孔麗　左華江　吳春鳳

【摘 要】 目的：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究薄荷活性成分治療慢性膽囊炎的分子作用機(jī)制。方法：通過TCMSP數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)挖掘篩選薄荷活性成分及其作用靶點(diǎn)，利用Genecards數(shù)據(jù)庫獲取慢性膽囊炎相關(guān)靶點(diǎn)，將慢性膽囊炎相關(guān)靶點(diǎn)與薄荷活性成分相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行匹配得到潛在治療靶點(diǎn)。構(gòu)建薄荷活性成分-潛在治療靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，運(yùn)用Metascape數(shù)據(jù)庫對潛在治療靶點(diǎn)進(jìn)行生物學(xué)過程及信號通路分析，利用DisGeNET數(shù)據(jù)庫對靶點(diǎn)所屬的類型進(jìn)行歸屬。結(jié)果：篩選得到薄荷15個活性成分，涉及40個潛在治療靶點(diǎn)，主要參與對類固醇激素的反應(yīng)、對酸性化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)、上皮細(xì)胞增殖等生物過程，共涉及13條信號通路。結(jié)論：薄荷活性活性成分可能通過調(diào)控EGFR、MYC、CASP3、CCND1、VEGFA、ERBB2、MDM2、ESR1、IL6、PPARG等靶點(diǎn)以及Pathways in cancer、prostate cancer、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、PI3K-Akt signaling pathway等多個信號通路發(fā)揮薄荷活性成分治療慢性膽囊炎的作用。

【關(guān)鍵詞】 薄荷;慢性膽囊炎;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

【中圖分類號】R285.6 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2020）8-0027-07

Study on the Mechanism of Active Ingredients of Peppermint in the Treatment of Chronic Cholecystitis Based on Network pharmacology

KONG Li1，2 ZUO Huajiang2 WU Chunfeng1*

1.Liuzhou peoples Hospital Affiliated to Guangxi Medical University，Liuzhou 545006，China;2.Guangxi University of science and technology，Liuzhou 545006

Abstract：Objective To explore the molecular mechanism of active components of peppermint in the treatment of chronic cholecystitis based on network pharmacological methods.Methods TMTSP database and literature mining were used to screen mint active ingredients and their targets，Genecards database was used to obtain chronic cholecystitis related targets，and chronic cholecystitis related targets were matched with peppermint active component related targets to obtain potential therapeutic targets.Construct a mint active ingredient-potential? therapeutic targetsnetwork diagram and protein interaction network diagram，use Metascape database to analyze the biological process and signal pathway of potential therapeutic targets，and use the DisGeNET database to assign the types of targets.Results 15 active ingredients of peppermint were screened out，which involved 40 potential therapeutic targets.They were mainly involved in biological processes such as the response to steroid hormones，the response to acidic chemicals，and the proliferation of epithelial cells，involving 13 signal pathways.Conclusion The active ingredients of peppermint may regulate EGFR，MYC，CASP3，CCND1，VEGFA，ERBB2，MDM2，ESR1，IL6，PPARG and other targets，as well as Pathways in cancer，prostate cancer，AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications，PI3K- Multiple signaling pathways such as Akt signaling pathway play the role of mint active ingredients in the treatment of chronic cholecystitis.

Key words：Mint;Chronic Cholecystitis;Network Pharmacology

慢性膽囊炎是一種膽囊慢性炎癥病變[1]，屬于慢性炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)為反復(fù)右上腹疼痛或不適、 腹脹、噯氣、厭油膩[2-3]。女性患病率高于男性[3]，且中老年群體為高發(fā)群體[1]。慢性膽囊炎屬中醫(yī)“膽脹”范疇，以右脅脹痛為主，針對該病的治療，近年來采用中醫(yī)治療，取得了較好的療效。

