楊新周,吳 娜,陳云波

(1.德宏師范高等?？茖W(xué)校 民族醫(yī)藥研究所,云南 德宏 678400；2. 德宏師范高等?？茖W(xué)校 理工學(xué)院, 云南 德宏 678400；3.紅河學(xué)院 理學(xué)院,云南 蒙自 661199)

白花蛇舌草(HedyotisdiffusaWilld.) 屬茜草科(Rubiaceae)耳草屬植物,是一種傣族藥物,傣語稱為“芽零哦”.白花蛇舌草全草入藥,味苦、甘、性寒,具有清熱解毒、活血化瘀、利濕通淋之功效[1-2].白花蛇舌草可用于治療肝癌、肺癌、胃癌、腸癌等癌癥[3-5],肝炎、咽喉痛、尿路感染等[6-8].白花蛇舌草因具有良好的藥效,被廣泛開發(fā)應(yīng)用,在花紅顆粒、抗骨髓炎片、男康片、腎炎康片的配方中均有白花蛇舌草的應(yīng)用[9].

目前白花蛇舌草的研究主要集中于化學(xué)成分、藥理藥效的研究[10],而對云南不同產(chǎn)區(qū)白花蛇舌草揮發(fā)性成分的鑒別研究鮮見報道.揮發(fā)性成分作為一類化學(xué)組成復(fù)雜體系,對中藥材質(zhì)量控制具有一定意義,不同產(chǎn)地白花蛇舌草成分組成因地理環(huán)境不同存在一定差異,可作為質(zhì)量評價的重要指標(biāo),因此,對不同產(chǎn)地白花蛇舌草揮發(fā)性成分進行研究并對其整體信息進行分析非常有必要.指紋圖譜技術(shù)作為復(fù)雜化學(xué)體系質(zhì)量控制的重要方法,可綜合反映出植物特征信息[11-12].靜態(tài)頂空-氣相色譜法分析藥品揮發(fā)性成分,該法操作簡便、不需要對樣品進行前處理,可對固體和液體進行直接分析[13].因此,采用靜態(tài)頂空-氣相色譜法,對不同產(chǎn)地白花蛇舌草進行測定,建立白花蛇舌草揮發(fā)性成分的分析方法及不同產(chǎn)地白花蛇舌草指紋圖譜,并對其進行相似度分析、聚類分析和主成分分析,以期達到對不同產(chǎn)區(qū)白花蛇舌草的鑒別,為白花蛇舌草的資源和質(zhì)量控制提供科學(xué)數(shù)據(jù).

1 實驗部分

1.1 材料與方法

1.1.1 主要試劑與儀器

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS-QP 2010,日本島津公司).

1.1.2 不同產(chǎn)地白花蛇舌草信息

不同產(chǎn)地白花蛇舌草信息見表1.

表1 白花蛇舌草產(chǎn)地信息

1.2 GC-MS條件

1.2.1 色譜條件

DB-1701色譜柱(30 m×0.250 mm×0.25 μm),進樣口溫度為250 ℃,柱流量為1.0 mL/min,升溫程序：初始溫度50 ℃,保持 10 min,以5 ℃/min速度升至120℃,保持1 min,再以8 ℃/min速度升至230 ℃,保持2 min,氣相色譜儀總運行時間為48.75 min.

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源溫度220 ℃,接口溫度250 ℃,檢測器電壓為0.88 kV,質(zhì)量數(shù)范圍在35～1000之間.

1.2.3 靜態(tài)頂空(HS)條件

進樣體積為2.0 μL,振蕩箱溫度為180 ℃、振蕩速度為250 r/min、振蕩時間為40 min,進樣針溫度150 ℃,進樣速度500 μL/s,氣體吹針時間120 s.

1.3 樣品的制備及檢測

稱取不同產(chǎn)地蛇舌草干粉樣品各0.2 g于頂空進樣瓶中,密封,按照靜態(tài)頂空(HS)條件和GC-MS條件進行檢測.

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A版)》、Microsoft Office 2013、SPSS 19.0中文版進行數(shù)據(jù)處理.

