田 勇，李見春，李婷婷，侯方燕

（1. 蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，安徽 蚌埠 233000； 2. 蚌埠醫(yī)學院藥學院，安徽 蚌埠 233000）

富馬酸喹硫平（QF）是經(jīng)典的第2 代抗精神病藥物，主要通過拮抗中樞D2受體和5-HT2受體發(fā)揮作用，用于治療精神病療效佳，且藥物安全系數(shù)較高，對精神分裂癥的療效肯定，同時對狂躁癥也有一定療效。目前，市場多為片劑，口服易產(chǎn)生心悸、嗜睡、頭暈、食欲不振和便秘等不良反應［1-2］。脂質(zhì)立方液晶（LCNP）是兩親性聚合物，分散于水溶液時可自發(fā)組裝形成一種新的分散體系，能包封不同極性的藥物［3］。立方液晶的穩(wěn)定性優(yōu)于脂質(zhì)體，進入人體后受到免疫系統(tǒng)的干擾較少［4-5］。對于溶解性較差的藥物，立方液晶內(nèi)部獨特的立方相結(jié)構(gòu)可包載各種不同極性的藥物，顯著增加難溶性藥物的生物利用度，減少毒副作用［6-7］。本研究中將富馬酸喹硫平制備成立方液晶納米粒，以降低喹硫平的不良反應，同時提高生物利用度。為確保富馬酸喹硫平立方液晶（QF-LCNP）具有較高的包封率，對QF-LCNP 的制備工藝進行了優(yōu)化?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Nano-ZS90 型粒度檢測儀（英國Marlven 公司）；JN-04HCF 型高壓均質(zhì)機（聚能生物科技公司）；Milli-A10 型純水機（英國Milibol 公司）；TGR16-WJ 型高速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；TB5210FB 型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限責任公司，功率為180 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

甘油單油酸酯（上海Boilmen 公司，批號為1921036）；泊 洛 沙 姆407（上 海Sigma 公 司，批 號 為163223）；甲醇、乙腈（色譜純，國藥集團，批號為176331）；富馬酸喹硫平（成都貝斯特股份有限公司，批號為131227FM，含量為99.4%）；透析袋（截留相對分子質(zhì)量為8 000～14 000，美國Viskase 公司，批號為201810112111）。

2 方法與結(jié)果

2.1 處方篩選與驗證

圖1 偏光顯微鏡觀察到的液晶形態(tài)

采用注入法制備QF-LCNP，將脂質(zhì)材料甘油單油酸酯（GMO）與穩(wěn)定劑泊洛沙姆407（F127）按一定比例混合，融化后攪拌成均一的澄明液體，向脂質(zhì)溶液內(nèi)逐滴加入同溫足量的蒸餾水，邊滴加邊攪拌，經(jīng)高壓均質(zhì)機后，形成立方液晶納米粒。參考文獻［8-9］，根據(jù)GMO 形成立方液晶的三元相圖，對形成立方液晶所需的原料比例進行初步篩選。取不同比例的GMO 和F127適量，精密稱定，60 ℃水浴融化，形成均一脂質(zhì)液，向脂質(zhì)液內(nèi)緩慢加入不同質(zhì)量分數(shù)（wt%）的蒸餾水，磁力攪拌10 min，通過高壓均質(zhì)機均質(zhì)一定次數(shù)，即得白色乳狀液。偏光顯微鏡觀察并記錄樣品形態(tài)。詳見圖1 和表1。

表1 GMO 與F127 的處方比例對液晶形態(tài)的影響

由圖1 可見，各液晶形態(tài)差異，層狀液晶為片狀雪花樣結(jié)構(gòu)，非液晶在偏光下呈現(xiàn)無序樣結(jié)構(gòu)，立方液晶的光學特性為各同向性，在偏光顯微鏡下無偏光，故呈現(xiàn)暗視野。由表1 可見，當含水量在較低區(qū)間（20%～40%）范圍內(nèi)時，大多為層狀液晶和非液晶形態(tài)，當含水量在較高區(qū)間（70%以上）范圍內(nèi)時，基本形成立方液晶，表明立方液晶的形成與含水量有關(guān)，同時GMO 與F127的比例也有一定影響，GMO 質(zhì)量比重越高，越易形成立方液晶，基本符合GMO 的三元相圖［10］。

