王曉棟，周丹丹，張麗萍，鄭 荃，牟青杰，尹崇高，李洪利

1.濰坊醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東 濰坊 261053；

2.濰坊醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，山東 濰坊 261053；

3.濰坊醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，山東 濰坊 261053；

4.濰坊醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，山東 濰坊 261053；

5.濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究實驗中心，山東 濰坊 261053

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占所有肺癌的85%，其較常見的兩種亞型是肺腺癌和肺鱗癌［1］。肺腺癌是NSCLC中最常見的亞型，平均5年生存率為15%。隨著化療新藥以及分子靶向治療藥物的不斷出現(xiàn)，肺腺癌的藥物治療取得了較大進(jìn)展，肺腺癌患者的5年生存率從4.5%提高到了5.5%，但是由于腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性及腫瘤患者耐藥性等因素，轉(zhuǎn)移性肺腺癌的治療現(xiàn)仍有諸多問題尚待解決［2］。

序列相似性為83的家族成員A（family with sequence similarity 83 member A，F(xiàn)AM83A）基因又稱BJ-TSA-9，位于8q24染色體上，最初通過生物信息學(xué)方法被鑒定為一個潛在的腫瘤基因。先前研究報道，F(xiàn)AM83A在多種腫瘤中起著促癌作用［3］：Lee等［4］證明，過表達(dá)FAM83A時會產(chǎn)生表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）耐藥性，且與乳腺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)［5］。因此本研究采用生物信息學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)庫分析后挑選與肺腺癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因進(jìn)行研究，旨在為臨床抑制肺腺癌侵襲轉(zhuǎn)移提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

胎牛血清、F-12K培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基購自美國HyClone公司，LipofectamineTM2000 Reagent購自美國Invitrogen公司，鼠抗人β-actin單抗與兔抗人FAM83A單抗購自英國Abcam公司，質(zhì)粒均由上海吉凱基因科技有限公司設(shè)計合成，transwell小室購自美國Corning公司，細(xì)胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）購自英國Abcam公司。正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B及肺腺癌細(xì)胞A549均由本實驗室保存，并通過細(xì)胞鑒定。

1.2 利用人類蛋白質(zhì)圖譜（Human Protein Atlas，HPA）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行與肺腺癌預(yù)后的相關(guān)性的分析

HPA數(shù)據(jù)庫（https://www.proteinatlas.org）是基于RNA測序分析和免疫組織化學(xué)分析的大型轉(zhuǎn)錄組和蛋白組數(shù)據(jù)庫，可用于正常組織和腫瘤組織蛋白差異表達(dá)分析［6］。本研究使用HPA數(shù)據(jù)庫找到基因在正常組織和腫瘤組織中的表達(dá)情況，然后再選取表達(dá)差異高且與預(yù)后相關(guān)的基因進(jìn)行研究，分析其表達(dá)與肺腺癌預(yù)后的相關(guān)性。

1.3 利用基因表達(dá)譜動態(tài)分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行FAM83A的表達(dá)與肺腺癌患者生存期關(guān)系的分析

GEPIA數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html）是由北京大學(xué)新開發(fā)的一種交互式網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，用于分析來自癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和基因型-組織表達(dá)（Genotype-Tissue Expression，GTEx）項目的9 736個腫瘤和8 587個正常樣本的RNA測序表達(dá)數(shù)據(jù)。GEPIA提供關(guān)鍵的交互式和可定制功能，包括差異表達(dá)分析、分析繪圖、相關(guān)分析、患者生存分析、類似基因檢測和降維分析［7］。運用GEPIA數(shù)據(jù)庫研究FAM83A的表達(dá)與肺腺癌患者生存期的關(guān)系。

1.4 利用UALCAN數(shù)據(jù)庫進(jìn)行FAM83A的mRNA水平在肺腺癌與正常肺腺組織表達(dá)差異性的分析

UALCAN數(shù)據(jù)庫（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）使用來自31種癌癥類型的TCGA 3級RNA-seq和臨床數(shù)據(jù)，根據(jù)個體癌癥分期、腫瘤分級、種族、體質(zhì)量來分析腫瘤組織和正常組織樣本以及各種腫瘤亞組中查詢基因的相對表達(dá)或其他臨床病理學(xué)特征，估計基因表達(dá)水平和臨床病理學(xué)特征對患者生存的影響［8］。本研究運用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析FAM83A的mRNA水平在肺腺癌與正常肺腺組織中表達(dá)的差異性。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人肺腺癌細(xì)胞A549和人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B分別培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的F-12K培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待其生長至對數(shù)期，鋪到6孔板中，培養(yǎng)24 h后再進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞分為3組：

①A549組：常規(guī)培養(yǎng)，不做任何處理；② A549/Scr組：轉(zhuǎn)入空載質(zhì)粒；③A549/siFAM83A組：轉(zhuǎn)入FAM83A敲減質(zhì)粒。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測

