王 雪,劉虹遙,路鑫超*，孫旭晴，葉一霏，黃成軍*

(1.中國科學(xué)院 微電子研究所，北京 100029；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

1 引 言

光學(xué)顯微鏡是人們觀察微觀世界的重要工具。傳統(tǒng)的光學(xué)顯微成像系統(tǒng)一般由光源、多個(gè)透鏡及圖像傳感器等多個(gè)部件組成，結(jié)構(gòu)復(fù)雜、價(jià)格昂貴。由于受到物鏡固定空間帶寬積的限制，顯微鏡往往無法同時(shí)滿足高分辨率成像和大成像視場的需求[1]。以生物醫(yī)學(xué)顯微成像為例，為了獲得高分辨率、大視場顯微圖像，需要將許多小視場圖像進(jìn)行拼接，因此必須對(duì)圖像進(jìn)行預(yù)處理，圖像的配準(zhǔn)和融合通常存在準(zhǔn)確性低、耗時(shí)長等問題[2-3]。

近年來，隨著光電圖像傳感器件的發(fā)展以及圖像處理技術(shù)的進(jìn)步，一種新型的顯微成像技術(shù)——無透鏡成像技術(shù)得到了迅速發(fā)展。該技術(shù)不僅克服了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡空間帶寬積的限制，無球差、彗差等光學(xué)透鏡帶來的像差，而且具有結(jié)構(gòu)簡單、便攜性高和成本低等優(yōu)點(diǎn)[4-7]。目前，無透鏡成像技術(shù)主要有無透鏡陰影成像[8]、無透鏡熒光成像[9]和無透鏡全息成像[6]三種。其中，無透鏡全息成像技術(shù)不需要對(duì)樣品進(jìn)行特殊處理，且分辨率高，因此最具應(yīng)用前景。無透鏡全息顯微成像系統(tǒng)的硬件部分通常由一個(gè)部分相干LED光源、一個(gè)針孔或光纖和一個(gè)光電探測器(CCD或者CMOS)組成。在成像過程中，來自LED的光經(jīng)過針孔或光纖傳播一段距離后，照射到樣品上，樣品透過光的衍射圖樣被光電探測器記錄，然后使用圖像恢復(fù)算法處理樣品的全息圖，最終得到樣品的顯微放大圖像[4,7,10]。為了快速地重構(gòu)出樣品的高分辨率復(fù)值圖像，研究人員設(shè)計(jì)了多種數(shù)字圖像重建算法，例如改進(jìn)的GS算法[11]、混合輸入輸出算法(HIO)[12]、多圖像相位恢復(fù)算法[13]及深度學(xué)習(xí)算法[14]等。目前，無透鏡全息顯微鏡可以在20～30 mm2的成像視場下實(shí)現(xiàn)亞微米量級(jí)的分辨率極限。

本文搭建了一套無透鏡全息顯微成像系統(tǒng)，該系統(tǒng)由中心波長為595 nm的窄帶LED光源、直徑為50 μm的針孔和單像素尺寸為2.2 μm、500萬像素、視場為24.5 mm2的板式相機(jī)組成，并開發(fā)了相應(yīng)的圖像恢復(fù)算法。該系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)具有亞微米級(jí)圖形的測試靶和實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞H1299的顯微成像，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

2 成像原理與實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)

2.1 成像原理及參數(shù)優(yōu)化

全息無透鏡顯微成像系統(tǒng)原理如圖1所示，主要包括中心波長λ=595 nm的LED光源、直徑D=50 μm的精密針孔、被測樣品與CMOS圖像傳感器。針孔與被測樣品的距離為Z1，被測物與CMOS圖像傳感器的距離為Z2。使用針孔可提高出射光的相干度，在距離Z1滿足一定條件時(shí)，照射到樣品上的光近似為相干光。使用二維移動(dòng)平臺(tái)搭載被測樣品，透過樣品的光可以分為兩部分，一部分是經(jīng)過樣品的光，稱為物光；一部分是透過樣品基底但沒有經(jīng)過樣品的光，稱為參考光。這兩部分光在透過樣品后相互干涉，形成的干涉圖案被CMOS圖像傳感器記錄。

圖1 無透鏡全息顯微成像系統(tǒng)示意圖Fig.1 Schematic diagram of lens-free holographic microscopy system

在Gabor全息圖的制作過程中，為了得到干涉全息圖，一般需要使用相干光照射目標(biāo)物體。本文使用的是部分相干光源，為使得從小孔出來的光到達(dá)樣品面處具有高度的相干性，該無透鏡全息成像系統(tǒng)需要滿足一定的參數(shù)設(shè)置[15]。由范西特-澤尼克定理，可以求得光源尺寸、傳播距離和相干照明面積之間的關(guān)系[16]。如圖2所示，如果光源的線性尺度和像面上的兩點(diǎn)P1和P2的間距L比光源到像面的距離小得多，則像面上的兩點(diǎn)P1和P2的相干度∣j12∣等于光源強(qiáng)度函數(shù)的歸一化傅里葉變換的絕對(duì)值，即有:

