谷冬華，郭 寧，趙曉丹，劉 瑾，李 昂，茍建重

牙周炎可引起牙齦炎癥、牙槽骨吸收，最終導(dǎo)致牙齒的松動(dòng)和脫落，是造成成年人牙齒喪失的主要原因[1]。而口腔內(nèi)的細(xì)菌菌斑作為牙周炎發(fā)病的始動(dòng)因子，可誘發(fā)早期的炎癥反應(yīng)過程，宿主的防御反應(yīng)會進(jìn)一步促進(jìn)牙周結(jié)締組織的破壞和牙槽骨吸收[2-3]。在防治牙周炎的藥物研究中，中藥以其不良反應(yīng)小、多靶點(diǎn)受到關(guān)注；中藥配方以辨證為前提，致病機(jī)制為關(guān)鍵，藥物的藥理特性為基礎(chǔ)，遵循“君臣左使”的原則進(jìn)行配伍，達(dá)到減毒增效的作用。大黃作為常用的寒下藥，適應(yīng)證廣、療效明確、毒副作用小而被廣泛用于多種疾病的治療，已有研究發(fā)現(xiàn)大黃提取物可以通過影響炎癥因子的分泌和酶活性調(diào)整牙周組織免疫激活的后續(xù)環(huán)節(jié)[4],還可以抑制牙槽骨吸收[5]，促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[6]，從而達(dá)到抗菌消炎、促進(jìn)骨質(zhì)再生的藥理作用[7]。黃芩提取物可促進(jìn)堿性磷酸酶產(chǎn)生，刺激細(xì)胞成骨轉(zhuǎn)化[8]；還可引起RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞數(shù)量減少，炎性因子下降，從而使牙槽骨喪失減緩或停止，達(dá)到減輕牙周炎癥的效果[9]。

前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)是花生四烯酸的代謝物，它是炎癥誘導(dǎo)骨吸收的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。在牙周炎的病理發(fā)展過程中，PGE2可作為一種重要的炎癥介質(zhì)參與其中：在炎性牙齦組織和齦溝液中，PGE2會顯著增加。同時(shí)，PGE2也是一種重要的刺激骨吸收的因子，研究表明牙周組織的破壞與高水平的PGE2密切相關(guān)[10]。Georgios等比較研究了齦上菌斑和齦下菌斑對人牙齦成纖維細(xì)胞產(chǎn)生PGE2的影響，其可以成為牙周局部組織破壞的誘導(dǎo)劑[11]，且PGE2的破骨效應(yīng)與RANKL-OPG系統(tǒng)有關(guān)。

C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)作為細(xì)菌感染和嚴(yán)重組織損傷的診斷指標(biāo)之一，在一些急慢性炎癥性疾病(如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等)、心肌梗死、組織損傷、感染及腫瘤等疾病中，其水平可有明顯升高；CRP還可作為手術(shù)感染及并發(fā)癥的指標(biāo)，當(dāng)術(shù)后CRP水平不降低或者再次升高時(shí)就提示有并發(fā)感染或血栓栓塞的可能；在大多數(shù)細(xì)菌性感染中，血清CRP的水平會升高，而多數(shù)病毒性感染則不升高，因此CRP還可作為兩者的鑒別診斷指標(biāo)；CRP不僅是心血管疾病的警報(bào)器，在牙周炎患者中也觀察到有明顯的升高[12]。Maekawa等[13]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)牙周局部感染引起CRP升高可能是牙周局部炎癥的致病機(jī)制之一，并且在一定的程度上，牙周局部的CRP還能潛在調(diào)節(jié)肝外CRP產(chǎn)生的系統(tǒng)性CRP水平。

本實(shí)驗(yàn)在成功建立SD大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，采用局部注射單獨(dú)或者配伍的大黃、黃芩有效部位藥物，觀察對大鼠齦溝液、唾液及血液中PGE2和血液中CRP炎性因子含量的抑制作用及促進(jìn)骨組織再生的影響，為進(jìn)一步將大黃、黃芩聯(lián)用藥物用于臨床治療牙周炎提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑

大黃有效部位(質(zhì)控指標(biāo)成分大黃素含量30%)、黃芩有效部位(質(zhì)控指標(biāo)成分黃芩素含量80%)均購自陜西飛達(dá)生物有限公司，使用時(shí)用滅菌水配判成13 mg/L濃度的大黃有效部位和5 mg/L濃度的黃芩有效部位進(jìn)行局部注射治療；戊巴比妥鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；PGE2、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)的ELISA試劑盒(美國R&D公司)；超純水儀(Milipore,法國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

