汪云陽(yáng)，單靜博，陳亞楠，喬長(zhǎng)晟，羅學(xué)剛，*

（1.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2.天津市微生物代謝與發(fā)酵過(guò)程控制技術(shù)工程中心，天津300457；3.天津慧智百川生物工程有限公司，天津300457）

枸杞作為傳統(tǒng)中藥材和功能性食品，在中國(guó)已有2 000多年的歷史[1-2]。枸杞果實(shí)是一種“藥食同源”的保健性食品，其色澤鮮紅，口感酸甜[3]，被認(rèn)為具有不同的藥理活性和保健作用，廣泛應(yīng)用于不同的方劑和中成藥中[4]。當(dāng)前科學(xué)研究表明，枸杞果實(shí)中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，主要涉及多糖、多肽、生物堿、黃酮類、萜烯類、有機(jī)酸、木脂素、酚酰胺、類胡蘿卜素等多種化合物[5-7]，而多糖是枸杞果實(shí)中含量最豐富的活性成分。現(xiàn)代藥理研究表明枸杞果實(shí)中的多糖具有抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤、抗輻射、抗氧化、補(bǔ)肝益腎、補(bǔ)血安神等諸多藥用功效[5，8-9]。

益生菌是一類對(duì)宿主有益的活性微生物，現(xiàn)代研究結(jié)果表明，益生菌進(jìn)入并定植在胃腸道后，能夠與宿主共生，從而構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)環(huán)境，對(duì)宿主發(fā)揮其益生作用，例如改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，維持腸道的微生態(tài)平衡，提高宿主的免疫力[10]。在評(píng)估益生菌特性的乳酸桿菌物種中，植物乳桿菌被認(rèn)為是一種高度通用的物種，對(duì)維護(hù)人體健康十分重要[11-12]。相關(guān)研究證實(shí)，植物乳桿菌CGMCC8198（L.plantarum CGMCC8198）具有很好的耐酸耐膽鹽能力，可以調(diào)節(jié)胃腸道功能，降低因高脂飲食所造成的肥胖及高血脂病變，有效預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[13-15]。

目前，枸杞的使用已經(jīng)擴(kuò)展到所有西方國(guó)家，人們食用枸杞果實(shí)，并將枸杞果實(shí)的濃縮果汁或提取物添加到飲料中，以期改善肝功能和氧化應(yīng)激損傷[16-17]。由于枸杞自身并沒有突出的香味，并且藥味濃重，無(wú)較佳的風(fēng)味，因此單獨(dú)使用枸杞為原料生產(chǎn)的枸杞原漿口感欠佳，這種情況嚴(yán)重地影響了枸杞類飲品的生產(chǎn)和市場(chǎng)開發(fā)[18]。有研究表明益生菌枸杞發(fā)酵飲料具有潛在的益生菌活菌特有的生理功能，可以調(diào)理腸道菌群，是一種理想的集天然、營(yíng)養(yǎng)、滋補(bǔ)于一體的保健飲品，有廣泛的市場(chǎng)前景[19]。因此本文采用L.plantarum CGMCC8198對(duì)枸杞原漿進(jìn)行單一菌種定向發(fā)酵，在較大程度保持營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)，生產(chǎn)出風(fēng)味獨(dú)特、口感優(yōu)良的枸杞發(fā)酵飲料，又進(jìn)一步分析了枸杞汁發(fā)酵前后風(fēng)味物質(zhì)種類及含量的變化，為枸杞發(fā)酵飲料的工業(yè)化生產(chǎn)提供最佳工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞原漿：天津慧智百川生物工程有限公司；L.plantarum CGMCC8198：天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院微生態(tài)調(diào)控與分子藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；碳酸氫鈉、木糖醇：市售食品級(jí)；葡萄糖、亞鐵氰化鉀、硫酸銅、次甲基藍(lán)、氫氧化鈉：天津泰進(jìn)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