(1)

(2)

(3)

式(3)說明，對(duì)于半徑為ρ的圓形非相干光源，S處的平行平面上P1P2兩點(diǎn)若要保持高的相干度所需要滿足的關(guān)系。在本文中，由于針孔的作用，可以將從直徑為50 μm的針孔出射的部分相干光視為光源，將一定距離外5.7 mm×4.3 mm的CMOS圖像傳感器視為接收面。針對(duì)本文所搭建的無透鏡全息成像系統(tǒng)，ρ=25 μm，λ=595 nm。為得到清晰的全息圖像，在光強(qiáng)足夠，且保證在感光面上距離為P1P2的兩點(diǎn)具有高度的相干性，這里取光源到感光面的距離S為20 cm，使得樣品平面所在的位置對(duì)應(yīng)的相干長度P1P2約為762 μm，遠(yuǎn)大于成像目標(biāo)的特征尺寸，因此可以得到清晰的干涉圖樣。

圖2 范西特-澤尼克定理幾何布局示意圖Fig.2 Geometric layout of Van Cittert-Zernike theorem

2.2 全息圖像恢復(fù)算法設(shè)計(jì)

全息圖像恢復(fù)的基本原理是通過設(shè)計(jì)算法模擬光學(xué)衍射的過程，主要算法有菲涅爾衍射法、卷積法和角譜法。相較于菲涅爾衍射法和卷積法，角譜法的優(yōu)勢在于恢復(fù)像的大小與衍射距離和波長無關(guān)，使用僅一次傅里葉變換和一次傅里葉逆變換就可以實(shí)現(xiàn)圖像恢復(fù)，因此，在本文中使用角譜法算法實(shí)現(xiàn)全息圖像恢復(fù)。

(4)

(5)

因此，物平面上的光波U(x0,y0,0)和像平面上的光波U(x,y,z)的關(guān)系可以用如下傅里葉變換描述:

(6)

圖3 圖像重建流程Fig.3 Flow chart of image reconstruction

利用本文中所搭建的全息無透鏡成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像的采集和恢復(fù)，流程如圖3所示。從光源發(fā)出的光照射到樣品上，其中一部分光透過樣品，另一部分光透過載玻片上沒有樣品的部分，透過載玻片后兩部分光繼續(xù)向前衍射傳播，由CMOS記錄下在其表面產(chǎn)生的干涉全息圖。如圖4(a)所示，在全息圖重建過程中，首先將全息圖進(jìn)行傅里葉變換得到相應(yīng)的頻譜圖，如圖4(b)所示。物平面和像平面的距離Z2記為圖像的重建距離，相應(yīng)的傳輸函數(shù)為HZ，然后對(duì)圖像進(jìn)行逆傅里葉變換，得到重建目標(biāo)圖像，如圖4(c)所示。其中重建距離Z2對(duì)恢復(fù)圖像的質(zhì)量有明顯的影響，為了獲得高質(zhì)量的重建圖像，對(duì)Z2選取多組數(shù)值重建同一目標(biāo)物體，通過比較重建圖像的清晰度來確定最佳重建距離。該重建方式簡單便捷，特別適合于較大尺寸樣品(如數(shù)微米到數(shù)十微米量級(jí))的顯微成像。

圖4 (a)成像目標(biāo)的全息圖；(b)全息圖的傅里葉頻譜；(c)重建的目標(biāo)圖像Fig.4 (a) Hologram of object;(b) Fourier spectrum of hologram;(c) Reconstructed target image

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

圖5 無透鏡全息顯微成像系統(tǒng)裝置Fig.5 Photo of lensfree imaging setup

圖5為本文所搭建的全息無透鏡顯微成像系統(tǒng)，選用中心波長λ=595 nm的部分相干LED光源，與直徑D=50 μm的精密針孔，光源和針孔通過同軸機(jī)械件連接，成像面為單像素尺寸為2.2 μm、500萬像素、視場為5.7 mm×4.3 mm的CMOS圖像傳感器，針孔到樣品的距離Z1=20 cm，樣品到CMOS的距離Z2≈1 mm。

本文首先選取具有微米級(jí)圖案的分辨率測試靶(型號(hào)：USAF1951)作為樣品，對(duì)它進(jìn)行顯微成像，通過觀察分辨率靶中能分辨的最小線對(duì)，就可以獲得該無透鏡全息顯微成像系統(tǒng)可以達(dá)到的分辨率極限。圖6(a)～6(c)為CMOS圖像傳感器采集到的分辨率測試靶的全息圖像，圖6(a)是全息圖的全尺寸圖像，圖6(b)和6(c)是分辨率靶的逐級(jí)局部放大圖。

圖6 (a)～(c)分辨率測試靶的全息圖像和局部放大圖；(d)～(f)對(duì)應(yīng)(a)～(c)的恢復(fù)重建圖像Fig.6 (a)～(c) Hologram and local enlarged images of resolution test target;(d)～(f)Reconstructed images corresponding to (a)～(c)

