于亞輝， 陳沁雯， 李曉婷， 方婷

(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

雞肉是中國最受歡迎的肉類產(chǎn)品之一。2017年中國雞肉產(chǎn)量約為1 160萬t，2018年則增長到1 215萬t，年增長產(chǎn)量4.7%，約占全球雞肉產(chǎn)量的12.86%。雞肉加工有多種方式，其中燉湯最為普遍。雞湯中不僅含有肌肽、肌酸等具有生理活性的小分子化合物，還富含維生素、礦物質(zhì)、游離氨基酸和蛋白質(zhì)等物質(zhì)，易于被人體吸收，具有營養(yǎng)豐富且風(fēng)味獨特的特點[1-4]。雞肉富含蛋白質(zhì)且脂肪含量較低，經(jīng)蛋白酶酶解后產(chǎn)物以多肽和L型游離氨基酸為主。雞肉酶解液含有與雞湯相似的滋味與營養(yǎng)物質(zhì)，同時制作簡單，不需要經(jīng)過熬制等復(fù)雜工序，經(jīng)處理后可以作為保健品原料和鮮味調(diào)料，具有較高的營養(yǎng)價值和工業(yè)利用價值[5-8]。通過對不同品種雞熬制的雞湯味道研究發(fā)現(xiàn)，游離氨基酸的種類和含量是影響滋味的重要原因[9]。因此，對比分析雞湯和雞肉酶解液的組成成分和相對含量，尋找合適的氨基酸比例，將有助于熱反應(yīng)雞肉味香精等咸味香精的開發(fā)和制備，對雞肉酶解液的實際應(yīng)用十分重要。近年來相關(guān)研究多以雞肉酶解工藝優(yōu)化為主。安攀宇等[10]通過優(yōu)化雞肉蛋白酶酶解工藝，得到的酶解液水解度高達(dá)32.71%。肖作兵等[11]結(jié)合美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味評價，采用雙指標(biāo)響應(yīng)面法進行優(yōu)化，制備出風(fēng)味較佳的雞肉風(fēng)味基料。在酶解產(chǎn)物研究方面，邱燕翔等[12]發(fā)現(xiàn)經(jīng)酶解后的雞肉酶解液中游離氨基酸跟寡肽可達(dá)99.85%。陳海濤等[13]、張永生等[14]發(fā)現(xiàn)不同酶解條件下雞肉蛋白酶解液對熱反應(yīng)產(chǎn)物的呈味特性影響較大。侯佰慧等[15]研究了熱處理對雞肉酶解液中氨基酸組成的影響及熱反應(yīng)中呈味物質(zhì)的變化，發(fā)現(xiàn)隨著加熱時間的延長，雞肉酶解液中游離氨基酸和呈味氨基酸含量增加，其中苦味氨基酸較高。而在與雞湯成分對比中，陳怡穎等[16]通過將動物蛋白酶和復(fù)合蛋白酶分步混合酶解雞肉后發(fā)現(xiàn)，雞肉酶解液中游離氨基酸總量高于雞湯，同時雞湯中鮮味和甜味氨基酸比例較高，而雞肉酶解液中苦味氨基酸比例較高。但該研究采用的是分步混合酶解法，并未對不同品種蛋白酶的酶解產(chǎn)物分別進行對比分析，且所用蛋白酶的種類只有2種，種類較少，限制了雞肉酶解液的應(yīng)用范圍。因此,本研究采用6種蛋白酶對雞肉進行酶解，然后基于主成分分析法(principal component analysis,PCA)對雞湯及不同雞肉酶解液中游離氨基酸組成及相對含量進行對比分析，旨在擴展雞肉蛋白酶解液的應(yīng)用范圍，并為其在熱反應(yīng)咸味香精等實際生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