4R2204CN型電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；TG16B型高速臺(tái)式離心機(jī)：湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；LRH-150型生化培養(yǎng)箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；PSSJ-4V型精密pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；57330-U型固相微萃取裝置、50/30 μm DVB/CAR/DVB固相微萃取針、手動(dòng)SPME進(jìn)樣器：美國(guó)Suplco公司；安捷倫5975C+7890A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵工藝流程

發(fā)酵工藝流程圖見圖1。

圖1 發(fā)酵工藝流程圖Fig.1 Fermentation process flow diagram

1.3.2 枸杞發(fā)酵飲料的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

感官評(píng)定小組成員通過(guò)篩選確定，由8位食品專業(yè)相關(guān)人員組成。感官評(píng)價(jià)細(xì)則見表1，分別從色澤、香氣、口感、狀態(tài)4個(gè)方面對(duì)枸杞發(fā)酵飲料進(jìn)行評(píng)分，總分100分。

表1 枸杞發(fā)酵飲料感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Wolfberry fermented beverage sensory evaluation criteria

1.3.3 枸杞發(fā)酵飲料的單因素試驗(yàn)

以枸杞原漿與水的體積比8∶1、發(fā)酵時(shí)間8 h、發(fā)酵溫度33℃，木糖醇添加量5%，接種量3%為基礎(chǔ)發(fā)酵條件，以體積比（4 ∶1、6 ∶1、8 ∶1、10 ∶1、12 ∶1）、發(fā)酵時(shí)間（4、6、8、10、12 h）、發(fā)酵溫度（29、31、33、35、37 ℃）、木糖醇添加量（1%、3%、5%、7%、9%）、植物乳桿菌CGMCC8198接種量（1%、2%、3%、4%、5%）為變量進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各個(gè)因素對(duì)枸杞發(fā)酵飲料感官品質(zhì)的影響。

1.3.4 枸杞發(fā)酵飲料的響應(yīng)面設(shè)計(jì)

選取單因素試驗(yàn)確定的各因素的較優(yōu)值，以感官評(píng)分為響應(yīng)值，采用Design-Expert.V8.0.6響應(yīng)面設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)四因素三水平的試驗(yàn)，具體因素水平見表2。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素水平表Table 2 Box-Behnken design level of form factors

1.3.5 測(cè)定枸杞發(fā)酵飲料的條件

采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用分析（head spacesolid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技術(shù)測(cè)定枸杞發(fā)酵飲料的條件。

1.3.5.1 頂空固相微萃取條件

吸取6mL樣品置于樣品瓶中，同時(shí)加入適量NaCl使其達(dá)到飽和狀態(tài)，將樣品瓶置于60℃的水浴條件下平衡15 min，再插入萃取頭吸附45 min。

1.3.5.2 色譜條件

采用不分流進(jìn)樣方式，進(jìn)行階段升溫，以初始溫度60℃保持續(xù)2 min，再以5℃/min升至160℃保持1 min，接著以10℃/min升溫至250℃保持4 min[20]。

1.3.5.3 質(zhì)譜條件

信號(hào)采集使用全掃描的方式進(jìn)行，離子源溫度設(shè)置為230℃，四級(jí)桿溫度設(shè)置為150℃。電子能量為70 eV，檢測(cè)電壓350 V。結(jié)果經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)檢索后與NIST普庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，選取匹配度大于90%的化合物，鑒定主要化合物的種類及其物質(zhì)相對(duì)含量。

1.3.6 理化指標(biāo)

pH值：用PSSJ-4V型精密pH計(jì)測(cè)定；還原糖含量測(cè)定：按照直接滴定法測(cè)定[21]。

1.3.7 微生物指標(biāo)

參照GB 4789.35-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》進(jìn)行乳酸菌計(jì)數(shù)。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism 5軟件、Design-Expert.V8.0.6響應(yīng)面分析軟件和Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 體積比對(duì)枸杞汁發(fā)酵的影響

