昝領(lǐng)兄，李開祥，賈永鵬，杜德志

(青海大學(xué) 農(nóng)林科學(xué)院,青海省春油菜遺傳改良重點實驗室,國家油菜改良中心青海分中心,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部春油菜科學(xué)觀測實驗站,青海省春油菜工程技術(shù)研究中心，西寧 810016)

油菜是主要的油料作物之一，由于各地環(huán)境條件有所差異，對油菜品種的特性要求越來越高，在產(chǎn)量高的基礎(chǔ)上，還應(yīng)具有優(yōu)質(zhì)、抗倒伏和抗逆性等其他特點。其中甘藍型油菜作為主要的油菜栽培品種，因具有適應(yīng)性廣，產(chǎn)量高，品質(zhì)優(yōu)良等許多特性，使其種植面積最為廣泛。因此揭示甘藍型油菜抗逆性分子機理的研究對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)至關(guān)重要。

同源異型亮氨酸拉鏈蛋白(homeodomain-leucine ZIPper, HD-ZIP)是高等植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，其中包括C末端由61個氨基酸構(gòu)成的高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Homeodomain, HD)和跟隨其后的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域(Leucine ZIPper, LZ)[1-2]。通過LZ結(jié)構(gòu)域，HD-ZIP蛋白才能折疊成為同源或異源二聚體，并且LZ結(jié)構(gòu)域可以實現(xiàn)和其他蛋白質(zhì)的相互作用，使該蛋白發(fā)揮不同的功能。此外，有研究表明含有HD-ZIP結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)基因植物在受到不同脅迫的環(huán)境條件下能夠表現(xiàn)出優(yōu)良的的形態(tài)特征[3-4]。根據(jù)該基因家族成員的序列相似性和結(jié)構(gòu)域的不同可將HD-ZIP基因家族成員分為四大類，即HD-ZIP Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ[5-6]。這四大類都同時包含保守的HD和LZ結(jié)構(gòu)域，促進了HD-ZIP蛋白的二聚化，但是這四大亞族之間在結(jié)構(gòu)上也存在差異，即HD-ZIP Ⅰ和HD-ZIP Ⅱ可以識別DNA序列CAAT(A/T)ATTG，而HD-ZIP Ⅲ和HD-ZIP Ⅳ可識別的DNA序列為GTAAT(G/C)ATTAC和TAAATG(C/T)A[7-8]。此外，HD-ZIP Ⅱ還另外包含2個五組保守的氨基酸，半胱氨酸(Cys) 、脯氨酸(Pro) 、絲氨酸(Ser) 、半胱氨酸(Cy)和谷氨酸(Glu) ，被稱為CPSCG域。 HD-ZIP Ⅲ和HD-ZIP Ⅳ共享一個高度結(jié)合的脂質(zhì)/甾醇結(jié)合區(qū)域，稱為START域[9-10]。

由于這四類亞家族成員在結(jié)構(gòu)上存在差異，使得它們在各自的功能方面也有所不同。HD-ZIP Ⅰ蛋白質(zhì)在植物對于多種環(huán)境條件的適應(yīng)方面發(fā)揮重要作用，比如干旱，脫落酸(ABA)脅迫，鹽脅迫和極端溫度等。HB1屬于HD-ZIP Ⅰ家族，在蒺藜苜蓿的初生根和側(cè)根分生組織中被表達，研究發(fā)現(xiàn)它可參與對鹽和滲透脅迫的反應(yīng)[11]。在玉米HD-ZIP Ⅰ家族的Zmhdz10基因通過ABA依賴的信號傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)植物的干旱和耐鹽性脅迫[12]。HD-ZIP Ⅱ亞家族成員基因主要在避光或光照信號，植物發(fā)育和非生物脅迫方面發(fā)揮著重要功能[13]。例如，其家族的ATHB2、HAT2、HAT3和HAT4的表達主要受光敏色素調(diào)節(jié)，因為近紅外光與遠紅光之間的比例會迅速誘導(dǎo)避光響應(yīng)[14-15]。據(jù)報道，HD-ZIP Ⅲ可以作為一種調(diào)節(jié)因子參與植物細胞的橫向伸長，木質(zhì)部分化，生長素運輸和側(cè)器官分化[16-17]。HD-ZIP Ⅳ對植物表皮發(fā)育過程起著至關(guān)重要的作用[18]；有研究發(fā)現(xiàn)這類蛋白質(zhì)被認為參與毛狀體形成，脂質(zhì)代謝和角質(zhì)層生物合成[19]。玉米OCL4(外細胞層4)抑制玉米形成毛狀體并影響花藥分裂或分化過程[20]。

