吳一堔　曹華陽 李亞彤 劉佐萱 劉蘭濤

摘要 目的：探討直腸癌中FOXP3+Treg細胞的比例變化，揭示輔助性T細胞在直腸癌中的作用。方法：收集臨床標本，用流式細胞儀檢測直腸癌組織、癌旁組織和正常組織的比例。結果：癌組織中輔助性T細胞的比例31.6%，較癌旁組織17.8%明顯增高。結論： FOXP3+Treg 細胞直腸癌組織中高表達，直腸癌的發(fā)生和發(fā)展有重要關系。

關鍵詞： 直腸癌;輔助性T細胞;腫瘤轉移

在我國結直腸癌的發(fā)病率和死亡率位居腫瘤第五。結直腸癌的發(fā)生和發(fā)展受到腫瘤缺氧微環(huán)境的調控，免疫耐受和免疫逃逸在其中發(fā)揮重要作用。有報道指出調節(jié)性T細胞通過抑制有效的抗腫瘤免疫應答而促進多種癌癥的惡性進展。在癌癥病人的腫瘤微環(huán)境中會浸潤大量輔助性T細胞，系統(tǒng)性敲除機體FOXP3+Treg細胞會增強自身效應性T細胞的活化及功能和固有性免疫應答。

材料和方法

1.1收集臨床標本：收集直腸癌確診病例標本，年齡18歲以上，經(jīng)病理診斷直腸癌的，手術過程中收集癌組織和癌旁組織新鮮標本，提取單個核細胞，用于facs檢測。IL-10、CTLA-4、CD4+等抗體均購于 eBioscience。

1.2 流式細胞檢測：采用密度梯度離心法富集淋巴細胞，流式分析其中FOXP3+Treg 細胞比例及其分泌的抑制性細胞因子CTLA-4 的變化。取調整好的細胞懸液 100微升 ，按試劑盒說明操作，加入一抗，二抗，用1%的多聚甲醛300μl重懸固定，24小時內(nèi)上機檢測。

1.3統(tǒng)計分析：應用 SPSS 25. 0分析數(shù)據(jù)，以 均數(shù) ± 標準差計量。成對組間比較采用 t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析 （ ANOVA） 檢驗，P? < 0. 05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1直腸癌與癌旁組織中 FOXP3+Treg 細胞比例變化

流式細胞檢測結果顯示FOXP3+Treg 細胞在大腸癌組織中高表達，癌組織中FOXP3+Treg 細胞的比例為36.1%，明顯高于癌旁組織中FOXP3+Treg 細胞比例18.7%和正常對照組織中的FOXP3+Treg 細胞比例

2.2FACS 分析 FOXP3+Treg 細胞內(nèi)抑制性受體 CTLA-4 的表達情況

流式細胞檢測結果顯示癌組織內(nèi)FOXP3+Treg細胞內(nèi)CTLA-4受體 大腸癌組織中表達明顯增高，癌組織中FOXP3+Treg 細胞內(nèi)CTLA-4受體比例為54.5%，明顯高于癌旁組織中FOXP3+Treg 細胞內(nèi)CTLA-4比例16.8%。

討論

本課題研究直腸癌發(fā)現(xiàn)，與正常組織、癌旁組織相比，癌組織中輔助性FOXP3+Treg細胞比例顯著上調 。這與其他學者研究的非小細胞肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌組織中較癌旁組織FOXP3+Treg浸潤程度明顯增高的結論一致，提示輔助性FOXP3+Treg細胞在結直腸癌抗腫瘤免疫反應中可能發(fā)揮重要作用。

Koch等學者研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP3+Treg細胞中的一個亞群可以表達Th1其趨化因子受體CXCR3和關鍵轉錄因子T-bet。大多數(shù)CXCR3+T-bet+FOXP3+Treg可更高水平的表達免疫抑制性受體CTLA-4和抑制性細胞因子IL-10。FOXP3+Treg細胞的高表達對由Th1介導的I型免疫反應中FOXP3+Treg的穩(wěn)態(tài)和遷移能力也起到至關重要的作用，如T-bet+FOXP3+Treg細胞可聚集并調控由Th1介導的I型炎癥反應。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細胞可通過抑制免疫細胞的抗腫瘤作用而提高自身的增殖能力和轉移能力。

本研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境可明顯上調免疫抑制性受體CTLA4的表達，有可能是由于FOXP3+Treg細胞內(nèi)T-bet的蛋白水平上調引起的，此外，由此我們分析結直腸癌的缺氧微環(huán)境參與調控T-bet+Treg細胞比例及其免疫抑制功能。

然而腫瘤微環(huán)境是如何引起FOXP3+Treg 細胞比例上調的現(xiàn)在還不是特別清楚。?Yuan 等在乳腺癌細胞中發(fā)現(xiàn)，DNA 損傷會引起USP10 蛋白入核增多，可使得P53 蛋白去泛素化增多，達到穩(wěn)定P53 的功能。我們猜測缺氧是否也會引起USP10 的入核增多，從而穩(wěn)定T-bet 。我們根據(jù)前期的實驗結果和相關文獻猜測腫瘤微環(huán)境引起 FOXPTreg 細胞內(nèi) T-bet 的基因的水平變化，引起 USP10 表達上調，我們認為直腸癌缺氧的微環(huán)境可使 USP10 入核增多并穩(wěn)定引起 T-bet 蛋白，從而上調 T-betFOXP3Treg 細胞比例。缺氧誘導因子（ HIFs）在細胞缺氧時維持胞內(nèi)氧平衡并促進細胞適應低氧環(huán)境而存活。在缺氧環(huán)境中，腫瘤細胞主要通過 HIFs 激活一系列適應性基因來保證自身存活，HIF1α 和 HIF2α 在其中發(fā)揮重要作用。

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