付 博，王家哲，任 平，張 鋒，李英梅

(1.陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所 有害生物監(jiān)測與防控研究中心，西安 710043；2.陜西省酶工程技術研究中心，西安 710600)

陜西省獼猴桃種植面積和產(chǎn)量分別占世界1/3和全國1/2以上，近年來，隨著陜西省獼猴桃產(chǎn)業(yè)“東擴南移”戰(zhàn)略的穩(wěn)步實施，預計到“十三五”期間獼猴桃總種植面積可達10萬hm2以上，產(chǎn)業(yè)規(guī)模繼續(xù)保持全國首位[1]。但是隨著種植面積的不斷擴大，獼猴桃相關病害也日益增多，其中最嚴重的是獼猴桃細菌性潰瘍病(Pseudomonassyringaepv.actinidae)。該病于1980年首次在日本發(fā)現(xiàn)，而后在世界各地相繼出現(xiàn)，陜西自1991年在長安太乙宮首次發(fā)現(xiàn)獼猴桃潰瘍病，受害面積逐年擴大，并逐漸演變成難以治愈的頑疾，被當?shù)剞r(nóng)民稱為獼猴桃的“癌癥”。一般果園發(fā)病率37.5%，病情指數(shù)18.85，嚴重果園植株死亡率達47%，甚至毀園，平均產(chǎn)量損失10%～15%，嚴重者達60%以上，給果農(nóng)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[2-4]。

獼猴桃潰瘍病的致病菌為喜低溫高濕的弱寄生細菌，可在土壤、植物體和病殘體內(nèi)長期潛伏，當環(huán)境條件適宜時快速繁殖、發(fā)病[5]。國內(nèi)外研究表明，獼猴桃潰瘍病致病菌在侵染的初期階段最易治愈，但由于潛伏期不表現(xiàn)病癥，因此很難判斷是否感染，從而錯過了最佳的防治時期，一旦病情表現(xiàn)為菌膿流出，則任何防治措施都無效[6-7]。因此，獼猴桃潰瘍病田間的無癥帶菌狀態(tài)的早期診斷十分必要，是掌握病情發(fā)展階段的重要依據(jù)，也是獼猴桃潰瘍病防治的關鍵[8]。

本研究對獼猴桃潰瘍病快速檢測體系進行優(yōu)化，并對田間獼猴桃潰瘍病無癥樣本進行特異性PCR分子檢測，建立田間快速檢測的方法，為實現(xiàn)獼猴桃潰瘍病早期診斷，控制病情發(fā)展提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

供試菌株為M13，由有害生物監(jiān)測與防控研究中心實驗室分離、保藏。

1.2 PCR特異引物

PsaF1(5′-TTTTGCTTTGCACACCCGAT- TT-3′)和PsaR2(5′-CACGCACCCTTCAATCAGGATG-3′)設計參考文獻[9]的方法，擴增目的片段為細菌16S-23S rDNA ITS部分區(qū)域[8]。

1.3 PCR反應體系

反應體系25 μL，其中不含Mg2+的10×buffer 1.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，上/下游引物各10 μmol/L 1.25 μL，5 U/μLTaq酶2.062 μL，DNA模板2 μL，無菌去離子水16.938 μL。PCR擴增反應程序為：95 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠檢測，目的條帶大小280 bp，根據(jù)實際擴增情況進行適當調(diào)整。

1.4 待測樣品的制備條件優(yōu)化

取新鮮獼猴桃潰瘍病病健交界處組織(直徑約3～5 mm，葉片病斑)0.1 g，切碎后等量裝入4支1.5 mL離心管中，分別加入4種不同的樣品浸泡液：磷酸緩沖液[9]、金氏B培養(yǎng)液[10]、PDA培養(yǎng)液[11]、LB培養(yǎng)液[12]，26 ℃分別浸泡8 h后各吸取1 μL浸泡液作為PCR反應模板。進一步設置浸泡時間為2 h、5 h、8 h、12 h和16 h，根據(jù)特異性條帶的亮度選出最佳的浸泡時間。試驗設3次重復。

1.5 化學增強劑對PCR檢測效果的影響與優(yōu)化

PCR反應體系中以制備的浸提液為模板，分別加入終質(zhì)量濃度為50 μg/mL牛血清白蛋白(BSA)、體積分數(shù)為10%甘油及0.1 mg/mL白明膠作為反應增強劑。根據(jù)特異性條帶亮度，篩選出最佳的化學增強劑，并進一步對其使用濃度進行優(yōu)化。