薄荷作為唇形科薄荷屬植物[4]，具有抗病毒、興奮中樞、抗菌[5]、保肝利膽、抑菌、抗氧化、抗炎[6]等藥理作用，在《藥性論》等多部古代醫(yī)藥典籍中，薄荷均被記載具有發(fā)汗解表作用，可用于溫病的治療。薄荷的主要成分包括揮發(fā)油、黃酮類等。揮發(fā)油中主要成分為左旋薄荷醇，其含量高達(dá)62%～87%[4，7，8]，左旋薄荷酮等。研究表明，薄荷醇和薄荷酮有明顯的利膽作用，其中薄荷醇在膽道的主要代謝產(chǎn)物中起了利膽的作用[4-5]。薄荷中的黃酮類成分中最主要的成分為蒙花苷，具有良好的抗菌作用[7]。雖然薄荷中的揮發(fā)油成分據(jù)報道已有治療慢性膽囊炎的作用[5]，但其活性成分及其相關(guān)作用機(jī)制尚不清楚。因此，研究薄荷中活性成分、作用靶點(diǎn)及其可能的作用機(jī)制，為進(jìn)一步揭示薄荷治療慢性膽囊炎具有重要意義。

傳統(tǒng)的藥理學(xué)研究大多是基于“單因素觀察”，即證明藥物的某一方面的作用，需要通過對照試驗(yàn)、施加單一因素作用，以揭示藥物對于疾病的作用機(jī)制[9]，而中藥具有多成分、多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)[10]，因而傳統(tǒng)藥理學(xué)的研究方法與中藥的研究理念相悖。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)等多種學(xué)科技術(shù)發(fā)展結(jié)合的結(jié)果，其以藥物、靶點(diǎn)以及疾病之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過網(wǎng)絡(luò)分析手段，從整體性的角度出發(fā)，研究中藥的特征，觀察藥物對疾病的影響，將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)應(yīng)用到中藥中能夠提升中藥研究的現(xiàn)代化水平[11]。程曉平等[12]采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討了獨(dú)活治療骨關(guān)節(jié)的作用機(jī)制;李剛等[13]采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對淫羊藿抗骨質(zhì)疏松的分子機(jī)制進(jìn)行了分析;王韌等[14]采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法從分子角度分析魚腥草治療支氣管炎的作用機(jī)制。因此本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對薄荷中的活性成分治療慢性膽囊炎的作用機(jī)制進(jìn)行探討，可以提高其治療效果，臨床試驗(yàn)的成功率以及降低其毒副作用。

1 材料和方法

1.1 薄荷中活性成分的篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMSP）（http：//tcmspw.com/），檢索薄荷的化學(xué)成分，并根據(jù)口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18、化合物含量以及明確的生物活性報道，篩選出薄荷中可能有效的活性成分。

1.2 潛在治療靶點(diǎn)的預(yù)測 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索上述薄荷相關(guān)活性成分的靶點(diǎn)，將其導(dǎo)入Uniprot（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫，并限定物種為人類，將檢索得到的所有靶點(diǎn)校正為該靶點(diǎn)的基因名稱，用于后續(xù)其它工作的分析。通過GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫，以“gallbladder”、“Chronic cholecystitis”為檢索關(guān)鍵詞，搜索慢性膽囊炎相關(guān)靶點(diǎn)，將其與上述所得薄荷活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，得到交集靶點(diǎn)，即為薄荷活性成分治療慢性膽囊炎的潛在治療靶點(diǎn)。

1.3 活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將薄荷活性成分與潛在治療靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape Version3.7.0軟件，構(gòu)建薄荷活性成分-潛在治療靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將潛在治療點(diǎn)導(dǎo)入String（https：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫，限定物種為人，設(shè)置最低相互作用閾值為0.4，獲取蛋白相互作用關(guān)系，結(jié)果以TSV格式保存，保留node1、noe2、Combined score信息，將這三個信息導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，并對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，保存分析結(jié)果，將節(jié)點(diǎn)大小和顏色設(shè)置用于反映Degree的大小，邊的粗細(xì)用于反映Combined score的大小，獲取最終的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。本研究基于以下參數(shù)：平均最短路徑（Average Shortest Path Length）、介數(shù)中心性（Betweenness Centrality）、中心接近度（Closeness Centrality）、聚類系數(shù)（Clustering Coefficient）、度值（Degree），以評估節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要程度。

