梁 琳，萬曉春，危 平，常 彬，向禮兵，朱琳琳，平 波

1.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；

2.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，其中宮頸鱗癌（squamous cell carcinoma，SCC）最多見，宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）為宮頸鱗癌的癌前病變。宮頸細(xì)胞學(xué)與高危型人乳頭狀瘤病毒（high-risk human papilloma virus，hrHPV）檢測是目前宮頸癌篩查的主要方法，雖然細(xì)胞學(xué)和hrHPV檢測分別有靈敏度和特異度相對較低的局限性。此外，上述聯(lián)合檢查在大規(guī)模人群篩查中成本高昂，反觀超80%的宮頸癌發(fā)生于發(fā)展中國家，20年來中國宮頸癌發(fā)病率和死亡率呈逐年升高趨勢［1］，中國宮頸癌篩查人群覆蓋率僅21.4%［2］。因此仍需尋找高性價比的新方法和篩查策略。

HPV與宮頸癌/癌前病變發(fā)生關(guān)系密切，其基因組中E6和E7為癌基因，二者的轉(zhuǎn)錄受HPVE2基因編碼蛋白抑制。轉(zhuǎn)錄因子FoxM1參與細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期調(diào)控，并在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Thierry等［3］和Pang等［4］分別在HPV16和HPV18陽性的細(xì)胞系中過表達(dá)HPV E2后發(fā)現(xiàn)FoxM1基因表達(dá)下降［3-4］。有報道在不同器官來源的細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)HPV E6有調(diào)節(jié)FoxM1基因和蛋白水平的功能，雖然此二項研究否定HPV E7對FoxM1表達(dá)有調(diào)控作用［5-6］，有證據(jù)表明，細(xì)胞系中改變HPV E7表達(dá)水平可調(diào)節(jié)FoxM1蛋白的表達(dá)［4，7-8］。免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）檢測已發(fā)現(xiàn)FoxM1蛋白可表達(dá)于人宮頸癌及其癌前病變組織，但很多IHC研究或未同時檢測HPV表達(dá)［9-15］，或僅檢測了少量病例的HPV16和18［16］，或?qū)oxM1蛋白的細(xì)胞質(zhì)和胞核表達(dá)混合評價，甚至不予區(qū)分［11，14，16-17］。因此，為發(fā)掘新的HPV感染狀態(tài)替代性標(biāo)志物，本研究驗證FoxM1蛋白在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)與HPV在體內(nèi)宮頸鱗狀上皮中表達(dá)的相關(guān)性，并檢測FoxM1基因下游主要以核蛋白形式參與細(xì)胞周期調(diào)控的Cdc25B的表達(dá)。

1 資料和方法

1.1 病例收集

經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核，收集來自復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科資料庫2007—2009年間宮頸活檢、錐切或全子宮切除石蠟包埋標(biāo)本。入組標(biāo)準(zhǔn)：①所有病例均無其他惡性腫瘤病史；② 正常（含炎癥）組織必須來源于既往無宮頸癌及CIN病史，且無細(xì)胞學(xué)異常病史的患者；③正?；駽IN患者經(jīng)過6個月隨訪，未出現(xiàn)更高級別病變者；④ 經(jīng)連續(xù)切片首尾張H-E染色保留鱗狀上皮（正常標(biāo)本）和病灶（CIN及以上標(biāo)本）；⑤ 提取DNA的內(nèi)參為陽性；⑥ 獲得患者或家屬簽署的知情同意書。

1.2 HPV DNA檢測

使用中國國家藥品監(jiān)督管理局（National Medical Products Administration，NMPA）認(rèn)證的聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）-反向點雜交法HPV基因分型檢測試劑盒［亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司］，按廠商說明對石蠟切片進(jìn)行檢測和結(jié)果判讀（圖1），可檢測23種HPV亞型，包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4、6、11、42、43和44。

圖1 PCR-反向點雜交法HPV基因分型檢測Fig.1 HPV genotyping by PCR-reverse dot blot

1.3 IHC檢測

石蠟包埋組織按3 μm厚度連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟至水。采用EnVision+兩步法和二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，一抗來源、抗原修復(fù)條件及稀釋濃度見表1，抗原修復(fù)液均為0.01 mol/L pH=6.0的枸櫞酸緩沖液，二抗及DAB均購自丹麥DAKO公司。