體積比對(duì)發(fā)酵枸杞汁飲料感官評(píng)分的影響見圖2。

圖2 體積比對(duì)發(fā)酵枸杞汁飲料感官評(píng)分的影響Fig.2 Effect of ratio of volume on sensory score of fermented oyster sauce and gluten index of the whole wheat flours

由圖2可知，隨著體積比的增加，枸杞發(fā)酵飲料的感官評(píng)分先上升后又下降，體積比值較低時(shí)枸杞風(fēng)味較淡，體積比過(guò)高又會(huì)有苦澀感。在體積比為10∶1時(shí)，飲料的感官評(píng)分最高，因此，體積比為10∶1較為適宜。

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)枸杞汁發(fā)酵的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵枸杞汁飲料感官評(píng)分的影響見圖3。

由圖3可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間6 h時(shí)感官評(píng)分高達(dá)92，之后隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)感官評(píng)分急速下降?？赡苡捎诎l(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致飲料過(guò)酸，產(chǎn)生不良的風(fēng)味。因此，發(fā)酵時(shí)間為6 h較為適宜。

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)枸杞汁發(fā)酵的影響

發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵枸杞汁飲料感官評(píng)分的影響見圖4。

由圖4可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，飲料的感官評(píng)分先緩慢增加又緩慢降低，當(dāng)發(fā)酵溫度為33℃時(shí)，感官評(píng)分最高。溫度偏高或偏低不利于菌株的生長(zhǎng)，可能導(dǎo)致發(fā)酵風(fēng)味欠佳。因此，適宜的發(fā)酵溫度為33℃。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵枸杞汁飲料感官評(píng)分的影響Fig.3 Effect of fermentation time on sensory score of fermented oyster sauce

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵枸杞汁飲料感官評(píng)分的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on sensory score of fermented oyster sauce

2.1.4 木糖醇添加量對(duì)枸杞汁發(fā)酵的影響

木糖醇添加量對(duì)發(fā)酵枸杞汁飲料感官評(píng)分的影響見圖5。

由圖5可知，隨著木糖醇的添加量增加，枸杞發(fā)酵飲料的感官評(píng)分先緩慢增加然后又稍降低。一定量的木糖醇可增加飲料的甜味，過(guò)多的量又會(huì)造成風(fēng)味的不協(xié)調(diào)。當(dāng)木糖醇的添加量為7%時(shí)，枸杞發(fā)酵的飲料風(fēng)味最佳，酸甜適中。因此，較適宜的木糖醇添加量為7%。

2.1.5 接種量對(duì)枸杞汁發(fā)酵的影響

接種量對(duì)發(fā)酵枸杞汁飲料感官評(píng)分的影響見圖6。

由圖6可知，隨著接種量的增加，飲料的感官評(píng)分先增加后又緩慢降低，接種量過(guò)多會(huì)導(dǎo)致飲料口味偏酸，發(fā)酵風(fēng)味過(guò)于濃厚，風(fēng)味不協(xié)調(diào)。因此，較適宜的植物乳桿菌CGMCC8198的接種量為2%。

圖5 木糖醇添加量對(duì)發(fā)酵枸杞汁飲料感官評(píng)分的影響Fig.5 Effect of xylitol addition on sensory score of fermented oyster sauce

圖6 接種量對(duì)發(fā)酵枸杞汁飲料感官評(píng)分的影響Fig.6 Effect of inoculum size on sensory score of fermented oyster sauce

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.2.1 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由單因素試驗(yàn)可知，木糖醇添加量對(duì)枸杞發(fā)酵飲料的感官評(píng)分影響較小，因此選取其中4個(gè)因素，即體積比、接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度為自變量，以感官評(píng)價(jià)得分為因變量，設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Response surface test design and results

續(xù)表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table 3 Response surface test design and results

2.2.2 枸杞發(fā)酵飲料感官評(píng)價(jià)模型的建立與分析

通過(guò)Design-Expert.V8.0.6對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到枸杞發(fā)酵飲料感官評(píng)分與4個(gè)因素的多元二次回歸方程：Y=93.38+3.83A-0.46B+2.91C-0.47D-3.83AB+4.44AC-3.55AD-4.17BC-10.02A2-8.34B2-7.77C2-10.56D2。模型回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果如表4所示[22]。

