的生長(zhǎng)特性、產(chǎn)酸及耐酸性能最好，但耐膽鹽能力最差，E.hiraea、b、c的耐膽鹽脅迫能力更佳；在10%和12%的NaCl含量下脅迫3 h，4株菌的存活率均能維持在36%以上，其中E.hiraeb的耐鹽能力最佳，存活率最高。