雞胸肉購自福州永輝超市。復(fù)合蛋白酶(1.667 mkat·g-1)、木瓜蛋白酶(13.336 mkat·g-1)、堿性蛋白酶(3.334 mkat·g-1)、風(fēng)味蛋白酶(0.333 4 mkat·g-1)、中性蛋白酶(1.000 2 mkat·g-1)均購自北京索萊寶試劑公司；動物蛋白酶(5.001 mkat·g-1)購自南寧龐博生物工程有限公司；孔徑0.45 μm濾膜購自天津津騰實驗設(shè)備有限公司；其余試劑購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的制備 雞湯的制備：選用新鮮雞胸肉，剔去殘留的結(jié)締組織及脂肪組織，清洗干凈后切丁(長2 cm，寬2 cm)，經(jīng)100 ℃沸水焯后放入高壓鍋(MY-CS50C，美的電器)中按照m(雞肉)∶V(H2O)=1∶4加水，在燉湯模式下加熱2.5 h[17]，之后冷卻撈掉雞肉并撇去懸浮物，在2 ℃下置于高速冷凍式離心機(Centrifuge 5430R，德國艾本德股份公司)，6 000 r·min-1離心15 min，取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后保存待測。

酶解液的制備：選用新鮮雞胸肉，剔去殘留的結(jié)締組織及脂肪組織，清洗干凈后切丁(長2 cm，寬2 cm)，按照m(雞肉)∶V(H2O)=1∶4加水后經(jīng)破壁機(JYL-Y99，九陽電器)打漿，放入燒杯內(nèi)分別加入6種蛋白酶(動物蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶)，根據(jù)酶制劑廠家提供的酶解條件，選定酶解的最適pH與最適溫度，在恒溫磁力攪拌器(DF-101SZ，鞏義市豫華儀器有限責(zé)任公司)進行酶解，酶解時間持續(xù)6 h，具體設(shè)置見表1。酶解后升溫至100 ℃保持10 min，得到雞肉酶解液，在2 ℃下置于高速冷凍式離心機，6 000 r·min-1離心15 min，取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后保存待測。

表1 不同蛋白酶酶解最適pH與最適溫度Table 1 Optimum pH and temperature of enzymolysis with different proteases

1.2.2 不同蛋白酶對雞肉酶解進程曲線 為了對比分析常用蛋白酶對雞肉的酶解能力及特性，設(shè)定加酶量為0.9%[13]。酶解試驗條件見1.2.1，總酶解時間持續(xù)6 h，每隔1 h測定水解度，建立不同蛋白酶的酶解進程曲線，確定酶解時間。

1.2.3 雞肉蛋白酶解液水解度的測定 參考陳海濤等[13]的方法，按照下式計算水解度：

(1)

式中:N0為總氮含量，N1為酶解前游離氨基態(tài)氮含量，N2為酶解后游離氨基態(tài)氮含量。

1.2.4 游離氨基酸的測定 采用全自動氨基酸分析儀(L-8900，日立高新技術(shù)公司)檢測游離氨基酸[18]。檢測參數(shù)：日立離子交換樹脂(4.6 mm×60.0 mm)；測定波長為570、440 nm；緩沖液流速0.5 mL·min-1；柱溫20～85 ℃；進樣量20 μL。測時樣品各稀釋10倍，平行測定3次?；旌蠘?biāo)樣包括氨基酸、小肽及含氮小分子物質(zhì)，共38種，其中游離氨基酸17種，其余21種。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個樣品進行3次測定，游離氨基酸含量表示為出峰面積，相對含量取平均值。采用Unscrambler X 10.4進行差異性及主成分分析，其余采用Origin 2017制圖。

根據(jù)峰面積大小來確定組成成分及游離氨基酸的相對含量，各樣品的組成成分及游離氨基酸采用相對含量進行對比分析，具體公式如下：

(2)

式中：P為相對含量，Si為各樣品組成成分物質(zhì)峰面積，S為各樣品總峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶對雞肉酶解進程曲線

6種蛋白酶對雞肉的酶解能力如圖1所示。隨著時間的增加，蛋白酶水解度上升，增長速度呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，在酶解4 h后水解度的增長速度逐漸變慢。堿性蛋白酶酶解雞肉的水解度在5 h時出現(xiàn)了大幅增長，推測是在進一步酶解過程中出現(xiàn)了含有更多絲氨酸殘基和磷酸化絲氨酸殘基的多肽序列，釋放出更多的氨基酸和多肽。綜合考慮蛋白酶在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用情況及其他酶的酶解情況，本文選定4 h為目標(biāo)酶解時間進行研究。此時動物蛋白酶水解度為19.21%，木瓜蛋白酶水解度為16.96%，風(fēng)味蛋白酶水解度為13.65%，復(fù)合蛋白酶水解度為18.52%，堿性蛋白酶水解度為14.06%，中性蛋白酶水解度為11.62%，這表明，動物蛋白酶的酶解效果最好，其次為復(fù)合蛋白酶，而中性蛋白酶的酶解效果最差。