綜上所述，HD-ZIP蛋白在植物特異的發(fā)育方面表現(xiàn)出重要的作用，因此了解該家族成員的序列特征及相關(guān)生物信息學(xué)分析對于進一步挖掘并利用它們在各種植物中的功能機制必不可少。目前，HD-ZIP蛋白家族的基因功能在許多植物中都已經(jīng)進行了分析和研究。如擬南芥[21]、玉米[22]、水稻[23]、楊樹[24]、黃瓜[25]、大豆[26]等。但在油菜中未見相關(guān)報道。因此，本研究利用已公布的甘藍型油菜基因組信息，通過對HD-ZIP家族基因的進行鑒定和序列分析，可為甘藍型油菜的抗性研究及新品種培育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 HD-ZIP基因的序列檢索與鑒定

根據(jù)對HD-ZIP蛋白的相關(guān)研究，通過Pfam32.0(http://pfam.xfam.org/)數(shù)據(jù)庫分別下載同源框的保守HD結(jié)構(gòu)域和亮氨酸拉鏈LZ結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型(HMM)PF00046和PF02183[27]。并使用Hmmsearch搜索工具在甘藍型油菜基因組(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)中尋找具有同源序列的基因[28]，以在線軟件NCBI-CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure)對獲得的蛋白序列進行結(jié)構(gòu)域鑒定，選擇同時含有HD和LZ結(jié)構(gòu)域的蛋白作為甘藍型油菜HD-ZIP蛋白基因家族。從甘藍型油菜基因序列數(shù)據(jù)庫中檢索這些基因編碼序列的注釋信息，最后使用在線工具ExPASY(http://web.expasy.org/protparam)對獲得序列進行氨基酸數(shù)目(aa)，等電點(PI)和分子質(zhì)量(u)等物理參數(shù)的統(tǒng)計分析。

1.2 HD-ZIP家族基因染色體定位和基因結(jié)構(gòu)分析

在甘藍型油菜基因組數(shù)據(jù)庫中搜索HD-ZIP家族基因在染色體上的具體位置和每條染色體總長度，利用在線工具MapGene2Chromosome v2(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0)繪制該家族基因的染色體定位圖[29]。結(jié)合基因家族的gtf3文件，使用在線分析軟件GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪制基因結(jié)構(gòu)圖，分析基因的內(nèi)含子和外顯子分布情況。

1.3 HD-ZIP家族基因進化樹分析和motif 預(yù)測

利用Clustal[30]工具進行氨基酸序列比對。通過MEGA7.0[31]軟件，以鄰接法(NJ，Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，使用poisson模式，將Bootstrap參數(shù)設(shè)置為1 000，其余參數(shù)設(shè)置為默認。并利用在線軟件MEME[32](http://meme-suite.org/tools/meme)鑒定該家族基因蛋白保守基序，除了基序數(shù)量設(shè)置為20個，其余參數(shù)設(shè)置為默認。Motif分析結(jié)果使用TBtools軟件下載保存[33]。

1.4 HD-ZIP家族基因之間的共線性分析

利用軟件McScanX[34]對甘藍型油菜的HD-ZIP家族基因進行共線性分析，采用Circos繪制關(guān)系圖。

1.5 甘藍型油菜HD-ZIP家族基因的表達分析

為了進一步分析和挖掘HD-ZIP轉(zhuǎn)錄因子在甘藍型油菜不同組織中的表達模式，從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(在鹽脅迫處理下，甘藍型油菜HD-ZIP家族基因在根和葉片中的表達情況)。通過fasterq-dump軟件將SRA數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為fastq數(shù)據(jù)，同時利用fastqc進行數(shù)據(jù)質(zhì)控和過濾處理，然后利用STAR軟件和甘藍型油菜參考基因組進行比對，接著使用RSEM軟件進行表達量定量分析，最后使用R軟件中的pheatmap軟件包繪制表達熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍型 HD-ZIP基因的鑒定及其染色體 定位