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器檢測條件的優(yōu)化

以玉溪市新平縣白花蛇舌草樣品作為考察對象,通過單因素實驗分別考察優(yōu)化HS/GC/MS條件,考察因素分別是HS振蕩溫度150、180 ℃,振蕩時間30、40 min,進樣體積1、2 μL,GC進樣口溫度200、220、250 ℃, MS離子源溫度200、220 ℃,接口溫度200、220、250 ℃.實驗結(jié)果表明,頂空進樣的最佳條件為,HS振蕩溫度為180 ℃,時間為40 min,進樣量為2 μL,GC進樣口溫度為250 ℃,程序升溫過程為初始溫度 50 ℃, 保持10 min,以5 ℃/min速度升至120 ℃,保持1 min,再以8 ℃/min速度升至230 ℃,保持2 min；MS離子源溫度為220 ℃,接口溫度為250 ℃.

2.2 頂空法測定白花蛇舌草揮發(fā)性成分

分別準(zhǔn)確稱取不同產(chǎn)地白花蛇舌草干粉各0.2 g,加入頂空進樣瓶,按照1.2條件進行檢測,得到白花蛇舌草不同產(chǎn)地GC-MS總離子流圖.采用面積歸一化法,分別對白花蛇舌草不同產(chǎn)地的揮發(fā)性GC-MS總離子流圖進行積分,并結(jié)合質(zhì)譜圖庫WILEY7.LIB、NIST05. NIST08進行檢索,保留相似度大于90%以上的化合物,與積分后的定性峰表進行對照,并結(jié)合相關(guān)文獻對檢索結(jié)果進行分析,確定白花蛇舌草揮發(fā)性成分的化學(xué)名稱、分子式,通過化合物的CAS號鑒定其結(jié)構(gòu),得出白花蛇舌草揮發(fā)性成分,表2為西雙版納州勐?？h勐遮鎮(zhèn)白花蛇舌草主要揮發(fā)性成分.

表2 白花蛇舌草主要揮發(fā)性成分

續(xù)表2

續(xù)表2

以表2為參照,對比其余21個不同產(chǎn)地白花蛇舌草揮發(fā)性成分,對比結(jié)果為：德宏江東鄉(xiāng)樣品檢測出86個化合物,特征化合物是2-甲基丁酸；德宏州芒市三臺山德昂族鄉(xiāng)樣品檢測出97個化合物,特征化合物4個,分別是2,4-二甲基己烷、十六烯、油酸、2-己基癸醇；德宏瑞麗勐秀鄉(xiāng)樣品檢測出90個化合物,特征化合物4個,分別是甲酸甲酯、2-丁酮、5-甲基-1-庚烯、2-羥基苯甲醛；德宏梁河樣品檢測出95個化合物,特征化合物6個,分別是甲基環(huán)戊二烯、2-甲基-3-丁烯-2-醇、己酸甲酯、2-環(huán)己烯酮、甘油、對甲基苯乙酮；德宏中山鄉(xiāng)樣品檢測出80個化合物,特征化合物6個,分別是氯戊烷、糠醛、1,2,3-三甲基苯、3-甲基-2-環(huán)戊烯酮、γ-戊內(nèi)酯、棕櫚酸甲酯；德宏王子樹鄉(xiāng)樣品檢測出85個化合物,無明顯特征化合物；德宏戶撒鄉(xiāng)樣品檢測出91個化合物,特征化合物是2-甲醇己酸；普洱文龍鄉(xiāng)樣品檢測出98個化合物,特征化合物4個,分別是乙酰氧基乙酸、(E)-6-壬烯醛、DL-泛酰內(nèi)酯、二十醇；普洱景谷鄉(xiāng)樣品檢測出102個化合物,特征化合物2個,分別是甲酸異戊酯、2,3-二甲基-2-戊烯；普洱市景谷縣景谷鎮(zhèn)樣品測出96個化合物,特征化合物3個,分別是3-戊醇、月桂烯、4-庚基苯酚；普洱振太鄉(xiāng)檢測出93個化合物,特征化合物2個,分別是2-甲基丁酸、仲辛酮；普洱市鎮(zhèn)沅縣者東鎮(zhèn)檢測出98個化合物,無明顯特征化合物.