100只3個(gè)月齡SD大鼠，清潔級，雄性，牙列完整，無齲壞及牙周病，體質(zhì)量(170±10)g(由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。所有大鼠均可自由飲水，分籠飼養(yǎng)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院倫理委員會審核并批準(zhǔn)。

1.3 SD大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎動(dòng)物模型的建立與分組

所有大鼠先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，用復(fù)方新諾明混懸液(2%)代替日常飲水預(yù)處理1周，再換回正常飲水1周。按照體質(zhì)量對等原則隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組(Sham組)、牙周炎組(P組)、大黃有效部位組(DH)、黃芩有效部位組(HQ)和大黃、黃芩配伍藥組(DH+HQ)，每組20只。

假手術(shù)組僅在麻醉后在雙側(cè)上頜第二磨牙腭側(cè)牙齦溝底注射20 μL無菌PBS，并涂100 μL的PBS溶液建模；其余各組在雙側(cè)上頜第二磨牙腭側(cè)牙齦溝底注射牙齦卟啉單胞菌(Porphyromanusgingivalis,P.g, W83，購于首都醫(yī)科大學(xué))菌液20 μL(2×1010CFU/mL)，并使用結(jié)扎絲線結(jié)扎牙頸部，然后于結(jié)扎絲線處涂抹100 μL菌液(1.5×109CFU/mL)。每隔2天重復(fù)1次，共4次。建模后8周，各組SD大鼠拆除結(jié)扎絲開始進(jìn)行局部藥物治療。參照課題組前期實(shí)驗(yàn)獲得的藥物有效濃度，采用13 mg/L濃度的大黃有效部位和5 mg/L濃度的黃芩有效部位單獨(dú)以及配伍進(jìn)行局部注射處理；假手術(shù)組和牙周炎組給予局部注射等量生理鹽水，連續(xù)藥物治療4周。建模期間，所有大鼠均飼以軟食。

1.4 SD大鼠牙周組織病理形態(tài)學(xué)觀察

SD大鼠下頜骨病理形態(tài)學(xué)觀察，建模8周后取SD大鼠左側(cè)下頜骨磨牙段立即放入4%的多聚甲醛內(nèi)固定48 h后取出，100 g/L EDTA脫鈣3周，常規(guī)石蠟包埋，沿下頜正中冠狀斷面切成5 μm厚的連續(xù)切片，HE染色后于光鏡下觀察、照相。

1.5 ELISA法檢測唾液、齦溝液和血液中的PGE2含量及血液中的CRP含量

各組大鼠連續(xù)局部藥物治療4周后，腹腔注射麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，3 500 r/min離心15 min，取血清；用濾紙條取大鼠口腔內(nèi)唾液和雙側(cè)上頜第二磨牙頰舌側(cè)齦溝液，所有標(biāo)本于-70 ℃保存。測定前將樣本和試劑盒取出，室溫下解凍30 min，用ELISA試劑盒檢測大鼠齦溝液、唾液及血清PGE2水平和血液CRP水平。具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行[14]。

1.6 SD大鼠骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)的測量

各組大鼠下頜骨磨牙段常規(guī)制片[15]，采用Micro CT對骨組織進(jìn)行拍照，再利用Motic微機(jī)圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行骨組織形態(tài)學(xué)各參數(shù)的測量：在光鏡下采集下頜最后一個(gè)磨牙根部遠(yuǎn)中松質(zhì)骨圖像，依照等距隨機(jī)抽樣原則，同一標(biāo)本選3張切片，每張切片選3個(gè)觀察視野。用MoticMed6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對上面所得圖像進(jìn)行骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)相關(guān)參數(shù)測定[16]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組SD大鼠組織病理形態(tài)學(xué)觀察

