賈保順，孫祖正，張錦中，朱學杰

(1.河南省煙草公司周口市公司，河南 周口 466000；2.河南省煙草公司南陽市公司，河南 南陽 473000)

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2018年在河南省周口市商水縣郝崗鄉(xiāng)(東經(jīng)114°29′，北緯33°70′)進行。該區(qū)屬于亞熱帶向暖溫帶過渡區(qū)，年平均氣溫14.5 ℃，年平均日照2 094.9 h，年平均降雨量785.1 mm。選用當?shù)刂髟钥緹熎贩NK 326和NC 71為試驗材料，煙苗于2018-05-07移栽，單株有效葉數(shù)18～20片，按當?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)進行田間管理。試驗地土壤為黃褐土，土壤基本理化性質(zhì)：有機質(zhì)14.29 g·kg-1，堿解氮71.39 mg·kg-1，速效磷13.79 mg·kg-1，速效鉀105.13 mg·kg-1，pH值7.19。煙田施用肥料為煙草專用復合肥，m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=1∶1∶2，煙田施氮量為75 kg·hm-2，由周口市煙草公司提供。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，各個品種重復3次，共45個小區(qū)，每個小區(qū)36株煙，烤煙行株距1.2 m×0.5 m。試驗設(shè)置5個取樣時期，自煙葉打頂10 d(即移栽后70 d)后開始取樣，隨后每隔10 d取樣1次，共取樣5次，移栽后90 d中部葉進入成熟階段。每次取樣時選取小區(qū)內(nèi)長勢均勻一致的煙株，試驗部位為中部葉(10～12葉位)。每個品種各選5株，取樣時選取大小均勻的煙葉，去除葉片主脈，取第7至第8支脈部分葉肉組織，混合樣品，每份樣品約6 g，放于液氮中速凍后，于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于氮代謝酶活性和基因表達量測定。另取一部分煙葉于105 ℃下殺青25 min，然后再65 ℃烘干，研磨后過60目篩，用于化學成分測定。每個處理進行3次重復。

1.3 測定項目及方法

1.3.2 氮代謝關(guān)鍵酶活性測定 谷氨酰胺合成酶(GS)活性測定參照O′NEAL等[15]的方法，以1 mg·min-1粗蛋白質(zhì)催化產(chǎn)生的γ-谷氨酰異羥肟酸數(shù)量來表示；谷氨酸脫氫酶(GDH)活性測定參照TURANO等[16]的方法，以每分反應混合液于30 ℃減少的還原型輔酶Ⅰ(NADH)數(shù)量(μmol)來表示；硝酸還原酶(NR)活性測定采用活體法，以單位樣品單位時間內(nèi)產(chǎn)生的亞硝酸含量來表示；谷氨酸合成酶(GOGAT)活性參照鄭朝峰等[17]的方法。

1.3.3 氮代謝相關(guān)基因表達分析 采用Trizol法提取用品內(nèi)總RNA，通過隨機引物法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA[18]。根據(jù)GenBank公布的氮代謝相關(guān)基因NR，GS和GOGAT的序列，采用Roche LCPDS2設(shè)計引物，引物列表見表1。以烤煙核糖體蛋白質(zhì)基因Nt25[19]為內(nèi)參基因進行qRT-PCR。試驗結(jié)果采用2-ΔΔCt算法[20]進行分析。每個樣品進行3次重復。

表1 氮代謝相關(guān)基因qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequence for qRT-PCR of nitrogen metabolism related genes

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010進行整理和作圖，采用SPSS 22.0軟件進行Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 烤煙成熟期含氮化合物含量的變化

如圖1-a所示，烤煙K 326和NC 71葉片銨濃度在葉片成熟期先升高后降低，移栽后80 d，2個品種烤煙葉片銨濃度達到峰值，其葉片銨濃度分別為7.09和7.83 mmol·L-1，隨后其葉片銨濃度快速下降并趨于穩(wěn)定。如圖1-b所示，自移栽后70 d開始，K 326和NC 71煙葉可溶性蛋白質(zhì)含量逐漸降低，但整個成熟期NC 71葉片可溶性蛋白質(zhì)含量均略高于K 326。與葉片銨濃度相比，烤煙成熟期葉片總氮含量變化波動較小(圖1-c)，從移栽后70 d起，葉片總氮含量緩慢下降，并于移栽后100 d逐漸穩(wěn)定，此時K 326和NC 71葉片總氮含量分別為29.2和28.9 g·kg-1。如圖1-d所示，烤煙成熟期葉片游離氨基酸含量與可溶性蛋白質(zhì)含量變化趨勢相似，成熟期K 326和NC 71游離氨基酸含量呈不同程度下降的變化趨勢，葉片成熟時(移栽后90 d)，其游離氨基酸含量分別為7.95和8.12 mg·g-1。