1.5 生物學(xué)過程與通路分析 利用Metascape數(shù)據(jù)庫對潛在治療靶點(diǎn)進(jìn)行生物學(xué)過程與通路分析，將潛在治療靶點(diǎn)輸入數(shù)據(jù)庫，設(shè)置物種為人類進(jìn)行分析，取P<0.05，得到生物學(xué)過程與通路分析結(jié)果。

1.6 潛在治療靶點(diǎn)靶點(diǎn)類型歸屬 利用DisGeNET（http：//www.disgenet.org/）數(shù)據(jù)庫對潛在治療靶點(diǎn)進(jìn)行檢索，將潛在治療靶點(diǎn)依次輸入數(shù)據(jù)庫，獲取靶點(diǎn)類型信息（Protein Class）。

2 結(jié)果

2.1 薄荷中活性成分的篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共獲得薄荷化學(xué)成分164個，根據(jù)口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18、化合物含量以及明確的生物活性報道，篩選出15個潛在的活性成分。詳見表1。

2.2 潛在治療靶點(diǎn)的預(yù)測 通過TCMSP數(shù)據(jù)檢索薄荷活性成分相關(guān)靶點(diǎn)，將這些靶點(diǎn)導(dǎo)入Uniprot數(shù)據(jù)庫，限定物種為人，進(jìn)行靶點(diǎn)基因名稱的校正，去重后共得到57個靶點(diǎn)（其中Fortunellin、Linarin無相關(guān)作用靶點(diǎn)）。通過GeneCards數(shù)據(jù)庫，以“gallbladder”、“Chronic cholecystitis”為檢索關(guān)鍵詞，搜索得到慢性膽囊炎相關(guān)靶點(diǎn)，將活性成分作用靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行匹配（見圖1），得到40個潛在治療靶點(diǎn)。

2.3 活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將薄荷活性成分和潛在治療靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建活性成分-潛在治療靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，詳見圖2。圖中共涉及53個節(jié)點(diǎn)（13個化合物，40個潛在作用靶點(diǎn)，由于Fortunellin、Linarin無作用靶點(diǎn)，故在網(wǎng)絡(luò)中不體現(xiàn)），69條邊。不同的顏色和形狀代表薄荷活性成分和靶點(diǎn)，綠色菱形節(jié)點(diǎn)代表薄荷活性成分，藍(lán)色三角形代表潛在治療靶點(diǎn)，邊代表活性成分與潛在作用靶點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)。

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將上述作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，限定物種為人，獲取蛋白相互作用關(guān)系，以TSV格式保存其結(jié)果。保留node1、noe2、Combined score信息，將這三個信息導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3，并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治?，見?。圖中節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)，邊表示靶點(diǎn)之間的聯(lián)系，由圖3可見，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)共涉及38個節(jié)點(diǎn)，266條邊（其中PRSS1，CHRM3與其它靶點(diǎn)無相互作用，故沒有在網(wǎng)絡(luò)中體現(xiàn)）。節(jié)點(diǎn)的大小和顏色表示Degree值的大小，節(jié)點(diǎn)越大，顏色逐漸變深對應(yīng)的Degree值越大。邊的粗細(xì)表示Combine score，邊越粗Combine score越大。經(jīng)計算后可知，平均連接度約為14，平均最短路徑長度約為1.71，平均介數(shù)約為0.02，平均聚類系數(shù)約為0.7。具有高度值（連接度）和介數(shù)中心的靶點(diǎn)可被認(rèn)為是中心靶點(diǎn)，在此網(wǎng)絡(luò)中，度值和介數(shù)中心均超過平均值的有10個，分別是EGFR、MYC、CASP3、CCND1、VEGFA、ERBB2、MDM2、ESR1、IL6、PPARG，可認(rèn)為這10個是薄荷治療慢性膽囊炎的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

2.5 生物學(xué)過程與信號通路分析 利用Metascape數(shù)據(jù)庫對潛在治療靶點(diǎn)進(jìn)行生物學(xué)過程與信號通路通路分析，設(shè)定P<0.05，篩選靠前的生物過程，主要包括對類固醇激素的反應(yīng)（response to steroid hormone）、對酸性化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)（response to acid chemical）、上皮細(xì)胞增殖（epithelial cell proliferation）、對銨離子的響應(yīng)（response to ammonium ion）、血液循環(huán)（blood circulation）、細(xì)胞對過氧化氫的反應(yīng)（cellular response to hydrogen peroxide）等。潛在治療靶點(diǎn)主要富集在13條信號通路，包括Pathways in cancer、prostate cancer、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、PI3K-Akt signaling pathway、Breast cancer、HIF-1 signaling pathway等信號通路。分析結(jié)果見圖4。