1.6 無癥帶菌樣品的優(yōu)化處理

取新鮮健康獼猴桃葉片，剪成32片(約2 mm×10 mm)，8片為一組，共4組，分別放入1.5 mL離心管Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ中，取1 mL金氏B培養(yǎng)液和10 μL 4.0×108cfu/mL的獼猴桃潰瘍病原菌液加入管中，作為模擬的無癥帶菌樣品。處理Ⅰ：浸提液直接作為PCR反應體系模板；處理Ⅱ：浸提液10 000 r/min離心6 min，棄上清液，加入30 μL ddH2O，混勻后作為PCR反應體系模板；處理Ⅲ：加入終質(zhì)量濃度為3 mg/mL的Na2SO3，26 ℃浸泡8 h后作為PCR擴增模板；處理Ⅳ：加入終質(zhì)量濃度為3 mg/mL的Na2SO3，26 ℃浸泡8 h，10 000 r/min離心6 min，棄上清液，加入30 μL 3 mg/mL的Na2SO3混勻后作為PCR擴增模板，以新鮮顯癥獼猴桃葉片作為陽性對照。根據(jù)電泳條帶亮度，篩選最佳的處理方式。設3次重復。

1.7 模板量對PCR擴增的影響

新鮮獼猴桃潰瘍病病健交界處組織1 g，10 mL浸泡液制樣后，分別取混勻的浸提液1 μL、 1.5 μL、2 μL、2.5 μL、3 μL、3.5 μL作為模板進行PCR擴增，根據(jù)電泳條帶的亮度，確定最佳模板量。

1.8 田間獼猴桃潰瘍病最佳檢測時期的確定

采集陜西周至縣獼猴桃植株萌芽期(2月上旬至3月上旬)、發(fā)芽期(3月中下旬至4月中旬)、孕蕾至開花期(4月中旬至5月中旬)、生理落果期(4月下旬至5月下旬)、果實成熟期(8月中下旬至9月下旬)和休眠期(11月下旬至1月下旬)當年生無癥枝條和葉片(或芽苞)，按照本試驗中優(yōu)化的PCR檢測方法，分析不同發(fā)育期獼猴桃潰瘍病的檢出率，確定田間PCR檢測獼猴桃潰瘍病的最佳時期。

2 結果與分析

2.1 樣品浸泡液及浸泡時間的確定

浸泡液的浸提效果比對結果顯示(圖1)，金氏B浸泡液制備的模板在PCR擴增后呈現(xiàn)的DNA靶帶清晰明亮，浸提效果最好，其次分別為樣品PDA培養(yǎng)液、LB培養(yǎng)液、磷酸緩沖液，3次重復的結果一致。樣品浸泡時間篩選的結果顯示(圖2)，浸泡2 h和5 h均未檢出擴增產(chǎn)物，說明浸泡時間過短；但是浸泡時間超過12 h，也未檢出目的片段，這可能是由于浸泡時間過長導致植物色素、多元酚等干擾物質(zhì)的量增多，從而抑制了PCR擴增反應。當樣品浸泡8 h、12 h時，PCR檢測效果均較好，為了達到快速檢測的目的，最終確定樣品浸泡時間為8 h。

M.100 bp DNA Ladder;1.磷酸緩沖液；2.金氏B浸泡液；3.PDA培養(yǎng)液；4.LB培養(yǎng)液；5.陽性對照；6.清水空白對照；7.不含模板的陰性對照

M.100 bp DNA Ladder；1～5.樣品浸泡時間依次為2 h、5 h、8 h、12 h、16 h；6.陽性對照；7.清水空白對照；8.不含模板的陰性對照

2.2 PCR反應中化學增強劑的作用效果

加入甘油或BSA后，比未加化學增強劑的PCR擴增條帶明顯變粗、變亮，增效顯著；但白明膠對PCR擴增沒有增效作用(圖3)。從擴增的特異性電泳條帶結果可見，當化學增強劑為φ=10%的甘油與50 μg/mL的BSA時，增效沒有顯著性差異，但由于BSA價格昂貴，因此確定選用甘油作為增強劑。進一步檢測甘油體積分數(shù)對PCR反應效果的影響，結果顯示φ=10%的甘油增效最明顯(圖4)。

2.3 無癥帶菌獼猴桃樣品的處理優(yōu)化結果

采用4種不同方式處理無癥帶菌獼猴桃樣品，結果顯示，加入濃度為3 mg/mL的Na2SO3并濃縮后的PCR檢測效果最好(圖5)。

2.4 模板量對PCR擴增的影響

按照文中“1.7”的方法制備潰瘍病檢測樣品模板，通過加入不同模板量，比對PCR擴增檢測效果，結果顯示當模板量為1 μL、1.5 μL和2 μL時均可擴增出目標靶帶，其中模板量為1 μL～ 2 μL效果最好；而模板量為2.5 μL、3 μL及3.5 μL時均未擴增出DNA靶帶(圖6)。

