郭涇磊，張程煬，李紅霞，李 嵩，丁爾全，汪 妤

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西楊陵 712100)

全世界40%以上人口以小麥為主食，小麥為人類提供超過20%的蛋白質(zhì)和能量[1]，也是中國城鄉(xiāng)居民的主要口糧作物之一[2]。近幾年氣候變化明顯，極端高溫或低溫頻發(fā)，需要培育抽穗前發(fā)育略慢而后期灌漿速度快的品種[3]。根據(jù)以往的育種經(jīng)驗(yàn)，大多數(shù)小葉類型的小麥材料或品種都灌漿較好。不僅如此，小葉品種群體通透性好，避病和耐病能力強(qiáng)，光合效率高；大風(fēng)暴雨極端天氣抗倒伏，由于葉片小，蒸騰效率降低，節(jié)水抗旱。通過傳統(tǒng)育種方法可以改良農(nóng)藝性狀優(yōu)良但葉片較大的品種，如果能明確控制葉片大小的基因及其調(diào)控機(jī)制，借助生物技術(shù)手段將助力傳統(tǒng)育種進(jìn)程。

很多葉片發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)量改變不僅影響葉片大小，而且還會(huì)改變植物的其他性狀，比如花器官、種子等。但是在擬南芥中的研究表明，某些GRF(Growth-regulating factor)家族成員主要作用于葉片片狀結(jié)構(gòu)的伸展過程，對(duì)分生組織以及其他器官的影響較小[4-6]，是控制葉片大小的關(guān)鍵基因。在基因應(yīng)用方面，相對(duì)下游且調(diào)控性狀單一的基因具有更大的應(yīng)用價(jià)值，可以在不改變其他優(yōu)良農(nóng)藝性狀的同時(shí)改良目的性狀。從這個(gè)角度看，GRF具有潛在的利用價(jià)值。

雖然在擬南芥、水稻和玉米中也有關(guān)于GRF及其轉(zhuǎn)錄激活因子GIF(GRF-interacting factor)調(diào)控葉片生長(zhǎng)發(fā)育的研究，但是研究表明，分子水平上具有較高同源性的基因在兩個(gè)作物中的生物學(xué)功能迥異，甚至相反[7-11]。目前關(guān)于小麥GRF基因家族的研究鮮見報(bào)道，因此本研究探索小麥GRF基因家族成員的生物學(xué)功能，以期找到與葉片發(fā)育相關(guān)的基因。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥品種‘中國春’(Chinese spring)為西北農(nóng)林科技大學(xué)小麥遺傳育種實(shí)驗(yàn)室保存種子，重組BSMV病毒載體α、β、γ質(zhì)粒由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院韓德俊教授惠贈(zèng)。限制性核酸內(nèi)切酶PacI、NotI和BssHII購自美國NEB公司，RNA提取試劑Trizol、Universal DNA 純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒(Tiangen，北京)購自天根生化科技(北京)有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa,中國大連)、熒光定量試劑盒SYBR Premix ExTaqTMII(TaKaRa,中國大連)購自寶生物工程(大連)有限公司，體外轉(zhuǎn)錄試劑盒T7 RiboMAXTMExpress Large Scale RNA Production System(Promega)購自美國普羅麥格(Promega)公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小麥TaGRF4的生物信息學(xué)分析GRF基因主要包含QLQ(GlnLeuGln)和WRC(TrpArgCys)兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。從Ensembl plants(http://plants.ensembl.org/index.html) 獲得6條水稻GRF基因序列和10條玉米GRF基因序列。使用這些基因序列的保守結(jié)構(gòu)域在該數(shù)據(jù)庫搜索小麥序列。根據(jù)蛋白序列進(jìn)行篩選，刪除沒有QLQ或WRC結(jié)構(gòu)域的序列，得到的序列即為小麥GRF序列。獲得小麥GRF的氨基酸序列、cDNA序列、基因序列、內(nèi)含子和外顯子的起始終止位置等信息。利用玉米ZmGRF10基因的蛋白序列對(duì)已獲得的小麥GRF序列進(jìn)行blast搜索，找到與之同源性最高的3條小麥同源基因序列，命名為TaGRF4-A、TaGRF4-B和TaGRF4-D，合稱為TaGRF4，全長(zhǎng)為3 227～ 3 294 bp，含有 3 個(gè)外顯子和 2 個(gè)內(nèi)含子，總蛋白長(zhǎng)度約為410個(gè)氨基酸。為了分析TaGRF4基因的進(jìn)化關(guān)系，使用生物信息學(xué)分析軟件MEGA 7.0對(duì)水稻、玉米GRF蛋白序列和小麥TaGRF4蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，使用鄰位相連法(Neighbor-joining, NJ)構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.2 不同生長(zhǎng)時(shí)期葉片TaGRF4基因表達(dá)量的鑒定 小麥(17 ℃暗培養(yǎng)2 h，21 ℃光照培養(yǎng)22 h，光照度為15 730 lx)在人工氣候箱培養(yǎng)。為了研究TaGRF4在葉片發(fā)育過程中的表達(dá)模式，在小麥幼苗長(zhǎng)到兩葉一心時(shí)分別剪取小麥的第 1、 2、3 片葉，其中第 1 片葉生長(zhǎng)時(shí)間最長(zhǎng)，為老葉；第 2 片葉剛完全展開，為成熟葉片，也是主要的功能葉片；而第 3 片葉是正在發(fā)育的幼葉。用Trizol法提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第 1 鏈，根據(jù)小麥TaGRF4的3個(gè)同源基因的保守序列設(shè)計(jì)特異引物RT-GRF4-F和RT-GRF4-R，以cDNA第 1 鏈為模板，以TaActin為內(nèi)參基因，用熒光定量試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)目的基因TaGRF4的表達(dá)水平。引物序列見表1。