建立大鼠牙周炎模型之后，采用不同的藥物進(jìn)行治療4周，大鼠上頜第二磨牙組織病理學(xué)觀察可見：DH組大鼠牙槽骨可見有少量破骨細(xì)胞和骨吸收陷窩(圖1A)，HQ組可見有少量成骨細(xì)胞形成(圖1B)，DH+HQ配伍組成骨細(xì)胞比單獨(dú)的HQ組明顯增多(圖1C)，P組牙齦結(jié)合上皮與牙槽骨分離，牙槽嵴頂位于根中1/2，并且參差不齊，根分叉處有明顯的骨吸收區(qū)，破骨細(xì)胞及單核細(xì)胞增多(圖1D)；Sham組牙齦結(jié)合上皮底位于釉牙骨質(zhì)界處，牙槽嵴頂和根分叉處牙槽骨形態(tài)和高度正常，未見破骨細(xì)胞及單核細(xì)胞(圖1E)。

A:DH組：牙槽骨可見有少量骨吸收陷窩和破骨細(xì)胞( ×40)；B:HQ組：可見有少量成骨細(xì)胞形成( ×40)；C:DH+HQ組：相對單獨(dú)HQ治療組有大量成骨細(xì)胞產(chǎn)生( ×40)；D:P組：牙齦結(jié)合上皮與牙槽骨分離，牙槽嵴頂位于根中1/2，并且參差不齊，根分叉處有明顯的骨吸收區(qū)，破骨細(xì)胞及單核細(xì)胞增多( ×4)；E:Sham組：牙齦位置，牙槽骨高度正常，未見牙槽骨吸收和炎性細(xì)胞( ×4)(均為藍(lán)色箭頭示)

2.2 各組SD大鼠齦溝液、唾液和血液中PGE2含量比較

SD大鼠經(jīng)過不同分組的藥物進(jìn)行局部治療4周后，利用ELISA試劑盒測定各組SD大鼠的PGE2含量，經(jīng)過K-S檢驗(yàn)提示符合正態(tài)分布，方差分析結(jié)果提示總體有差異(P<0.05)，兩兩比較結(jié)果顯示，牙周炎組(P組)大鼠齦溝液、唾液及血液中的PGE2水平顯著高于假手術(shù)組(Sham組)(P<0.05)，說明建立牙周炎模型后SD大鼠體內(nèi)炎癥因子PGE2水平顯著上升；而經(jīng)過大黃、黃芩有效部位單獨(dú)和配伍組局部用藥可明顯降低SD大鼠齦溝液、唾液以及血液中的PGE2水平：DH和HQ單獨(dú)用藥組的齦溝液、血液中PGE2含量仍然高于Sham組(P<0.05)，唾液中PGE2含量和Sham組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而DH+HQ配伍組的齦溝液、唾液和血液中PGE2含量和Sham組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；和P組比較：DH和HQ單獨(dú)組只有唾液中的PGE2含量顯著下降，齦溝液和血液中的PGE2含量無明顯差異；DH+HQ配伍組的齦溝液、唾液和血液中PGE2含量均明顯低于牙周炎組，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(表1)。

表1 SD大鼠齦溝液、唾液和血液中的PGE2含量比較

2.3 各組SD大鼠血液中CRP含量比較

SD大鼠經(jīng)過不同分組的藥物進(jìn)行局部治療4周后，利用ELISA試劑盒測定各組SD大鼠血液中的CRP含量，結(jié)果經(jīng)過K-S檢驗(yàn)提示符合正態(tài)分布，經(jīng)方差分析提示總體有差異(P<0.05)，LSD-t法組間兩兩比較結(jié)果顯示：相對于Sham組，P組大鼠血液中的CRP含量明顯升高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；藥物治療后雖然DH、HQ單獨(dú)和DH+HQ聯(lián)用組的CRP含量相較于P組均有所下降，但是只有DH+HQ聯(lián)用組的下降和P組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；DH+HQ聯(lián)用組和Sham組無明顯差異，DH、HQ單獨(dú)藥物組和Sham組有明顯差異(表2)。