2.2 處方工藝優(yōu)化

根據(jù)處方工藝的篩選與驗證，選擇影響藥物包封率較大的4 個因素：蒸餾水用量（mL，因素A），藥物占GMO 質(zhì)量比（因素B），甘油單油酸酯與F127 的質(zhì)量比（兩者總質(zhì)量為1 g，因素C），攪拌時間（min，因素D），將以上4 個因素設計成L9（34）的正交試驗，以QF-LCNP的包封率為考察指標，因素水平見表2，正交試驗結(jié)果見表3，方差分析見表4。由表2 可見，各因素對包封率的影響程度為C ＞A ＞B ＞D，因素A 及因素C 對包封率有顯著影響。故富馬酸喹硫平立方液晶的最佳處方工藝為A3B2C1D3，即富馬酸喹硫平投藥量為54 mg，蒸餾水為40 mL，甘油單油酸酯投藥量為900 mg，泊洛沙姆407 投藥量為100 mg，攪拌時間為18 min。

表2 富馬酸喹硫平立方液晶處方篩選的影響因素水平

表3 正交試驗結(jié)果

表4 包封率方差分析結(jié)果

2.3 制備工藝優(yōu)化

2.3.1 均質(zhì)壓力考察

高壓均質(zhì)機預熱10 min，用蒸餾水沖洗均質(zhì)機內(nèi)部，將恒溫水接通入均質(zhì)槽內(nèi)，均質(zhì)機內(nèi)槽保持恒溫，溫度設置為25 ℃，將QF-LCNP 放入高壓均質(zhì)機內(nèi)，固定均質(zhì)次數(shù)為5 次，調(diào)整均質(zhì)壓力，分別設為1 000，1 500，2 000，2 500 bar（1 bar=0.1 MPa），收集均質(zhì)后QF-LCNP，測定藥物的包封率及粒徑。結(jié)果見表5?？梢姡斁|(zhì)次數(shù)設為定值時，均質(zhì)壓力對富馬酸喹硫平包封率和平均粒徑影響較大，隨著均質(zhì)壓力的增高，QF-LCNP 的包封率和粒徑逐漸降低，當均質(zhì)壓力超過2 000 bar 時，粒徑下降不明顯。當均質(zhì)壓力過高時有可能會破壞一部分立方液晶的結(jié)構(gòu)，故選擇2 000 bar 作為制備富馬酸喹硫平立方液晶納米粒的最優(yōu)制備工藝。

表5 不同均質(zhì)壓力對包封率及粒徑的影響（n=3）

2.3.2 均質(zhì)次數(shù)考察

高壓均質(zhì)機預熱10 min，用蒸餾水沖洗均質(zhì)機內(nèi)部，將恒溫水接通入均質(zhì)槽內(nèi)，均質(zhì)機內(nèi)槽保持恒溫，溫度設為25 ℃，將QF-LCNP 放入高壓均質(zhì)機內(nèi)，設置均質(zhì)壓力為最優(yōu)1 500 bar，均質(zhì)次數(shù)分別為2，4，6，8 次，收集均質(zhì)后QF-LCNP，測定包封率及粒徑，結(jié)果見表6?？梢?，均質(zhì)次數(shù)對富馬酸喹硫平的包封率和平均粒徑均有影響，隨著均質(zhì)次數(shù)的增加，立方液晶納米粒的粒徑逐漸下降，當均質(zhì)次數(shù)超過6 次時，包封率有所降低，粒徑下降不明顯。故最終選擇循環(huán)次數(shù)為6 次作為最優(yōu)制備工藝條件。

表6 不同均質(zhì)次數(shù)對包封率及粒徑的影響（n=3）

2.4 制劑含量測定方法建立

2.4.1 色譜條件

色譜柱：Thermo C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（含0.5%三乙胺，冰醋酸調(diào)節(jié)pH 至6～8，78 ∶22，V/ V）；流速：1 mL/min；檢測波長：289 nm；柱溫：45 ℃；進樣量：20 μL。

2.4.2 溶液制備

取富馬酸喹硫平對照品0.5 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶，用甲醇稀釋并定容，4 ℃冰箱保存，備用。臨用前用甲醇稀釋。取富馬酸喹硫平立方液晶納米粒5 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，0.22 μm 濾膜過濾，即得。