1.2.3 葉片不同部位TaGRF4基因表達(dá)量的鑒定 為了檢測(cè)葉片不同位置或區(qū)段TaGRF4的表達(dá)情況，將兩葉一心時(shí)期剛完全展開的小麥第 2 片葉沿縱軸分割成遠(yuǎn)端、中遠(yuǎn)段、中近端和近端4 個(gè)部分分別取樣。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)目的基因TaGRF4的表達(dá)水平。

1.2.4 GA處理后不同時(shí)間點(diǎn)TaGRF4基因表達(dá)量的鑒定 葉片最終大小與激素有關(guān)，其中最關(guān)鍵的是赤霉素(Gibberellin, GAs)，其不僅促進(jìn)細(xì)胞增大而且可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，為了研究TaGRF4基因的表達(dá)是否受其調(diào)控，用10 μmol·L-1赤霉素(GA3)涂抹兩葉期小麥的第 1 片葉后，分別于 0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h選第 2 片葉取樣，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)目的基因TaGRF4的表達(dá)水平。

1.2.5 病毒誘導(dǎo)基因沉默載體(VIGS)的構(gòu)建與侵染 為了消除在表型鑒定過程中基因功能冗余的影響，需要將TaGRF4的3 個(gè)同源基因同時(shí)沉默，根據(jù)已知TaGRF4-A的cDNA序列設(shè)計(jì)帶有PacⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基的引物(表1)，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA第 1 鏈為模板，用高保真酶PCR擴(kuò)增得到的沉默片段經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證已成功在目的序列前后引入酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，且與TaGRF4-B和TaGRF4-D相同區(qū)段的相似度≥85%，從而保證B和D基因組上TaGRF4能夠同時(shí)被沉默。取含BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ和BSMV-γPDS質(zhì)粒的大腸桿菌擴(kuò)大培養(yǎng)，用天根(TianGen) 公司質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。用上述擴(kuò)增的片段與BSMV-γ質(zhì)粒重組、轉(zhuǎn)化和測(cè)序(測(cè)序引物見表1)。將BSMV-α、 BSMV-β、γBSMV-γPDS以及經(jīng)驗(yàn)證含有目的基因的γBSMV-TaGRF4質(zhì)粒線性化，其中α載體用MluI酶；β載體用SpeI酶；γ載體用BssHII酶，線性化后質(zhì)粒電泳速度減慢，表明線性化成功(圖1-A)。將線性化后的載體用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒體外轉(zhuǎn)錄為RNA病毒(圖1-B)。選第 3 片葉尚未發(fā)育的小麥幼苗于第 2 片葉接種RNA病毒，接種時(shí)α、β、γ液體按體積比1∶1∶1混合，共1.5 μL，加入8.5 μL FES緩沖液充分混勻后，進(jìn)行摩擦接種。接種后將小麥放入25 ℃左右的環(huán)境密封暗處理 24 h，然后于人工氣候箱正常培養(yǎng)。每天觀察、記錄植株第3片葉的長(zhǎng)度變化。并于接種第 15天取第3片葉檢測(cè)TaGRF4的表達(dá)量，驗(yàn)證沉默效果。

表1 基因克隆與遺傳轉(zhuǎn)化的引物Table 1 Primers for gene clone and genetic transformation

A.載體線性化; B.線性化載體體外轉(zhuǎn)錄; M.DL2000 DNA marker; 0.空載體，空白對(duì)照，下同

2 結(jié)果與分析

2.1 TaGRF4基因的生物信息學(xué)分析

2.1.1 基因與蛋白序列分析 通過獲得的TaGRF4基因信息(表2)，比較A、B和D基因組上3 個(gè)TaGRF4同源基因的蛋白序列，發(fā)現(xiàn)它們都有WRC和QLQ兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，部分同源基因在兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域上無氨基酸變異，氨基酸差異位點(diǎn)主要位于第3個(gè)外顯子上(圖2)。