表2 SD大鼠血液中的CRP含量比較

2.4 SD大鼠形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)的比較

各組SD大鼠建模后再經(jīng)過藥物治療4周后，上頜第二磨牙的Micro CT圖像如圖2所示:DH藥物治療4周可見根分叉有少量骨質(zhì)再生(圖2A)；經(jīng)HQ藥物治療組可見根分叉骨再生優(yōu)于DH治療組(圖2B)；DH+HQ藥物聯(lián)用組的根分叉有大量骨再生，優(yōu)于單獨(dú)用DH和HQ組(圖2C)；P組的根分叉只有極少量骨再生(圖2D)；Sham組的根分叉區(qū)骨質(zhì)未見明顯吸收(圖2E)。骨組織形態(tài)學(xué)各參數(shù)經(jīng)過K-S檢驗(yàn)提示符合正態(tài)分布，經(jīng)方差分析提示總體有差異(P<0.05)，LSD-t法組間兩兩比較結(jié)果顯示：相對于Sham組，P組大鼠的骨小梁各參數(shù)均有明顯下降，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；藥物治療后僅DH+HQ聯(lián)用組的骨組織形態(tài)學(xué)各參數(shù)相比較P組有明顯差異(P<0.05)：相對骨體積(BV/TV)、骨表面積體積比(BSA/BV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)比P組明顯升高，骨小梁間隙(Tb.Sp)和骨小梁模型因子(Tb.Pf)明顯降低；和假手術(shù)組均無明顯差異(表3)。

A:DH組：根分叉可見少量骨再生；B:HQ組：根分叉部分骨再生多于DH組；C:DH+HQ聯(lián)用組：根分叉大量骨再生，優(yōu)于單獨(dú)使用DH和HQ組；D:P組：根分叉有極少量骨再生；E:Sham組：根分叉區(qū)骨質(zhì)未見明顯吸收

表3 各組藥物局部治療4周后SD大鼠骨小梁參數(shù)比較

3 討 論

牙周病的細(xì)菌學(xué)研究證明，牙周病是由細(xì)菌感染所致，特別是革蘭陰性厭氧桿菌，如牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌和具核梭桿菌[17-18]。中藥藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，大黃的有效成分為蒽醌類衍生物(如大黃素、大黃酸、大黃酚等大部分與葡萄糖結(jié)合為苷的結(jié)合狀態(tài))[19]，可以針對常見牙周致病菌發(fā)揮明顯抑菌作用，其作用機(jī)制可能是干擾厭氧菌細(xì)胞壁的形成；還可通過降低毛細(xì)血管通透性，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，消除自由基和保護(hù)細(xì)胞功能，同時(shí)能夠顯著抑制內(nèi)毒素激發(fā)的巨噬細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高，抑制前列腺素、白細(xì)胞介素的產(chǎn)生，從而抑制巨噬細(xì)胞脂類炎性介質(zhì)活化過程，達(dá)到抑制炎癥介質(zhì)發(fā)揮抗炎作用[20]。黃芩中可提取出黃芩素、黃芩苷等黃酮類的有效成分，具有促進(jìn)牙周膜細(xì)胞增殖、增加細(xì)胞總蛋白和膠原含量，抗細(xì)胞粘附作用來保護(hù)細(xì)胞功能[21]，清除氧自由基、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等多方面的功能[22]；還可以通過降低牙周炎大鼠牙齦組織中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9, MMP-9)和白細(xì)胞介素6(interleukin 6, IL-6)的mRNA的表達(dá)含量[23]，聯(lián)用其他藥物抑制脂多糖、炎癥因子PGE2的合成，來改善大鼠牙周組織狀況[24]；同時(shí)黃芩水煎劑和水浸膏還可以有效抑制牙周可疑致病菌的生長，抑制牙槽骨吸收[25]。本實(shí)驗(yàn)基于課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用不同濃度的大黃、黃芩有效部位對人牙周膜細(xì)胞增殖活性和產(chǎn)生炎性因子PGE2的影響，選擇13 mg/L濃度的大黃有效部位和5 mg/L濃度的黃芩有效部位單獨(dú)或者配伍治療SD大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎動(dòng)物模型，觀察其組織病理學(xué)、炎性因子PGE2和CRP含量和牙槽骨再生的情況。

牙周炎的癥狀主要包括牙齦炎癥，牙周袋的形成，牙槽骨喪失及牙齒的松動(dòng)甚至脫落。在本次研究中，假手術(shù)組(Sham組)牙槽骨未見骨質(zhì)吸收和破骨細(xì)胞(圖1 E)；而通過結(jié)扎絲和細(xì)菌涂抹的方式建立實(shí)驗(yàn)性牙周炎動(dòng)物模型后，對建模后的牙周炎大鼠(P組)進(jìn)行了組織病理學(xué)觀察，可見其牙齦溝底結(jié)合上皮與牙面分離，根分叉區(qū)可見到牙槽骨表面成排的破骨細(xì)胞形成，骨表面參差不齊(圖1 D)，證實(shí)本次實(shí)驗(yàn)建立的模型符合牙周炎的要求；經(jīng)過DH、HQ或者DH+HQ配伍藥物組治療后，可見不同組的大鼠牙槽骨出現(xiàn)不同數(shù)量的破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，DH+HQ聯(lián)用組的成骨細(xì)胞形成最多，有更好的成骨效應(yīng)(圖1 A,B,C)。