圖1 不同蛋白酶對雞肉酶解進程曲線Fig.1 Process curves of different proteases on chicken enzymolysis

2.2 雞湯及雞肉酶解液組成成分分析

由表2可知，雞湯及雞肉酶解液中均檢測出大量游離氨基酸及小分子物質(zhì)，但組成成分與相對含量均有所差異。對比組成成分可知，雞湯中檢測到33種物質(zhì)，酶解液中共檢測到36種物質(zhì)。磷酸乙醇胺和胱硫醚是雞湯中特有的物質(zhì)，而磷酸絲氨酸、?；撬帷⒓“彼?、Β-氨基異丁酸和鵝肌肽則在雞湯中未檢測到。與雞肉酶解液相比，雞湯中尿素、肌肽和羥脯氨酸較多，而賴氨酸較少，差異顯著(P<0.05)。對比相對含量可知，雞湯中γ-氨基丁酸相對含量最高為7.64%，精氨酸相含量最少為0.92%；動物蛋白酶酶解液中賴氨酸相對含量最高為13.67%，肌氨酸相對含量最少為0.09%；復(fù)合蛋白酶酶解液中亮氨酸相對含量最高為11.10%；尿素相對含量最少為0.03%；木瓜蛋白酶酶解液中氨相對含量最高為14.35%，尿素相對含量最少為0.19%；堿性蛋白酶酶解液中氨相對含量最高為7.10%，肌氨酸相對含量最少為0.01%；風(fēng)味蛋白酶酶解液中1-甲基組氨酸相對含量最高為18.24%，苯丙氨酸相對含量最少為0.16%；中性蛋白酶酶解液中1-甲基組氨酸相對含量最高為14.52%，γ-氨基丁酸相對含量最少為0.06%。

表2 雞湯及雞肉酶解液中組成成分及相對含量

2.3 雞湯及雞肉酶解液中游離氨基酸呈味特性分析

游離氨基酸是影響雞湯和雞肉酶解液風(fēng)味的重要因素，其呈味特性由游離氨基酸自身結(jié)構(gòu)決定，主要分為鮮味、甜味和苦味3類[19-20]。在雞湯和雞肉酶解液組成成分中，選擇17種游離氨基酸進行對比分析，并根據(jù)峰面積得到各游離氨基酸在17種游離氨基酸中的相對含量。由表3可知，17種游離氨基酸包括鮮味氨基酸2種，甜味氨基酸5種，苦味氨基酸9種，其他氨基酸1種。雞湯與雞肉酶解液中呈味氨基酸相對含量差異較大。鮮味氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸，是影響樣品鮮味的關(guān)鍵物質(zhì)，雞湯中鮮味氨基酸相對含量為13.31%；甜味氨基酸相對含量為27.57%，其中丙氨酸、絲氨酸及蘇氨酸含量較高；苦味氨基酸相對含量為56.71%，其中組氨酸含量較高，達(dá)到13.77%；胱氨酸由于含有二硫鍵，會產(chǎn)生令人不悅的味道，在雞湯中相對含量較低，為2.41%。動物蛋白酶酶解液中鮮味氨基酸與雞湯中相對含量最接近，為13.11%，但是谷氨酸與天冬氨酸相對含量與雞湯相比差異顯著(P<0.05)；復(fù)合蛋白酶酶解液中鮮味氨基酸同樣與雞湯中相對含量相近，為10.95%，且谷氨酸與天冬氨酸相對含量與雞湯相比差異不顯著(P>0.05)；木瓜蛋白酶酶解液中鮮味氨基酸相對含量略高于雞湯，相對含量為14.03%，谷氨酸與天冬氨酸相對含量與雞湯相比差異不顯著(P>0.05)，但胱氨酸相對含量為10.93%；堿性蛋白酶酶解液中，鮮味氨基酸相對含量最少，為5.35%；風(fēng)味蛋白酶酶解液中鮮味氨基酸及甜味氨基酸的相對含量較高，達(dá)到18.98%及43.59%，但苦味氨基酸相對含量僅為29.51%，是雞湯和雞肉酶解液中最低的；中性蛋白酶酶解液中苦味氨基酸相對含量較高為66.88%，但胱氨酸相對含量僅為0.32%，是雞湯與雞肉酶解液中最低的。