2.1.2 物種同源性分析 利用小麥TaGRF4基因、水稻和玉米GRF基因的蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)，發(fā)現(xiàn)除玉米ZmGRF10之外還有玉米ZmGRF9和水稻OsGRF1與小麥TaGRF4的同源性較高，其中水稻OsGRF1與小麥TaGRF4同源性最高，相似度為75%。

表2 小麥 TaGRF4基因信息Table 2 Information of wheat TaGRF4

2.2 TaGRF4基因表達(dá)量分析

2.2.1TaGRF4基因在苗期葉片中的表達(dá)量 不同發(fā)育時(shí)期葉片的實(shí)時(shí)定量結(jié)果表明，TaGRF4在第3片葉中的表達(dá)量最高，即在生長(zhǎng)旺盛的幼葉中表達(dá)量最高，在第 1片葉和第2片葉中的表達(dá)量偏低，即在老葉和成熟葉片中的表達(dá)量偏低，且兩者間無明顯差異(圖4)。

根據(jù)圖4的結(jié)果可做出進(jìn)一步推論：相較其他部分，葉片生長(zhǎng)旺盛部分(葉尖，遠(yuǎn)端)的TaGRF4表達(dá)量更高。檢測(cè)TaGRF4基因在 4 個(gè)部分的表達(dá)情況，結(jié)果表明TaGRF4在葉片遠(yuǎn)端(葉尖)表達(dá)量最高，中部表達(dá)量最低(圖5)，與推論相符。

圖2 小麥A、B、D基因組上 TaGRF4的3 個(gè)同源蛋白比對(duì)Fig.2 The alignment of TaGRF4 protein sequences on A, B and D subgenome

圖3 TaGRF4基因與水稻、玉米GRF家族基因系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetics analysis of TaGRF4 in Triticum aestivum, Oryza sativa and Zea mays

圖4 TaGRF4在不同葉片中的表達(dá)分析Fig.4 Expression analysis of TaGRF4 of different leaves

圖5 TaGRF4在葉片不同部位的表達(dá)分析Fig.5 Expression analysis of TaGRF4 in different sections of leaves

2.2.2 GA處理后不同時(shí)間點(diǎn)TaGRF4基因的表達(dá)量 兩葉期小麥第 2 片葉在不同時(shí)間點(diǎn)的實(shí)時(shí)定量結(jié)果顯示，TaGRF4基因在GA3處理后1 h顯著上調(diào)表達(dá)，但隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量又回到未處理水平，說明在短時(shí)間內(nèi)赤霉素會(huì)誘導(dǎo)TaGRF4的表達(dá)，但是無法維持其高表達(dá)(圖6)。

2.3 VIGS結(jié)果分析

2.3.1 表型分析 在 BSMV-VIGS RNA病毒接種后第10天觀察表型，發(fā)現(xiàn)接種γBSMV-TaGRF4的植株第3 片葉生長(zhǎng)較快，而接種空載體γBSMV0的植株第3 片葉生長(zhǎng)相對(duì)較慢(圖7-A)。對(duì)第3 片葉長(zhǎng)度的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，接種γBSMV-TaGRF4的葉片比接種空載體的葉片長(zhǎng)50%左右(圖7-B)。說明TaGRF4沉默后能夠促進(jìn)葉片生長(zhǎng)。

*代表差異達(dá)顯著水平(P<0.05)；**代表差異達(dá)極顯著水平(P< 0.01);圖8同

A.接種后表型比較，藍(lán)色為接種葉，紅色為新生葉片；B.接種后新生葉片長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)

2.3.2 沉默后小麥TaGRF4的表達(dá) BSMV-VIGS RNA病毒接種后第15天，第3片葉的實(shí)時(shí)定量結(jié)果顯示，與接種空載體γBSMV0的植株相比，接種γBSMV-TaGRF4的植株#2與#5的TaGRF4基因表達(dá)量并未下調(diào)，而其余植株TaGRF4表達(dá)量顯著降低(圖8)。

#1～#7.γBSMV- TaGRF4 接種植株

3 討 論

前人研究表明GRF基因家族某些成員可以調(diào)控葉片的大小[12]，故本研究以GRF基因家族作為切入點(diǎn)，分析小麥控制葉片大小的分子調(diào)控機(jī)制，根據(jù)玉米中已經(jīng)鑒定出的控制葉片大小的ZmGRF10蛋白序列，通過同源比對(duì)，在小麥基因組上找到與之同源性最高的小麥基因TaGRF4。同時(shí)在水稻和玉米中找到與TaGRF4同源性較高的基因，其中OsGRF1、ZmGRF9、ZmGRF11與TaGRF4的蛋白序列相似度達(dá)到60%～80%。