為了在甘藍型油菜全基因組中鑒定所有的HD-ZIP基因家族成員和其在染色體上的分布情況，通過Pfam數(shù)據(jù)庫中的PF00046 和PF02183在甘藍型油菜基因組數(shù)據(jù)庫(E-value=le-5)中對HD-ZIP家族基因進行初步的篩選，并且使用在線軟件NCBI-CDD和ExPASY進行結(jié)構(gòu)域鑒定，保留同時含有HD和LZ結(jié)構(gòu)域的蛋白，最終在甘藍型油菜基因組上獲得了74個HD-ZIP基因成員(表1)。結(jié)果顯示：74個HD-ZIP 轉(zhuǎn)錄因子的大小為162～691 aa，其中編碼區(qū)序列和對應(yīng)的氨基酸長度最短的為489 bp和162aa(BnaA08g04720D)，最長的為2 076 bp和691aa(BnaC05g19660D)，平均氨基酸個數(shù)為279個。蛋白分子質(zhì)量(MW)為18 275.57 u(BnaA 08g04720D)～76 164.87 u(BnaC05g19660D)，等電點(PI)為4.54(BnaA09g42630D)～10.06(BnaA 09g18250D)。

染色體定位結(jié)果顯示：這74個基因在甘藍型油菜19條染色體中勻有分布，此外還包括8條隨機序列(圖1)，其中A染色體組上共有30個，除了A01上僅有1個，其余9條染色體上有2～4個不等，C染色體上共有25個，每條染色體有 2～4個，其余19個分布在8條隨機染色體上。綜上所述基因在染色體組上的分布不均勻。

表1 甘藍型油菜HD-ZIP基因家族的特征Table 1 Characteristics of HD-ZIP gene family in Brassica napus

(續(xù)表1 Continued table 1)

圖1 HD-ZIP家族基因的染色體定位Fig.1 Mapping of HD-ZIP family gens in B.napus chromosme

2.2 甘藍型油菜HD-ZIP家族基因系統(tǒng)進化樹分析

為明確甘藍型油菜中 HD-ZIP 轉(zhuǎn)錄因子的分類情況，本研究利用MAGA 7軟件對74個甘藍型油菜 HD-ZIP 轉(zhuǎn)錄因子進行系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構(gòu)建(圖2)。結(jié)果顯示：74個HD-ZIP轉(zhuǎn)錄因子可被分為4大亞族，分別為HD-ZIP Ⅰ、HD-ZIP Ⅱ、HD-ZIP Ⅲ 和 HD-ZIP Ⅳ，其中有39個HD-ZIP轉(zhuǎn)錄因子被聚類在HD-ZIP Ⅰ，是最多的一類，占HD-ZIP轉(zhuǎn)錄因子總家族的52.7%；HD-ZIP Ⅱ和HD-ZIP Ⅳ分別占HD-ZIP轉(zhuǎn)錄因子總家族的9.5%和35.1%；HD-ZIP Ⅲ所包含的HD-ZIP轉(zhuǎn)錄因子最少，僅有2個：分別是BnaC05g19660D和BnaA09g29480D。從進化樹可看出HD-ZIP Ⅰ和HD-ZIP Ⅱ處在同一分枝，其親緣關(guān)系可能也比較相近。

2.3 甘藍型油菜HD-ZIP家族基因結(jié)構(gòu)和motif預(yù)測

使用在線軟GSDS繪制HD-ZIP基因家族的基因結(jié)構(gòu)圖(圖3)，分析內(nèi)含子和外顯子分布情況。HD-ZIP家族基因的DNA序列和CDS分析表明：74個甘藍型油菜HD-ZIP 的內(nèi)含子個數(shù)從 1到10不等，在相同的亞族中，內(nèi)含子數(shù)量差異不大，具有相似的結(jié)構(gòu)。其中HD-ZIP Ⅱ的內(nèi)含子數(shù)量集中為1～2，HD-ZIP Ⅳ的基因內(nèi)含子個數(shù)為2～4個，基因結(jié)構(gòu)比較簡單；HD-ZIP Ⅰ和HD-ZIP Ⅲ的內(nèi)含子個數(shù)從1～10不等；HD-ZIP家族基因的內(nèi)含子在不同亞族間基因結(jié)構(gòu)存在較大差異，可能是因為HD-ZIP Ⅰ和HD-ZIP Ⅲ在進化過程中內(nèi)含子大量插入導(dǎo)致的。