IHC結(jié)果陽性標(biāo)準(zhǔn)如下：

①FoxM1、Cdc25B和Ki-67：棕黃色顆粒著色于細(xì)胞核，鱗狀上皮自基底層向上，著色超出全層下1/3為陽性；② P16INK4a（P16）：棕黃色顆粒著色于細(xì)胞核或細(xì)胞核加細(xì)胞質(zhì)，鱗狀上皮自基底層向上，著色超出全層下1/3，并為連續(xù)且強的著色（彌漫塊狀著色）為陽性，局灶、斑片狀或單個細(xì)胞著色不計為陽性，僅有細(xì)胞質(zhì)著色不計為陽性［18］。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。通過Jonckheere-Terpstra檢驗分析指標(biāo)與病變程度之間關(guān)系；利用Spearman相關(guān)性分析評價指標(biāo)間相關(guān)性；構(gòu)建受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，計算曲線下面積（area under curve，AUC）及靈敏度和特異度，評價各指標(biāo)診斷效果。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 一抗來源、抗原修復(fù)條件及稀釋濃度Tab.1 Primary antibodies,antigen retrieval and dilution

2 結(jié)果

2.1 臨床病理學(xué)資料

符合入組條件病例共140例，包括正常組22例、CIN1組28例、CIN2/3組50例（CIN2和CIN3分別為3例和47例）、SCC組40例，CIN2+（CIN2/3和SCC）病例共90例?；颊吣挲g分布為22～75歲，中位和平均年齡分別為43和43.81歲。

2.2 HPV感染及IHC檢測結(jié)果在不同級別宮頸病變組織中的分布

對140例標(biāo)本的23種HPV基因型DNA檢測顯示HPV陽性率總計為82.86%（116/140）。將HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68定義為14種hrHPV型別，hrHPV陽性率為82.14%（115/140）。感染HPV16和18（HPV16/18）者共計103例。14種hrHPV及HPV16/18在正常組、CIN1、CIN2/3及SCC中的陽性率隨宮頸病變嚴(yán)重程度加劇而上升（Jonckheere-Terpstra檢驗，P均＜0.000 1，表2）。此外高危型中單一型別感染者75例，其中HPV16、18和其他型別感染分別為61例、3例和11例（包括5例HPV58，3例HPV33，HPV56、HPV52及HPV31各1例）。低危型HPV單一基因型感染僅1例，為HPV11感染。無任何HPV感染者24例。

細(xì)胞核中FoxM1和Cdc25B蛋白在不同級別宮頸病變中的典型表達(dá)圖像見圖2。兩者與Ki-67及P16的陽性率亦均隨宮頸病變程度加劇而上升（Jonckheere-Terpstra檢驗，P＜0.000 1，表2）。50%的CIN1病例FoxM1和Cdc25B陽性，P16和Ki-67陽性率亦分別高達(dá)35.71%和46.43%。CIN2+中FoxM1、Cdc25B、P16和Ki-67陽性率分別為100.00%（90/90）、94.44%（85/90）、85.56%（77/90）和97.78%（88/90），其中13例P16陰性者均為CIN2/3病例，F(xiàn)oxM1陽性率為100.00%（13/13）,CdC25B和Ki-67則均為92.31%（12/13）。聯(lián)合檢測P16與其他生物標(biāo)志物，P16和（或）其他標(biāo)志物陽性即為聯(lián)合標(biāo)志陽性，可見除SCC外，其他類別陽性率均較單獨檢測P16有不同程度的提高（表2）。

表2 140例宮頸組織中HPV DNA和IHC檢測結(jié)果分布Tab.2 Results of HPV DNA and immunohistochemical tests for 140 uterine cervical specimens［n (%)］

圖2 FoxM1、Cdc25B、P16和Ki-67在宮頸鱗狀上皮中的免疫組化染色Fig.2 Immunohistochemistry of FoxM1,Cdc25B,P16 and Ki-67 in uterine cervical squamous epithelium