2.4 雞湯及雞肉酶解液中游離氨基酸的PCA分析

主成分分析法是重要的降維分析方法，在對多樣本復(fù)雜數(shù)據(jù)進行降維后，可使用包含主要信息的主成分來替代原始數(shù)據(jù)進行分析，在原始數(shù)據(jù)不失真的條件下可反映出較多的樣本信息，以期對數(shù)據(jù)進行全面分析[21-22]。雞湯與不同雞肉酶解液中氨基酸數(shù)目與相對含量較為離散，對表3數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，然后采用PCA分析，對不同樣品間的差異性及相似性進行評價，結(jié)果如圖2所示。第一主成分(PC-1)和第二主成分(PC-2)貢獻率分別占53%和21%，累計貢獻率為74%，包含了大部分原始信息，符合主成分分析的需要。由圖2-A可知，樣品F在第一象限，樣品A、D、E在第二象限，樣品C在第三象限，樣品B、P在第四象限。不同的游離氨基酸聚集在不同的樣品附近，表明不同的樣品中游離氨基酸的組成具有一定的差異。由圖2-B可知，與樣品F位于同一象限的游離氨基酸有苯丙氨酸和脯氨酸，與樣品A、D、E位于同一象限的游離氨基酸有甘氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、胱氨酸和賴氨酸，與樣品C位于同一象限的游離氨基酸有纈氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸和酪氨酸，與樣品B、P位于同一象限的游離氨基酸有異亮氨酸、絲氨酸、組氨酸、亮氨酸和蘇氨酸。相比較其他樣品，樣品P和B位于同一象限，游離氨基酸種類和相對含量差異相對較小，同時呈味特性類似，因此雞湯與復(fù)合蛋白酶酶解液具有相似的滋味。

注：A為分?jǐn)?shù)圖，表示每個主成分的權(quán)重；B為相關(guān)載荷圖，表示各個自變量的加權(quán)關(guān)系。

3 結(jié)論與討論

本研究采用氨基酸自動分析儀對雞湯中的游離氨基酸和其他小分子物質(zhì)進行了分析，除檢測到多種游離氨基酸外，還檢測到肌肽等小分子活性物質(zhì)的存在，與何蓉蓉等[5]研究結(jié)果一致。酶解是制備功能性蛋白質(zhì)、活性肽及游離氨基酸的重要途徑，蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后營養(yǎng)價值更高，在生物醫(yī)藥、食品等行業(yè)有著廣泛應(yīng)用。蛋白酶具有專一性，不同蛋白酶對雞肉酶解液中游離氨基酸及小分子物質(zhì)的組成成分產(chǎn)生影響。本研究選用6種不同的蛋白酶對雞肉進行酶解4 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：動物蛋白酶的酶解效果最好，水解度為19.21%，其次為復(fù)合蛋白酶，水解度為18.52%，而中性蛋白酶的酶解效果最差，為11.62%。由于這類蛋白酶中包括內(nèi)切酶、外切酶和復(fù)合酶，作用機理都較為復(fù)雜，但整體上具有多作用位點的復(fù)合蛋白酶對雞肉的酶解效果較好。