2.4.3 方法學考察

標準曲線繪制：精密量取富馬酸喹硫平對照品貯備液，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為1，2，4，8，16，32，64，128 μg / mL 的系列標準溶液。按擬訂色譜條件進樣20 μL，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=28 612 X +29 549，R2=0.999 7（n=8）。結(jié)果表明，富馬酸喹硫平質(zhì)量濃度在1～128 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密量取富馬酸喹硫平對照品貯備液，配置低、中、高質(zhì)量濃度（分別為4，16，64 μg/mL）的對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD 為1.32%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：制備同批QF-LCNP 樣品，分別于0，2，4，6，8，12，24 h 時按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果的RSD 為1.14%（n=7），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗：精密量取同一已知含量的QF-LCNP供試品溶液9 份，每3 份1 組，置10 mL 容量瓶中，分別加入相當于標示量80%，100%，120%的對照品溶液適量，用甲醇稀釋至刻度，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結(jié)果見表7。

表7 加樣回收試驗結(jié)果（ n=9）

2.5 體外藥物釋放

采用透析法［11］，釋放介質(zhì)選取pH 7.4 磷酸鹽（PBS）緩沖液，以富馬酸喹硫平對照品為對照，進行體外釋藥試驗。分別精密量取QF 對照品溶液和QF-LCNP各0.5 mL，將樣品放入已處理好的透析袋內(nèi)，兩端扎緊，浸入100 mL pH 7.4 PBS 緩沖液中，密封，維持溫度在37 ℃，磁力攪拌，于設定時間點取樣，同時補充相同體積的釋藥介質(zhì)，以保證透析環(huán)境不變。取1 mL 透析介質(zhì)，0.22 μm 微孔濾膜濾過，測定每個取樣點時的藥物含量，計算累積釋放度。結(jié)果見圖2。

圖2 QF-LCNP 和喹硫平溶液釋放曲線（n=3）

可見，QF 溶液在前10 h 內(nèi)的累積釋放度約達到100.00%，而富馬酸喹硫平脂質(zhì)立方液晶在前10 h 內(nèi)的累積釋放度約為58.00%，體外48 h 的累積釋放度約為84.67%，相比于QF 溶液有一定的緩釋效應。

3 討論

以富馬酸喹硫平的包封率為指標，采用單因素和正交試驗設計，從處方配比中可發(fā)現(xiàn)，立方液晶的形成與GMO/F127 的比例及水含量相關(guān)，含水量低于40%較難形成立方液晶，且存在一定的層狀液晶及非液晶形態(tài)；當水含量超過70%時，基本可形成立方液晶體系。另外，GMO 質(zhì)量比重與立方液晶的形成有關(guān)，因為構(gòu)成立方液晶的整體骨架主要是甘油單油酸酯，F(xiàn)127 的作用則是嵌入骨架縫隙的穩(wěn)定劑，因此引入過多的穩(wěn)定劑F127 會干擾立方液晶的形態(tài)。

在選取影響包封率的4 個因素中，分散相用量和GMO 與F127 質(zhì)量比均有統(tǒng)計學差異，表明該因素對包封率有顯著影響，符合立方液晶的晶體特性［12-14］。

制劑通過超聲、均質(zhì)后制備的納米顆粒能顯著提高藥物的包封率。目前，制備立方液晶多采用納米均質(zhì)法，可實現(xiàn)低溫下水浴循環(huán)制備納米粒，制備過程中能保證粒子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。故本試驗中選用均質(zhì)機制備立方液晶納米粒，對QF-LCNP 制備過程中的影響因素進行考察。均值壓力和均質(zhì)次數(shù)在一定范圍內(nèi)可影響藥物的包封率和粒徑，由于在均質(zhì)過程中增加均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)可能會導致儀器溫度升高，破壞立方液晶結(jié)構(gòu)，故在試驗前加入循環(huán)恒溫引流水，保證均質(zhì)管內(nèi)的溫度恒溫。均質(zhì)壓力超過1 500 bar 時，藥物的包封率有所降低，可能是過高的能量破壞了立方液晶結(jié)構(gòu)或?qū)е铝⒎揭壕Ь偷霓D(zhuǎn)變。

體外藥物釋放是考察緩釋制劑體外釋放速率的有效方法。本試驗中采用透析法、高效液相色譜法測定藥物釋放量，結(jié)果顯示，QF-LCNP 具有明顯的緩釋作用。此外，文獻［15］的研究表明，立方液晶能明顯提高藥物腦部吸收，為QF-LCNP 的體內(nèi)試驗提供了一定依據(jù)。本試驗中最后優(yōu)化得到的處方各項指標均在正常范圍內(nèi)，確定了富馬酸喹硫平脂質(zhì)立方液晶制備工藝的可行性，可為QF-LCNP 的深入研究提供參考。