表4 模型回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 4 Model regression coefficient significance test results

續(xù)表4 模型回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Continue table 4 Model regression coefficient significance test results

由表4可知，模型P＜0.000 1，極顯著，失擬項(xiàng)P＞0.05，不顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.933 8，表明該模型擬合程度較好，能夠?qū)﹁坭桨l(fā)酵飲料工藝進(jìn)行預(yù)測(cè)[23]。CV=0.675 6%，說(shuō)明模型較可靠。RSN=14.624＞4，R2Adj=0.884 2，說(shuō)明模型置信度較高[24]。4個(gè)因素對(duì)感官評(píng)分影響的順序?yàn)锳＞C＞D＞B，體積比對(duì)感官評(píng)分的影響最顯著。交互作用AB、AC、AD、BC對(duì)感官評(píng)分影響顯著；一次項(xiàng) A、C 和二次項(xiàng) A2、B2、C2、D2對(duì)感官評(píng)分的影響極顯著。

2.2.3 交互作用分析

通過(guò)Design-Expert.V8.0.6軟件對(duì)得出的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，建立了該工藝條件的模型。在保證體積比、接種量、發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵溫度4個(gè)因素中一個(gè)因素不變的情況下，得到其他因素的三維響應(yīng)面曲線和等高線。不同因素之間的交互作用的響應(yīng)面曲線與等高線具體如圖7～圖10所示。

響應(yīng)曲面越陡，等高線越密集，表明因素之間的交互作用越明顯[25]。從響應(yīng)面曲線可以看出，交互作用為AC＞BC＞AB＞AD。說(shuō)明體積比和枸杞發(fā)酵時(shí)間的交互作用對(duì)枸杞發(fā)酵飲料的感官品質(zhì)影響最為顯著。而體積比與枸杞發(fā)酵溫度的交互作用對(duì)枸杞發(fā)酵飲料的感官品質(zhì)影響相對(duì)較弱

通過(guò)響應(yīng)面分析得到最優(yōu)的工藝條件為體積比10.37∶1、接種量 1.89%、發(fā)酵時(shí)間 6.16 h、發(fā)酵溫度32.95℃，此發(fā)酵條件得到的感官評(píng)分預(yù)測(cè)值為94。根據(jù)實(shí)際發(fā)酵條件，以體積比10.5∶1、接種量2%、發(fā)酵時(shí)間6 h、發(fā)酵溫度33℃的工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證，在此條件下進(jìn)行獨(dú)立3次試驗(yàn)，得到的枸杞發(fā)酵飲料感官評(píng)分實(shí)際值為93.8±0.32。與模型預(yù)測(cè)值接近，證明此模型可靠。由此工藝得到的枸杞發(fā)酵飲料兼具枸杞的清香以及特殊的發(fā)酵風(fēng)味，酸甜適中，為生產(chǎn)應(yīng)用提供了理論參數(shù)。

圖8 體積比和發(fā)酵時(shí)間對(duì)感官評(píng)分影響的響應(yīng)面與等高線圖Fig.8 Response surface and contour map of the influence of volume ratio and fermentation time on sensory score

圖9 體積比和發(fā)酵溫度對(duì)感官評(píng)分影響的響應(yīng)面與等高線圖Fig.9 Response surface and contour map of the influence of volume ratio and fermentation temperature on sensory score

圖10 接種量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)感官評(píng)分影響的響應(yīng)面與等高線圖Fig.10 Response surface and contour plots of inoculum size and fermentation time on sensory scores