在葉片發(fā)育過程中，不同發(fā)育時(shí)期的葉片以及葉片不同位置的細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)狀態(tài)不同[13]，本研究通過比較小麥不同發(fā)育時(shí)期的葉片及完全展開葉片不同區(qū)段的TaGRF4表達(dá)情況以明確TaGRF4是否與葉片發(fā)育有關(guān)。發(fā)現(xiàn)TaGRF4在未完全展開葉中的表達(dá)量最高，而未完全展開葉片的細(xì)胞處于增殖增大階段，因此推斷TaGRF4在葉片發(fā)育早期葉片細(xì)胞迅速增殖增大的過程中發(fā)揮作用。前人研究表明單子葉葉片細(xì)胞生長(zhǎng)具有向基性，即自上而下，頂部細(xì)胞分裂快，基部細(xì)胞分裂速度減慢并逐漸增大[14]；而TaGRF4在葉片頂端的表達(dá)量最高，推測(cè)TaGRF4可能參與葉片生長(zhǎng)初期細(xì)胞增殖過程。

第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的GRF家族成員就是水稻OsGRF1，該基因主要在水稻的頂端分生組織和居間分生組織中表達(dá)，而且其表達(dá)受GA誘導(dǎo)，調(diào)控了水稻的營養(yǎng)生長(zhǎng)[15]。本研究中TaGRF4與OsGRF1同源性最高，也主要在幼嫩組織中表達(dá)且受GA誘導(dǎo)，說明二者具有相似的表達(dá)模式，都與器官的形成和發(fā)育有關(guān)，但是目前關(guān)于OsGRF1調(diào)控葉片大小的研究鮮見報(bào)道。

BSMV-VIGS RNA 病毒的摩擦接種對(duì)被接種葉片(第 2 片葉)生長(zhǎng)狀態(tài)有明顯影響，故選擇新生葉片，即小麥第 3 片葉作為研究對(duì)象。本研究發(fā)現(xiàn)，利用BSMV-VIGS病毒沉默體系將TaGRF4在小麥幼苗中沉默后，第 3 片葉生長(zhǎng)速率加快，說明TaGRF4可能與抑制葉片生長(zhǎng)有關(guān)。這與玉米中關(guān)于ZmGRF10的研究結(jié)果類似，玉米ZmGRF10超表達(dá)后玉米的葉片變小[16]。由此可見，小麥TaGRF4與玉米ZmGRF10不僅同源性較高，而且二者可能具有相似的功能。ZmGRF10包含QLQ和WRC結(jié)構(gòu)域，但是C端完全缺失。與之相比，小麥TaGRF4序列完整，說明C端序列不影響這兩個(gè)基因調(diào)控葉片生長(zhǎng)的功能。試驗(yàn)中#2與#5的TaGRF4基因表達(dá)量并未下調(diào)，而VIGS沉默存在侵染失敗的可能性，故認(rèn)為#2與#5為沉默失敗植株。

本研究結(jié)果表明，小麥TaGRF4基因參與葉片的生長(zhǎng)發(fā)育過程，并且受GA誘導(dǎo)，沉默后會(huì)促進(jìn)苗期葉片生長(zhǎng)。VIGS技術(shù)操作簡(jiǎn)單、周期短且不需要遺傳轉(zhuǎn)化，非常適用于小麥基因功能的快速分析[17-18]，但VIGS體系中，RNA病毒較為脆弱，易出現(xiàn)侵染失敗的情況，且侵染后性狀不會(huì)遺傳，只能初步驗(yàn)證TaGRF4基因的功能，進(jìn)一步驗(yàn)證小麥基因功能仍需通過轉(zhuǎn)基因、Crispr/Cas9等手段實(shí)現(xiàn)。

4 結(jié) 論

本研究利用同源比對(duì)找到與玉米ZmGRF10同源性較高的小麥TaGRF4基因，發(fā)現(xiàn)該基因在生長(zhǎng)旺盛的幼嫩葉片和葉片頂端表達(dá)量最高，說明TaGRF4可能與葉片細(xì)胞分裂增殖有關(guān)。赤霉素GA在短時(shí)間內(nèi)會(huì)誘導(dǎo)TaGRF4的表達(dá)，但是無法維持其高表達(dá)。利用VIGS病毒沉默技術(shù)將TaGRF4在小麥幼苗中沉默后，發(fā)現(xiàn)新生葉片的TaGRF4表達(dá)量較低，生長(zhǎng)速率加快，沉默植株第3葉的長(zhǎng)度顯著大于對(duì)照植株，說明TaGRF4與ZmGRF10類似，在葉片生長(zhǎng)過程中起抑制作用。綜上得出結(jié)論，小麥基因TaGRF4主要在生長(zhǎng)旺盛的葉片部位表達(dá)，參與調(diào)控葉片的生長(zhǎng)發(fā)育。