圖2 甘藍型油菜HD-ZIP轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進化發(fā)生樹Fig.2 Unrooted phylogenetic tree of HD-ZIP transcription factors in B.napus

通過MEME在線工具對甘藍型油菜HD-ZIP轉(zhuǎn)錄因子的保守基序進行分析(圖4)。結(jié)果顯示：HD-ZIP家族的74個蛋白都含有motif 1和motif 2，這2個結(jié)構(gòu)共同組成了較為保守的HD-ZIP結(jié)構(gòu)域。在基因結(jié)構(gòu)圖和保守基序預(yù)測圖中可發(fā)現(xiàn)同源基因間盡管在結(jié)構(gòu)上存在較大的差異，但預(yù)測到的保守基序數(shù)目基本一致，比如BnaC05g19660D含有10個內(nèi)含子，BnaA09g 29480D只含有3個內(nèi)含子，但這2個同源基因預(yù)測到的 motif數(shù)目基本一致。但也有相反的情況，如BnaC06g12880D預(yù)測到了3個motif ，BnaC02g43700D中存在6個motif，但這2個基因都只含有2個內(nèi)含子。所以同一亞族中的同源基因間基本具有相同的基序，暗示其具有的功能也可能類似。

2.4 甘藍型油菜HD-ZIP家族共線性分析

對甘藍型油菜的74個HD-ZIP家族基因進行串聯(lián)重復(fù)性分析，挖掘HD-ZIP家族基因在甘藍型油菜A和C基因組中的重復(fù)情況。分析結(jié)果如圖5所示：鑒定到的74個HD-ZIP基因中大部分基因在甘藍型油菜的A染色體組和C染色體組中存在重復(fù)，具有共線性關(guān)系，其中有34個基因在A和C染色體組之間具有共線性關(guān)系。同時也發(fā)現(xiàn)，有11個基因在A染色體組內(nèi)存在共線性，5個基因在C染色體組內(nèi)存在共線性。進一步說明，在異源四倍體的甘藍型油菜基因組中，這些基因不僅在A和C染色體組組內(nèi)存在同源關(guān)系，而且染色體組之間存在較多的同源性，并且存在共線性關(guān)系的基因在系統(tǒng)進化樹中也都被聚為一類，這也表明在基因組進化過程中HD-ZIP蛋白家族基因在甘藍型油菜中相對保守。

圖3 甘藍型油菜HD-ZIP家族基因結(jié)構(gòu)Fig.3 Gene structure of HD-ZIP family in B.napus

圖4 甘藍型油菜HD-ZIP轉(zhuǎn)錄因子進化樹和保守基序Fig.4 Phylogetic tree and gene motifs of HD-ZIP family transcription in B.napus

2.5 甘藍型油菜HD-ZIP家族基因的表達分析

為進一步了解HD-ZIP家族基因在脅迫處理下的表達變化。結(jié)合甘藍型油菜在鹽脅迫處理下的根和葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。結(jié)果分析如圖6所示，從圖中可知，HD-ZIP家族的大部分基因在根和葉片中都發(fā)生不同程度的表達，BnaC08g35090D和BnaA09g42630D在葉片中的表達量最高，BnaA01g0050D和BnaA05g33840D在根中有最高的表達量。根中表達的基因數(shù)目多于葉片中，并且BnaA03g052600D、BnaC03g06800D等13個基因在根中的表達量要明顯高于葉片，受到鹽脅迫后，根和葉片中的大部分基因表達量會增加，并隨著脅迫處理的時間的增加，基因的表達量又會受到一定的下調(diào)，如BnaCnng73330D和BnaA04g00500D等基因在1 h和12 h對照下表達量很低，但在鹽脅迫1 h和12 h后表達量增加，并且脅迫1 h時表達量很高，但在12 h時表達量又相對較低，說明這些基因可以響應(yīng)鹽脅迫。只有少數(shù)基因的表達量未發(fā)生變化或者下調(diào)，如BnaC09g20160D、BnaA05g17490D、BnaA02g11290D、BnaA05g33840D。根和土壤直接接觸，受脅迫后，根中的基因不斷的調(diào)節(jié)變化應(yīng)對外界的脅迫，然后再將脅迫的信息傳遞到葉片中，進行相互協(xié)調(diào)。