本實(shí)驗(yàn)通過對SD大鼠齦溝液、唾液和血液中的PGE2含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可見P組大鼠齦溝液、唾液及血液中的PGE2水平顯著高于Sham組(P<0.05)，說明建立牙周炎模型后SD大鼠體內(nèi)炎癥因子PGE2水平顯著增加；而經(jīng)過大黃、黃芩有效部位單獨(dú)和配伍組局部用藥后可明顯降低PGE2水平，且DH+HQ配伍組的齦溝液、唾液和血液中PGE2含量和Sham組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而和P組比較齦溝液、唾液和血液中PGE2含量均明顯低于牙周炎組，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0. 05)(見表1)，這說明大黃、黃芩藥物對實(shí)驗(yàn)性牙周炎動(dòng)物牙周組織產(chǎn)生PGE2有抑制作用，且配伍聯(lián)用組對牙周炎PGE2產(chǎn)生的抑制作用最明顯。通過分析血液中CRP的含量結(jié)果說明：牙周炎建模成功后P組大鼠的CRP含量明顯高于Sham組，說明其炎癥顯著，而經(jīng)過不同組的藥物治療后雖然都比P組降低，但只有DH+HQ聯(lián)用組的下降與P組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明聯(lián)用組消炎效果是優(yōu)于單獨(dú)藥物組的。

Micro CT的主要應(yīng)用領(lǐng)域之一是對骨骼的研究，尤其是骨小梁，近年來已經(jīng)越來越多地應(yīng)用于牙周骨組織再生的評估[26]。對骨的描述一般采用三維參數(shù)計(jì)量，其中相對骨體積(BV/TV)，骨表面積體積比(BSA/BV)，骨小梁厚度(Tb.Th)，骨小梁數(shù)目(Tb.N)這幾個(gè)參數(shù)的數(shù)值越大說明骨的健康狀況越好，骨小梁模型因子(Trabecular bone pattern factor, Tb.Pf)是1992年由Hahn等首次提出的，是一種以衡量骨小梁凸面和凹面程度來定量測量連通性的指標(biāo)：先測量出結(jié)構(gòu)的表面積(BS)和體積(BV)，然后利用膨脹將整體結(jié)構(gòu)的體素增加一個(gè)單位的厚度，再次計(jì)算出骨小梁結(jié)構(gòu)膨脹后的表面積(BS’)和體積(BV’)就可計(jì)算出Tb.Pf；它和骨小梁間隙(Tb.Sp)一起作為新的表示骨小梁連續(xù)性的參數(shù)，表示骨小梁柱狀梁和板狀梁的相互轉(zhuǎn)化：其值越小，表示骨小梁的連續(xù)性越好，提示骨小梁由桿狀向板狀發(fā)生變化[27]。通過表3的骨組織形態(tài)學(xué)參數(shù)的分析表明，大黃、黃芩配伍組的各參數(shù)均與牙周炎組有顯著的差異，且優(yōu)于單獨(dú)的藥物組，進(jìn)一步體現(xiàn)了藥物聯(lián)用后有更好的成骨作用。

綜上所述，采用結(jié)扎絲和細(xì)菌涂抹的方式可以成功建立SD大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎動(dòng)物模型，而13 mg/L濃度的大黃有效部位和5 mg/L濃度的黃芩有效部位配伍后進(jìn)行局部注射治療SD大鼠的實(shí)驗(yàn)性牙周炎，可以明顯降低牙槽骨破骨細(xì)胞、增加成骨細(xì)胞數(shù)量，降低齦溝液、唾液以及血液中的PGE2含量和血液中的CRP含量，增加局部牙槽骨再生、調(diào)整骨組織形態(tài)學(xué)各參數(shù)水平，因此具有一定的改善牙周組織局部炎癥和促進(jìn)局部骨組織再生的效果，但其具體的作用機(jī)制尚需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步深入探討。