重建后的圖像如圖6(d)～6(f)所示，重建距離為1 mm，取分辨率靶上第6組的第5，6線對(duì)，沿垂直線對(duì)方向提取強(qiáng)度變化曲線，結(jié)果如圖7(a)和圖7(b)所示。重建后的圖像可以分辨出分辨率靶上第6組的第6線對(duì)，其中，縱坐標(biāo)為像素?cái)?shù)，單像素尺寸為2.2 μm，圖像分辨率極限達(dá)到4.4 μm。

圖7 (a)和(b)分別對(duì)應(yīng)圖6(f)中分辨率靶上第6組的第5，6線對(duì)的強(qiáng)度值沿橫向變化的曲線Fig.7 (a) and (b) correspond to the transverse intensity value change curve of line 5 and line 6 in group 6 of test target in Fig.6 (b), respectively

在上述研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，本文進(jìn)一步對(duì)生物樣品——肺癌H1299細(xì)胞進(jìn)行全息無透鏡顯微成像研究。細(xì)胞懸浮液(RPMI-1640+10% FBS+1%雙抗)中培養(yǎng)的肺癌H1299細(xì)胞，在傳統(tǒng)顯微鏡(顯微鏡型號(hào)：Olympus IX73)下近似為球形，典型細(xì)胞直徑為10～20 μm。實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞培養(yǎng)液(細(xì)胞濃度約為104細(xì)胞/毫升)滴加到全息無透鏡顯微成像系統(tǒng)中的CMOS圖像傳感器上方的載玻片上，形成一層厚度在幾百微米的液膜。圖8(a)為通過無透鏡全息顯微成像系統(tǒng)采集到的樣品的全息圖，圖8(b)是局部放大圖，可以看到細(xì)胞在全息圖上的分布，通過截取圖8(b)中兩處局部進(jìn)一步放大，可以更清楚地看到單個(gè)或重疊的細(xì)胞的干涉全息圖。圖8(c)所示是經(jīng)過圖像恢復(fù)算法得到的細(xì)胞樣品的顯微放大圖像，兩處局部放大圖對(duì)應(yīng)圖8(b)中的樣品兩處局部放大的相同位置，更清楚地展示了重建圖像中細(xì)胞的形貌，可以觀察到重建后的單個(gè)細(xì)胞以及緊貼粘連在一起的多個(gè)細(xì)胞。圖9是與圖8相對(duì)應(yīng)的肺癌細(xì)胞的相位圖，兩幅插圖展示了相應(yīng)的單個(gè)細(xì)胞和多個(gè)粘連在一起的多個(gè)細(xì)胞的形貌。與強(qiáng)度重建圖相比，在相位圖中細(xì)胞的輪廓明顯的比中心亮，更有利于識(shí)別細(xì)胞的形貌。

圖8 (a)肺癌細(xì)胞的全息圖；(b)是(a)圖的局部放大圖；(c)是與(b)圖對(duì)應(yīng)的重建的肺癌細(xì)胞圖像Fig.8 (a) Hologram of lung cancer cells;(b) Partial enlarged view of Fig. (a);(c) Reconstructed lung cancer cells image corresponding to Fig. (b)

圖9 (a)肺癌細(xì)胞的重建相位;(b)是(a)圖的局部放大圖，插圖為圖8中對(duì)應(yīng)的細(xì)胞的相位圖Fig.9 (a) Phase image of lung cancer cells;(b) Partial enlarged view of Fig. (a), Two insets are phase images of corresponding cells in Fig.8

上述兩組實(shí)驗(yàn)表明了該全息無透鏡顯微成像系統(tǒng)的成像能力，得到了圖像分辨率極限為4.4 μm和成像視野達(dá)24.5 mm2的成像結(jié)果，清晰地觀察到了實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞。但是受到孿生像的干擾，成像的清晰度和分辨率有待進(jìn)一步提高，這個(gè)問題在將來的研究中有望通過使用多距離相位恢復(fù)算法等手段得到解決。

4 結(jié) 論

本文基于全息無透鏡顯微成像的重建原理和自主搭建的無透鏡全息顯微成像光學(xué)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)美國空軍USAF1951分辨率測試靶和實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞的大視場顯微成像，成像視場為5.7 mm×4.3 mm，重建圖像的分辨率極限為4.4 μm。全息無透鏡顯微成像系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單、成像視場大，成像過程能夠數(shù)字化處理，結(jié)合數(shù)字圖像處理技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的高速成像，并進(jìn)行計(jì)數(shù)和識(shí)別，在發(fā)展高通量、自動(dòng)化的便攜式顯微成像設(shè)備方面有巨大的潛力。該技術(shù)未來可應(yīng)用在食品安全如病原性大腸桿菌檢測、水環(huán)境中致病微生物和顆粒物檢測及遠(yuǎn)程醫(yī)療等領(lǐng)域。