圖5 甘藍型油菜HD-ZIP基因的共線性分析Fig.5 Collinear analysis of HD-ZIP gene in Brassica napus genome

3 討 論

HD-ZIP家族基因在功能上非常保守并且參與高等植物的多種生物學(xué)過程，目前大多數(shù)植物的HD-ZIP 轉(zhuǎn)錄因子已被鑒定和分析。Zhao等[22]在玉米中共鑒定到55個HD-ZIP家族基因，Yue等[35]在小麥中鑒定到46個HD-ZIP家族基因。但在油菜中還未見相關(guān)分析報道，為更加清楚地了解甘藍型油菜中HD-ZIP轉(zhuǎn)錄因子的功能，本試驗利用生物信息學(xué)方法對甘藍型油菜基因組中的HD-ZIP家族基因進行鑒定，并對其基本理化性質(zhì)、染色體定位、系統(tǒng)進化樹，保守基序及基因結(jié)構(gòu)等進行了統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示：在甘藍型油菜中共鑒定到74個HD-ZIP家族的轉(zhuǎn)錄因子，這些基因在甘藍型油菜19條染色體上均有分布；系統(tǒng)進化樹將這些基因分為4個亞族；74個基因都含有motif 1和motif 2保守基序，共同組成HD-ZIP的保守結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)果與Zhao等[22]的分析結(jié)果基本一致，說明HD-ZIP家族基因在不同物種間比較保守。

圖6 甘藍型油菜HD-ZIP家族基因的表達分析Fig.6 Expression analysis of HD-ZIP family gene in Brassica napus L.

甘藍型油菜是由白菜和甘藍自然雜交以及后期染色體加倍而產(chǎn)生的異源四倍體，基因組中應(yīng)該存在多拷貝基因，但是通過共線性分析發(fā)現(xiàn)有的基因在甘藍型油菜染色體組中不存在共線性關(guān)系，這可能是蕓薹屬植物進化時在加倍復(fù)制事件中的不對稱或者丟失所引起的。但是大部分HD-ZIP家族成員基因在甘藍型型油菜的A和C染色體組間的共線性多于在A和C染色體組內(nèi)的。并且存在共線性關(guān)系的基因在系統(tǒng)發(fā)育進化樹中也都可被聚為同一類，說明在基因組進化過程中這些基因相對保守，這可能也與這些基因在結(jié)構(gòu)上存在保守的結(jié)構(gòu)域有關(guān)。

HD-ZIP轉(zhuǎn)錄因子是一類較大的基因家族，在生物和非生物脅迫以及植物生長發(fā)育過程中具有重要的作用。在鹽脅迫下對甘藍型油菜不同組織HD-ZIP家族基因的表達模式進行分析發(fā)現(xiàn)，大部分基因在受脅迫時表達量會升高。Liu等[36]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)BnaA04g00500D(HB12)基因?qū)Ψ巧锩{迫(鹽脅迫)響應(yīng)，BnaC04g00750D(HB7)基因可以響應(yīng)干旱脅迫，這些結(jié)論與本試驗的分析結(jié)果一致，也進一步說明HD-ZIP家族基因在植物發(fā)育的調(diào)節(jié)和對非生物脅迫的響應(yīng)中起著重要作用。同時也發(fā)現(xiàn)有的基因雖然為同源基因，但是在根和葉片中的表達量卻相差很大，比如BnaC06g12880D、BnaA07g14910D和BnaC08g35090D、BnaA09g42630D，前2個基因在甘藍型油菜的根和葉中表達水平低，后2個基因在根和葉中的表達量較高，但是在進化樹分析中發(fā)現(xiàn)這兩組基因都屬于HD-ZIP Ⅰ亞家族，這有可能是一些基因在進化過程中功能上出現(xiàn)了 歧化。