圖1 烤煙成熟期含氮化合物含量動態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of nitrogen compounds content in flue-cured tobacco at mature stage

2.2 烤煙成熟期氮代謝關(guān)鍵酶活性的變化

如圖2-a所示，在K 326和NC 71煙葉中，GS活性具有相同的動態(tài)變化，成熟期GS活性呈先升高后降低的變化趨勢。K 326和NC 71葉片GS活性在移栽后80 d達到最高，分別為197.8和221.3 nmol·mg-1·min-1，之后GS活性逐漸下降。2個品種烤煙GDH和GOGAT活性與GS活性變化趨勢相同(圖2-b,c)，均呈單峰波動趨勢，且在移栽后80 d其GDH和GOGAT活性最高；與GS活性不同的是，K 326和NC 71葉片GDH活性在移栽后100 d快速降低，移栽后110 d時，其GDH活性分別為57.5和68.9 nmol·mg-1·min-1。與GS，GDH和GOGAT活性變化不同，K 326和NC 71葉片內(nèi)NR活性在成熟期呈逐漸降低的變化趨勢(圖2-d)，葉片成熟時(移栽后90 d)，兩個品種烤煙NR活性分別為1.99和2.24 μg·g-1·h-1。綜合分析成熟期K 326和NC 71氮代謝關(guān)鍵酶活性變化可知，成熟期NC 71氮代謝關(guān)鍵酶活性均略高于K 326。

圖2 烤煙成熟期氮代謝關(guān)鍵酶活性的變化Fig.2 Changes of key enzymes activities of nitrogen metabolism in flue-cured tobacco at mature stage

2.3 烤煙成熟期氮代謝關(guān)鍵酶基因表達量的變化

如圖3所示，通過對烤煙K 326和NC 71成熟期煙葉氮代謝關(guān)鍵酶基因(NtNR，NtGS，NtGOGAT)相對表達量的分析發(fā)現(xiàn)，煙葉成熟期NtNR基因相對表達量呈逐漸降低的變化趨勢，移栽100 d后，NtNR基因相對表達量趨于穩(wěn)定。K 326和NC 71在移栽后80 d具有較高的NtGS基因相對表達量，之后其基因相對表達量快速下調(diào)。NtGOGAT基因相對表達量與NtGS基因相對表達量變化相似，呈先上升后下降的單峰波動變化，移栽后80 d之后，其基因相對表達量逐漸下調(diào)。與NtGS基因表達量相比，煙葉成熟期NtGOGAT基因相對表達量較低。自移栽后90 d起，K 326與NC 71葉片NtGOGAT基因相對表達量差異不顯著。

2.4 烤煙成熟期氮代謝酶活性、基因表達量與含氮化合物的相關(guān)性

如表3所示，分析了烤煙成熟期氮代謝酶活性與基因表達量之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，烤煙成熟期氮代謝關(guān)鍵酶基因相對表達量與酶活性之間呈正相關(guān)水平，NtNR與NR活性之間相關(guān)性達顯著水平；NtGS與各酶活性之間相關(guān)性均達到顯著水平；NtGOGAT與GS，GOGAT活性之間呈極顯著正相關(guān)水平，與GDH之間呈顯著正相關(guān)水平。

圖3 烤煙成熟期氮代謝關(guān)鍵酶基因表達量的動態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of gene expression of key enzymes of nitrogen metabolism in flue-cured tobacco at mature stage

表2 烤煙成熟期氮代謝酶活性及基因表達量與含氮化合物的相關(guān)性Table 2 Correlation between nitrogen metabolic enzyme activity and gene expression and nitrogen compounds in flue-cured tobacco at mature stage

表3 烤煙成熟期氮代謝酶活性與基因表達量的相關(guān)性Table 3 Correlation between nitrogen metabolic enzyme activity and gene expression in flue-cured tobacco at mature stage

3 結(jié)論與討論