2.6 潛在治療靶點(diǎn) 靶點(diǎn)類型歸屬將40個潛在治療靶點(diǎn)依次導(dǎo)入DisGeNET數(shù)據(jù)庫，獲取其對應(yīng)的類型，詳見表3。結(jié)果表明薄荷活性成分治療慢性膽囊炎過程中有信號分子、轉(zhuǎn)錄因子、受體、蛋白、酶等物質(zhì)的參與。

3 結(jié)論與討論

薄荷具有保肝利膽的作用，是治療慢性膽囊炎的有效藥物，以其揮發(fā)油作為主要成分的藥物在治療膽囊相關(guān)疾病已有報道[5]。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的相關(guān)理念和技術(shù)，本研究對薄荷治療慢性膽囊炎作用機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測，利用TCMSP數(shù)據(jù)庫，并根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18、化合物含量以及明確的生物活性報道篩選得到有效活性成分15種，獲取活性成分靶點(diǎn)，將其與慢性膽囊炎相關(guān)的靶點(diǎn)取交集，共得到40個潛在治療靶點(diǎn)，將潛在治療靶點(diǎn)作蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果顯示EGFR、MYC、CASP3、CCND1、VEGFA、ERBB2、MDM2、ESR1、IL6、PPARG在網(wǎng)絡(luò)的中心位置，具有較高的Degree值和介數(shù)中心性，可能為薄荷治療慢性膽囊炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)。表皮生長因子（EGFR）是原癌基因的一種表達(dá)產(chǎn)物，其表達(dá)部位在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜上，在慢性膽囊炎的組織中，EGFR的陽性表達(dá)率約為20%[15];c-Myc是MYC原癌基因族中的一員，c-Myc被異常激活后，其表達(dá)明顯升高，引起細(xì)胞增殖，同時抑制有關(guān)分化的基因表達(dá)，降低細(xì)胞的終末分化[16];IL6是炎癥性細(xì)胞因子，反應(yīng)了機(jī)體對炎癥及感染時的反應(yīng)狀態(tài)，而慢性膽囊炎患者的膽汁和血清中IL6呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)[17]。

潛在治療靶點(diǎn)涉及凋亡過程的負(fù)調(diào)控、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、神經(jīng)元凋亡過程、積極調(diào)控成纖維細(xì)胞增殖等生物過程;核、基底外側(cè)質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)等細(xì)胞組成;類固醇結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性，序列特異性DNA結(jié)合等分子功能。通路分析結(jié)果顯示，薄荷治療慢性膽囊炎的靶點(diǎn)主要涉及Pathwaysincancer、prostatecancer、AGE-RAGEsignalingpathwayindiabeticcomplications、PI3K-Aktsignalingpathway、Breastcancer、HIF-1signalingpathway等信號通路。

綜上所述，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法研究薄荷治療慢性膽囊炎的潛在作用機(jī)制，從而探明了薄荷在治療慢性膽囊炎的作用靶點(diǎn)及信號通路，并明確了薄荷通過多種活性成分對多種靶點(diǎn)發(fā)揮其治療慢性膽囊炎的作用機(jī)制，這為后續(xù)薄荷在慢性膽囊炎治療上的應(yīng)用提供了方向。

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（收稿日期：2020-01-21 編輯：劉 斌）

基金項目：廣西自然科學(xué)基金青年項目（2018GXNSFBA294007）;廣西高校唐資源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（2016TZYKF07）;柳州市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃課題（2017BA30203）。

作者簡介：孔麗（1998-），女，本科在讀，研究方向?yàn)橹兴幓衔锍煞只A(chǔ)研究。E-mail：2331232050@qq.com

通信作者：吳春鳳（1982-），女，博士，副主任技師，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)內(nèi)科基礎(chǔ)研究。E-mail：wuchunfengnet@163.com