2.3 細(xì)胞核FoxM1和Cdc25B蛋白水平與hrHPV感染、P16及Ki-67陽性率的相關(guān)性檢驗

采用Spearman相關(guān)性檢驗分析由64例僅有HPV16或僅有HPV18感染以及24例無任何HPV感染的病例構(gòu)成的病例組（HPV16或18，表3）。在此組88個病例中，HPV感染與細(xì)胞核FoxM1及Cdc25B蛋白水平均呈較好的相關(guān)性，Spearman相關(guān)系數(shù)（rho值）分別為0.842和0.757（P＜0.000 1，表4）。隨后對11例其他hrHPV單一型別感染及24例無任何HPV感染者構(gòu)成的病例組（其他型別）進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這些HPV類型的感染與細(xì)胞核FoxM1及Cdc25B蛋白表達(dá)亦有較強的相關(guān)性（P＜0.000 1，表3～4）。進(jìn)一步分析14種hrHPV單一及混合型別感染及無任何HPV感染者構(gòu)成的病例組（14種hrHPV），相關(guān)性依然存在（P＜0.000 1，表3～4）。此外，4種標(biāo)志物表達(dá)在相互之間也有較強相關(guān)性，尤其FoxM1與Ki-67和Cdc25B之間相關(guān)性最強，rho值分別高達(dá)0.909和0.840（P＜0.000 1，表5）。

2.4 IHC與hrHPV DNA檢測的診斷效果評價

包含F(xiàn)oxM1和14種hrHPV的單獨或聯(lián)合標(biāo)志的檢測靈敏度和陰性預(yù)測值（negative predicative value，NPV）均達(dá)100%，單獨P16檢測最低，靈敏度和NPV分別為為85.56%和75.47%，P16與其他標(biāo)志物的聯(lián)合檢測靈敏度和NPV均提高（98.89%～100.00%）。P16特異度為80.00%，高于其他單獨或聯(lián)合檢測（48.00%～72.00%，表6）。14種hrHPV及聯(lián)合P16檢測的AUC值最低，分別為0.750和0.740，其他標(biāo)志物AUC值范圍高達(dá)0.822～0.850（圖3，表6）。

表3 hrHPV感染情況Tab.3 hrHPV infection of the patients［n (%)］

表4 hrHPV感染與細(xì)胞核FoxM1和Cdc25B蛋白過表達(dá)的Spearman相關(guān)性檢驗Tab.4 Spearman’s correlation between hrHPV infection and nuclear expressions of FoxM1 and Cdc25B

表5 FoxM1、Cdc25B、Ki-67和P16蛋白水平的Spearman相關(guān)性檢驗Tab.5 Spearman’s correlation test for expressions of FoxM1,Cdc25B,Ki-67 and P16

圖3 宮頸標(biāo)本中各生物標(biāo)志物對CIN2+診斷效果的ROC曲線Fig.3 ROC curves for the performance of different biomarkers evaluating CIN2+in the uterine cervical specimens

表6 各生物指標(biāo)診斷CIN2+病變的效果Tab.6 Diagnostic performance of different biomarkers for CIN2+

3 討 論

轉(zhuǎn)錄因子FoxM1在細(xì)胞周期循環(huán)中對G1/S和G2/M轉(zhuǎn)換相關(guān)的重要基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，功能與細(xì)胞增殖高度相關(guān)，并涉及有絲分裂、凋亡、染色體分離及DNA損傷修復(fù)等多環(huán)節(jié)，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中具有重要地位［8］。細(xì)胞周期不同階段中，F(xiàn)oxM1蛋白在細(xì)胞質(zhì)之間穿梭，其進(jìn)入細(xì)胞核實施轉(zhuǎn)錄調(diào)控需要促有絲分裂信號刺激及Raf/MEK/MAPK通路活化［19-20］。有文獻(xiàn)［16］報道，宮頸癌的FoxM1蛋白水平與HPV感染無顯著相關(guān)性，然而該文對FoxM1蛋白的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核表達(dá)進(jìn)行了混合評分，且僅提供了HPV16和HPV18的感染狀況［16］，可能是導(dǎo)致結(jié)果差異的原因。