本研究對比分析了雞湯和不同雞肉酶解液中組成成分和相對含量，發(fā)現(xiàn)雞肉酶解液中游離氨基酸及小分子物質(zhì)總量高于雞湯。從雞湯中檢測到33種物質(zhì)，在雞肉酶解液中共檢測到36種物質(zhì)。此外，與雞肉酶解液相比，雞湯中組氨酸、尿素、肌肽和羥脯氨酸較多，而賴氨酸較少，差異具有顯著性(P<0.05)。雞肉經(jīng)煮制后，蛋白質(zhì)發(fā)生熱降解，肽酶作用于肽鏈，催化出游離氨基酸及小肽，由于蛋白酶的作用位點不同，以及從雞肉中自然浸出的物質(zhì)不同，使得雞湯與雞肉酶解液中物質(zhì)相對含量具有差異性。對雞湯和雞肉酶解液中的17種游離氨基酸進行對比分析，發(fā)現(xiàn)組氨酸、谷氨酸及酪氨酸是雞湯中主要的游離氨基酸。呈味氨基酸種類及相對含量的不同會對樣品滋味產(chǎn)生影響，結(jié)合呈味氨基酸的閾值可確定呈味氨基酸對樣品滋味形成的貢獻[23-24]。雞湯中呈鮮味和呈甜味氨基酸占總游離氨基酸的40.88%，賦予雞湯一定的鮮甜味；同時苦味氨基酸占總游離氨基酸的56.71%，與雞肉酶解液相比相對含量較低，這也決定了雞湯與雞肉酶解液的滋味不同。動物蛋白酶酶解液中，呈鮮味和呈甜味氨基酸相對含量較高，為46.13%，苦味氨基酸相對含量較少，為43.04%，推測是因為動物蛋白酶通常由蛋白內(nèi)切酶、外切酶和風(fēng)味酶等組成，內(nèi)切酶作用于肽鏈的中間部分，外切酶作用于肽鏈的末端從而使氨基酸切出游離出來，風(fēng)味酶則對呈味氨基酸進行調(diào)節(jié)可優(yōu)化酶解液風(fēng)味，因此動物蛋白酶對蛋白質(zhì)整體酶解效果較好，有效利用率較高且風(fēng)味也較好。復(fù)合蛋白酶是桿菌蛋白酶復(fù)合物，也是內(nèi)切桿菌蛋白酶的復(fù)合體，其酶解液中苦味氨基酸相對含量為60.63%，與雞湯中的56.71%相差最小。木瓜蛋白酶酶解液中胱氨酸相對含量較高為10.93%，可能原因是木瓜蛋白酶是植物蛋白酶，屬于含巰基肽鏈內(nèi)切酶，可以特異性切開包含巰基的肽鏈。堿性蛋白酶酶解液中絲氨酸相對含量較高為13.82%，可能原因是堿性蛋白酶是由地衣芽孢桿菌經(jīng)發(fā)酵而提煉出來的蛋白水解酶，是絲氨酸型的內(nèi)切蛋白酶。風(fēng)味蛋白酶酶解液中呈鮮味和呈甜味氨基酸占總游離氨基酸的62.57%，是所有樣品中最高的，苦味氨基酸僅占29.51%，說明風(fēng)味蛋白酶可以有效酶解雞肉中的苦味多肽改善酶解液風(fēng)味，提高蛋白質(zhì)的利用率。中性蛋白酶酶解液中呈苦味氨基酸占總游離氨基酸的66.88%，是所有樣品中最高的，推測是中性蛋白酶切開了氨基端由疏水性或其他氨基殘基構(gòu)成的肽鍵，尤其對苯丙氨酸等疏水性大分子氨基酸組成的肽鍵效果較好，而苯丙氨酸等疏水性氨基酸的暴露會增加苦味肽的疏水度，使得酶解液苦味增加。

對雞湯和不同雞肉酶解液中17種游離氨基酸進行主成分分析，發(fā)現(xiàn)樣品分布較為離散，雞湯與雞肉酶解液在游離氨基酸種類上差異較小，但在游離氨基酸相對含量上差異顯著，這對利用酶解液制備熱反應(yīng)雞肉香精產(chǎn)生了影響。合適的氨基酸比例是制備熱反應(yīng)雞肉味香精的重要條件，因此選取合適的蛋白酶進行酶解，以得到所需氨基酸相對含量較高的酶解液就十分重要。對比分析雞湯與雞肉酶解液中組成成分的不同，發(fā)現(xiàn)復(fù)合蛋白酶酶解的雞肉酶解液中游離氨基酸種類和相對含量與雞湯差異最小，具有相似的滋味，這為在實際應(yīng)用中選擇合適的目標(biāo)酶，利用雞肉酶解液制備雞肉味熱反應(yīng)型香精提供了理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。