由各組細(xì)胞抽提總蛋白質(zhì)，各組蛋白質(zhì)樣品經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉1 h后敷一抗4 ℃過夜，再經(jīng)洗膜3次，常溫敷二抗1 h后，洗膜3次并曝光。所用抗體濃度如下：β-actin（1∶1 000）、FAM83A（1∶500）。結(jié)果使用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，實驗重復(fù)3次。

1.7 CCK-8細(xì)胞增殖實驗

取各組細(xì)胞2×103個，接種于96孔板中置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，向每孔加入10 μL CCK-8溶液。將96孔板在培養(yǎng)箱內(nèi)溫育4 h，酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度（D）值。以各組的D值測定細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h細(xì)胞增殖能力的變化。

1.8 Transwell侵襲實驗

將轉(zhuǎn)染后的150 μL（4×105個/mL）細(xì)胞懸液添加到已加入基質(zhì)膠的transwell小室上室中，下室加入含有20%胎牛血清的培養(yǎng)基，放入37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。24 h后用4%多聚甲醛固定20 min，Giemsa染液染色3 5 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）清洗3次，棄PBS后于顯微鏡下隨機選取5個良好視野拍照計數(shù)，取平均值為transwell侵襲實驗的最終結(jié)果。所有實驗均獨立重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 FAM83A為與肺腺癌預(yù)后相關(guān)的基因

本研究中我們先運用HPA數(shù)據(jù)庫分析與肺癌預(yù)后相關(guān)的基因，篩選出與肺癌不良預(yù)后相關(guān)的基因354個，與肺癌良好預(yù)后相關(guān)的基因297個（圖1A）。根據(jù)P值的大小進(jìn)行排序，選取肺癌中P值最小的FAM83A（圖1B）。利用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析FAM83A在肺腺癌亞型中的表達(dá)情況，通過對483例肺腺癌組織和347例正常肺上皮組織的比較分析，發(fā)現(xiàn)FAM83A在肺腺癌組織中高表達(dá)（圖1C），所以我們選擇FAM83A為目的基因進(jìn)行后續(xù)的研究。

圖1 HPA和GEPIA數(shù)據(jù)庫找出與肺腺癌預(yù)后相關(guān)的基因Fig.1 The HPA and GEPIA databases identified genes associated with the prognosis of lung adenocarcinoma

2.2 FAM83A高表達(dá)的肺腺癌患者生存率低

運用UALCAN數(shù)據(jù)庫檢測FAM83A的表達(dá)與肺腺癌患者生存率的關(guān)系，對502例（高表達(dá)患者125例，低表達(dá)患者377例）肺腺癌患者進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，高表達(dá)FAM83A與肺腺癌患者的不良預(yù)后有關(guān)（P＜0.000 1，圖2A）。運用GEPIA數(shù)據(jù)檢測FAM83A的表達(dá)量與肺腺癌患者生存率之間的關(guān)系，對478例（高表達(dá)患者239例，低表達(dá)患者239例）肺腺癌患者進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，高表達(dá)FAM83A與肺腺癌患者的不良預(yù)后有關(guān)（P=0.000 3，圖2B）。結(jié)果均顯示，高表達(dá)FAM83A的肺腺癌患者生存率較低。

2.3 FAM83A在肺腺癌組織中表達(dá)高且與肺腺癌的分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)

圖2 UALCAN和GEPIA數(shù)據(jù)庫檢測FAM83A的表達(dá)對患者生存率的影響Fig.2 UALCAN and GEPIA databases were used to detect the effect of FAM83A expression on patients’ survival

運用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析正常肺上皮組織（59例）和肺腺癌組織（515例）中FAM83A的表達(dá)，結(jié)果顯示，肺腺癌組織中FAM83A的表達(dá)量明顯高于正常肺上皮組織（圖3A）。與正常肺腺組織（59例）相比，F(xiàn)AM83A在1級（277例）、2級（125例）、3級（85例）和4級（28例）的肺腺癌患者中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，在1級和3級，2級和3級的肺腺癌患者中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，在其他分級中表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖3B）。與正常肺腺組織（59例）相比，F(xiàn)AM83A的表達(dá)在男性（238例）或女性乳腺癌組織（276例）中的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），F(xiàn)AM83A在性別上的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖3C，P＞0.05）。基于FAM83A的表達(dá)對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，N0（331例）、N1（96例）、N2（74例）組與59例正常肺上皮組織相比，N0和N2，N1和N2組相比FAM83A的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。N0和N1，N0和N3，N1和N3，N2和N3組相比，F(xiàn)AM83A的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖3D，P＞0.05）。結(jié)果顯示，肺腺癌組織中FAM83A的表達(dá)高與肺腺癌分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

圖3 UALCAN數(shù)據(jù)庫分析FAM83A在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)Fig.3 UALCAN database analysis of FAM83A expression in lung adenocarcinoma cells