磷酸酶基因Cdc25B在細(xì)胞周期中是重要的G2/M轉(zhuǎn)換相關(guān)基因，受FoxM1轉(zhuǎn)錄活化［21］，有報道Cdc25B基因水平可因過表達(dá)HPV E2而被抑制或因過表達(dá)E7而被上調(diào)，且HPV16 E7被招募到Cdc25B基因啟動子區(qū)域［4］。本研究對宮頸組織中Cdc25B核蛋白進(jìn)行了IHC檢測，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)不僅與細(xì)胞核FoxM1蛋白表達(dá)相關(guān)，也與HPV感染具有相關(guān)性，與體外研究結(jié)果相符。

由于體外HPV對FoxM1和Cdc25B的調(diào)控研究主要經(jīng)表達(dá)或敲除HPV16或HPV18 E6/E7的方法，而人宮頸組織中感染HPV的基因型多樣，并可為單一或多型別感染，我們著意分析了HPV16和18以外的hrHPV單一型別感染是否有類似相關(guān)性。雖然病例數(shù)較少，但在11例其他hrHPV單一型別感染（包括5例HPV58，3例HPV33，HPV56、HPV52及HPV31各1例）及24例無任何HPV感染者構(gòu)成的病例組中，依然可見這些型別感染與細(xì)胞核FoxM1及Cdc25B蛋白表達(dá)有較強的相關(guān)性，Spearman相關(guān)系數(shù)分別為0.867和0.937，要考慮不同型別的hrHPV均可能有上述調(diào)控作用。

FoxM1和Cdc25B的IHC判斷標(biāo)準(zhǔn)中，關(guān)于“鱗狀上皮自基底層向上，著色超出全層下1/3為陽性”的要求考慮了HPV E6/E7蛋白在鱗狀上皮黏膜層空間分布的特點，即自基底層至顆粒層表達(dá)漸增高［22］。對于診斷CIN2+，4個IHC標(biāo)志物特異度和AUC值均高于14種hrHPV DNA檢測，可能一方面它們比臨床最常使用的HPV DNA檢測更能體現(xiàn)HPV致癌基因E6/E7的功能狀態(tài)，另一方面宮頸癌及其癌前病變發(fā)病機制中可能存在hrHPV感染以外的其他促腫瘤發(fā)生、發(fā)展的因素，并調(diào)控了這些蛋白的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)oxM1、Cdc25B與P16及Ki-67均具相關(guān)性，尤其FoxM1與Ki-67的相關(guān)系數(shù)最高，達(dá)0.909（P＜0.000 1），且判斷CIN2+的靈敏度、特異度和AUC等數(shù)據(jù)都非常相近，提示細(xì)胞核FoxM1蛋白表達(dá)可能是與Ki-67相仿的細(xì)胞增殖標(biāo)志物，與其生物學(xué)功能符合。Meta分析結(jié)果顯示，P16在CIN2和CIN3的陽性率分別為68%和82%［23］，本研究CIN2/3中P16陽性率為74%（37/50），與之相仿。P16聯(lián)合其他標(biāo)志物后診斷CIN2+靈敏度和NPV均提高。4種蛋白在宮頸CIN和SCC中過表達(dá)可能機制兼具共性及差異，由此聯(lián)合IHC檢測可能彌補P16對CIN2/3確診率的問題。文獻(xiàn)報道，至少1/3的CIN1中P16呈陽性［18，23］。目前組織學(xué)標(biāo)本中并不推薦P16單獨使用，可用于輔助CIN2/3及其形態(tài)學(xué)改變相似者的鑒別診斷，而非形態(tài)學(xué)上明確的正常、CIN1或CIN3病變［18］。故細(xì)胞核內(nèi)FoxM1和Cdc25B蛋白檢測結(jié)果應(yīng)同樣需結(jié)合形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。

綜上所述，人宮頸鱗狀上皮中細(xì)胞核FoxM1和Cdc25B蛋白水平與hrHPV感染相關(guān)，有望作為診斷與鑒別診斷CIN2+的潛在輔助指標(biāo)，其實際臨床應(yīng)用價值仍有待更大樣本量臨床試驗的驗證。