2.3 枸杞中揮發(fā)性成分分析

香氣成分是檢驗(yàn)枸杞發(fā)酵飲料風(fēng)味的主要指標(biāo)。本試驗(yàn)采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的方法分析枸杞汁發(fā)酵前后風(fēng)味物質(zhì)種類及含量的變化。圖11～圖12分別為枸杞汁發(fā)酵前后香氣成分的總離子流色譜圖。鑒定結(jié)果見表5。

圖11 枸杞發(fā)酵前香氣成分的總離子流色譜圖Fig.11 The total ion chromatogram pre-fermentation aroma components wolfberry

圖12 枸杞發(fā)酵飲料香氣成分的總離子流色譜圖Fig.12 The total ion chromatogram fermented beverage aroma components wolfberry

由表5結(jié)果可知，未發(fā)酵枸杞原漿中主要檢測(cè)出13種風(fēng)味物質(zhì)，其中包括2種醇類物質(zhì)，1種酯類物質(zhì)，2種酸類物質(zhì)，6種酮類物質(zhì)，2種醛類物質(zhì)。枸杞發(fā)酵液中主要檢測(cè)出22種風(fēng)味物質(zhì)，其中包括5種醇類物質(zhì)，2種酯類物質(zhì)，4種酸類物質(zhì)，8種酮類物質(zhì)，3種醛類物質(zhì)。枸杞發(fā)酵后，風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量得到了增加，其中乙醇的相對(duì)含量最高，達(dá)到了23.59%，賦予了飲料輕快的香味[26]。酸類物質(zhì)種類的豐富賦予飲料酸甜的口味。酮類物質(zhì)中，3-羥基-2-丁酮[27]與2-壬酮[28]具有果香、甜香、清香、椰子及其奶油的香氣[29]，紫羅蘭酮與香葉基丙酮具有甜花香的氣味[30]。這些成分對(duì)于枸杞發(fā)酵飲料的風(fēng)味都起到了重要作用。

表5 枸杞發(fā)酵前后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分及相對(duì)含量Table 5 Volatile flavor components and relative content before and after fermentation

3 結(jié)論

本研究首先通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)枸杞汁發(fā)酵體積比、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、木糖醇添加量及接種量5個(gè)因素對(duì)枸杞發(fā)酵飲料的感官品質(zhì)進(jìn)行研究。之后，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取較優(yōu)的因素條件，利用響應(yīng)面法對(duì)體積比、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度及接種量這4個(gè)因素進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)，建立植物乳桿菌發(fā)酵枸杞汁飲料的二次多項(xiàng)式回歸方程。運(yùn)用該模型進(jìn)行最優(yōu)工藝條件預(yù)測(cè)，得到的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為體積比10.5∶1、接種量2%、發(fā)酵時(shí)間6 h、發(fā)酵溫度33℃，木糖醇添加量7%，通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，在此發(fā)酵條件下的感官評(píng)分為93.8。通過(guò)頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的方法對(duì)枸杞汁發(fā)酵前后風(fēng)味物質(zhì)種類及含量的變化進(jìn)行了分析，通過(guò)發(fā)酵主要得出22種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，產(chǎn)生了多種香氣成分。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[28]，醇類物質(zhì)中C1～C3醇有輕快的香氣，枸杞汁經(jīng)過(guò)植物乳桿菌CGMCC8198發(fā)酵后，產(chǎn)生的乙醇賦予了枸杞飲料爽口清香的氣味。酮類物質(zhì)含量與種類的增加，尤其是3-羥基-2-丁酮及2-吡啶酮含量的增加賦予枸杞飲料奶香的香氣，2-壬酮的出現(xiàn)對(duì)增強(qiáng)爽口清香的氣味起到一定的作用[28]。這些結(jié)果表明：經(jīng)過(guò)植物乳桿菌CGMCC8198發(fā)酵后，枸杞汁增加或形成一些新的風(fēng)味物質(zhì)，它們共同構(gòu)成枸杞飲料的獨(dú)特風(fēng)味。本研究為枸杞發(fā)酵飲料的工業(yè)化生產(chǎn)提供了最佳參數(shù)，但其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及生理功能有待進(jìn)一步探究。