2.4 FAM83A在肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中高表達(dá)

Western blot檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)AM83A在肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中的表達(dá)量顯著高于人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B。轉(zhuǎn)染 24 h后，低溫提取對照組及敲減組細(xì)胞總蛋白質(zhì)，采用Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率，與對照組細(xì)胞A549/Scr相比，敲減組細(xì)胞A549/siFAM83A中FAM83A的表達(dá)量顯著降低（圖4），結(jié)果表明，敲減質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功（P＜0.05）。

圖4 Western blot檢測FAM83A的表達(dá)并檢測轉(zhuǎn)染效率Fig.4 Western blot was used to detect the expression of FAM83A and the transfection efficiency

2.5 敲減FAM83A抑制了肺腺癌細(xì)胞的增殖

CCK-8檢測結(jié)果顯示，72 h之后A549/siFAM83A組與A549/Scr組相比，細(xì)胞的增殖能力明顯降低（P＜0.05，圖5）。

圖5 CCK-8檢測FAM83A對肺腺癌細(xì)胞增殖能力的影響Fig.5 CCK-8 was used to detect the effect of FAM83A on the proliferation of lung adenocarcinoma cells

2.6 FAM83A在腺癌細(xì)胞中表達(dá)增高且促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的侵襲能力

Trans well侵襲實驗結(jié)果顯示，A549/siFAM83A組穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)明顯少于A549/Scr組（圖6）。實驗證明敲減FAM83A能降低肺腺癌細(xì)胞的侵襲，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖6 Transwell侵襲實驗檢測FAM83A對肺腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響Fig.6 Transwell invasion assay detected the effect of FAM83A on the invasion ability of lung adenocarcinoma cells

3 討 論

晚期NSCLC的5年生存率低至5%～15%［9］。在肺腺癌新型化療藥物及免疫治療取得重大突破之前，急需尋找新的治療靶點，為肺腺癌的靶向治療提供更多線索。有研究［10-11］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM83家族成員A、B和D最近被證明具有致癌潛力，F(xiàn)AM83A的表達(dá)也與腫瘤的生長速度相關(guān)，在NSCLC中的表達(dá)受環(huán)狀RNA調(diào)控，內(nèi)源性FAM83A基因的表達(dá)和DNA拷貝數(shù)增加，使存活的腫瘤細(xì)胞對治療產(chǎn)生耐藥性。

有研究［12］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM83家族基因?qū)Χ喾N癌癥都有著促進(jìn)作用，在乳腺上皮細(xì)胞中FAM83蛋白的功能與RAS相似，能驅(qū)動PI3K和MAPK信號的激活，F(xiàn)AM83D可以促進(jìn)MCF-10A正常乳腺上皮細(xì)胞系的增殖和遷移，還可以激活MEK/ERK信號通路從而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［13］。FAM83A最初被確定為腫瘤特異性生物標(biāo)志物，并在近一半的肺癌組織樣本中高表達(dá)，有研究［14］報道，F(xiàn)AM83A通過ERK和PI3K/Akt/mTOR信號通路促進(jìn)肺腺癌的進(jìn)展。Zheng等［15］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM83A通過調(diào)控Wnt和Hippo信號通路和EMT過程，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，且FAM83A在肺癌中高表達(dá)，并與晚期TNM分期和不良預(yù)后相關(guān)，這也與本研究結(jié)果一致。本研究通過TCGA數(shù)據(jù)分析了FAM83A的表達(dá)與肺腺癌患者的預(yù)后、生存率、肺腺癌分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)FAM83A在肺腺癌組織及細(xì)胞中高表達(dá)，F(xiàn)AM83A高表達(dá)的肺腺癌患者生存率低，且FAM83A高表達(dá)與肺腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期顯著相關(guān)。有研究［16］證明，肺腺癌晚期腫瘤（Ⅲ～Ⅳ期）的FAM83A表達(dá)水平高于肺腺癌早期腫瘤（Ⅰ～Ⅱ期），這和本研究中FAM83A的表達(dá)與肺腺癌的分期相關(guān)相符合。以上分析均提示FAM83A能作為一個癌基因影響肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展。我們通過Western blot、CCK-8、transwell細(xì)胞實驗進(jìn)行進(jìn)一步的驗證，發(fā)現(xiàn)FAM83A在肺腺癌細(xì)胞系中高表達(dá)，且FAM83A可以促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，本實驗結(jié)果與TCGA數(shù)據(jù)庫中FAM83A的預(yù)測結(jié)果相符。結(jié)合前人以及我們對FAM83A的研究，提示FAM83A可能作為肺腺癌的潛在生物標(biāo)志物。

綜上所述，F(xiàn)AM83A在肺腺癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)并與肺腺癌的不良預(yù)后有關(guān)，且FAM83A可促進(jìn)肺腺癌的增殖和侵襲。