M.100 bp DNA Ladder；1.無化學增強劑對照；2.φ=10%甘油；3.50 μg/mL BSA；4.0.1 mg/mL白明膠；5.菌液陽性對照；6.清水空白對照；7.不含模板的陰性對照

M.100 bp DNA Ladder;1.不含甘油；2～5.甘油體積分數(shù)依次為5%，10%，15%，20%；6.陽性對照；7.清水空白對照；8.不含模板的陰性對照

2.5 PCR檢測方法在獼猴桃不同發(fā)育期的應用效果

采用優(yōu)化后的PCR方法檢測獼猴桃不同發(fā)育期的無癥帶菌枝條和葉片(或花苞)，結果顯示(圖7)，獼猴桃樹孕蕾至開花期的新生枝條，獼猴桃潰瘍病的檢出率最高，可達91.8%，同時期的無癥帶菌葉片檢出率則為63.6%；獼猴桃其他發(fā)育時期不同檢測部位的檢出率均在63.6%以下。因此，在開展田間病害調(diào)查時，建議主要檢測對象為孕蕾至開花期獼猴桃新生枝條，能夠更加快速、準確、容易地檢出致病菌，有利于提前預警并開展相關病害防治工作。

M.100 bp DNA Ladder;1～2.處理Ⅰ；3～4.處理Ⅱ；5～6.處理Ⅲ；7～8.處理Ⅳ；9.陽性對照； 10.清水空白對照；11.不含模板的陰性對照

M.100 bp DNA Ladder，1～6.每個反應體積(25 μL)的模板量依次為1.0 μL,1.5 μL,2.0 μL,2.5 μL,3 μL,3.5 μL；7.陽性對照；8.清水空白對照；9.不含模板的陰性對照

圖7 PCR方法檢測獼猴桃不同發(fā)育期無癥帶菌樣本Fig.7 PCR method for detection of virgin bacteria at different developmental stages

3 討論與結論

獼猴桃潰瘍病是由丁香假單胞菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidae)引起的細菌性、毀滅性病害，栽培種植過程中缺乏有效的檢疫措施，通常在表現(xiàn)癥狀時才開始防治，很難有效控制病情，且由于病原菌清除不徹底造成菌體潛伏，從而逐年發(fā)病且越來越嚴重[13-15]。近年來，分子生物學技術在植物病害田間檢測中的應用越來越多，其中PCR檢測方法具有特異性好、實驗成本相對較低、反應時間短等優(yōu)點，更加適合在田間開展病害的快速診斷[16-17]。獼猴桃潰瘍病為植株系統(tǒng)性病害，具有較強的隱蔽性，借助分子檢測方法有助于及早發(fā)現(xiàn)病菌潛伏期的獼猴桃潰瘍病株，并提前采取有效措施進行病害防控[7,18]。

本研究通過對田間采集的無癥帶菌獼猴桃樣品的PCR檢測條件進行優(yōu)化，并采用特異性引物擴增細菌16S-23S rDNA ITS部分區(qū)域，可有效檢出獼猴桃潰瘍病的致病菌。張慧琴等[19]、伊春峰等[20]采用基于特異性引物擴增的PCR檢測方法鑒定了已分離純化的獼猴桃潰瘍病致病菌，與本研究擴增的目的片段結果一致。但是與文獻中報道的針對分離純化菌株進行鑒定不同，本研究中的檢測樣品為田間采集的獼猴桃植株活體樣本，通過檢測條件優(yōu)化，能夠直接、快速、準確判斷無病癥表現(xiàn)的獼猴桃植株是否已被潰瘍病致病菌侵染，因此，對指導PCR特異性分子檢測在田間的應用更具有實際參考價值。

對田間采集的樣本進行PCR模板制備時要排除多種因素的影響：(1)干擾物的抑制 在樣本浸泡液中加入濃度為3 mg/mL Na2SO3能夠降低植物色素和多元酚等PCR反應抑制物的干擾，特別是濃縮后的浸提液對PCR擴增效果明顯提高，這與靶細菌濃縮導致的模板量增大有關，但是隨著模板量逐漸增加，PCR反應體系中的植物色素、多元酚等抑制物也相應增多，對PCR擴增反應產(chǎn)生一定的抑制，因此要適當控制實測中的模板量。(2)植株生長期 影響無癥帶菌樣本檢出率的最顯著因素是獼猴桃的生長期，研究結果顯示，在獼猴桃孕蕾至開花期的新生枝條中潰瘍病致病菌的檢出率最高，是最佳的田間診斷時期，對提前有效檢出帶病植株并盡早針對獼猴桃潰瘍病實施田間防控，特別是對新建園區(qū)，具有重要意義。