紅河個舊檢測出79個化合物,特征化合物6個,分別是2,3-二甲基吡嗪、2-環(huán)己烯-1-酮、2-吡咯烷酮、甘油單乙酸酯、5,6-環(huán)氧-3-羥基-β-紫羅蘭酮、誘蟲烯；紅河綠春縣樣品檢測出94個化合物,特征化合物5個,分別是環(huán)庚三烯、3,4-己二酮、馬來酸酐、9-十八炔、十六酸乙烯酯；保山昌寧縣樣品檢測出85個化合物,無明顯特征化合物；保山騰沖檢測出80個化合物,特征化合物1個,分別是二乙基酮；保山施甸縣原何元鄉(xiāng)測出95個化合物,特征化合物2個,分別是乙二醇甲醚、正二十烷；臨滄耿馬縣樣品檢測出102個化合物,特征化合物5個,分別是甲酸異戊酯、環(huán)己基甲醇、3-氧代環(huán)戊烷羧酸、2,6,10-三甲基十二烷、(1R,2R,3S,4R)-2-甲?；?4-甲基-α-亞甲基-3-(3-氧代丁基)環(huán)己烷乙酸；文山馬關(guān)縣樣品檢測出84個化合物,特征化合物是2,6-二甲基-4-庚酮；文山小街鎮(zhèn)檢測出95個化合物,特征化合物5個,分別是乙酰氧基乙酸、甲酸辛酯、乙基環(huán)戊烯醇酮、1-(2-甲基-1-環(huán)戊烯基)乙酮、2,3-二氫苯并呋喃；玉溪新平縣檢測出92個化合物,特征化合物4個,分別是2-羥基-3-甲基-2-環(huán)戊烯酮、1,2,4,4-四甲基環(huán)戊烯、2-甲酚、十二醛；玉溪元江縣樣品檢測出76個化合物,特征化合物2個,分別是乙醇酸甲酯、2,3-二氫-3,5二羥基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮.

2.3 不同產(chǎn)地白花蛇舌草揮發(fā)性成分HS/GC/MS指紋圖譜

2.3.1 不同產(chǎn)地白花蛇舌草揮發(fā)性成分指紋圖譜的建立

為建立共有模式的指紋圖譜,將2.2中得到的不同產(chǎn)地白花蛇舌草揮發(fā)性成分GC-MS總離子流圖數(shù)據(jù)以文本格式導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A版)》軟件,設(shè)定1號白花蛇舌草為參照圖譜,時間窗寬度為0.1,以平均數(shù)法自動匹配生成對照圖譜(R),獲得不同產(chǎn)地白花蛇舌草揮發(fā)性成分GC-MS指紋圖譜,見圖1.

2.3.2 不同產(chǎn)地白花蛇舌草揮發(fā)性成分指紋圖譜的相似度分析

在2.3.1中,采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”對不同產(chǎn)地白花蛇舌草的揮發(fā)性成分GC-MS指紋圖譜進行相似度分析,計算所有樣品的相似度,將相似度計算結(jié)果導(dǎo)入Microsoft Office Excel 2013,得到白花蛇舌草不同產(chǎn)地揮發(fā)性成分相似度分布三維曲面圖,見圖2.

由相似度計算分析可得,不同產(chǎn)地白花蛇舌草之間色譜峰的相似度都比較小,說明不同產(chǎn)地白花蛇舌草間揮發(fā)性成分存在很大差異,不同產(chǎn)地間相似度最大的是西雙版納和普洱鎮(zhèn)沅者東、西雙版納和臨滄、文山馬關(guān)和保山施甸、玉溪新平和保山施甸、臨滄和普洱鎮(zhèn)沅者東、玉溪新平和文山馬關(guān)的白花蛇舌草,以上相似度均大于0.9,說明臨滄、保山施甸、西雙版納、玉溪新平、文山馬關(guān)地區(qū)白花蛇舌草揮發(fā)性成分與含量很相近.其余各地區(qū)的圖譜與對照圖譜之間的相似度在0.385～0.917之間,差值在0.532之間,說明不同地區(qū)之間白花蛇舌草揮發(fā)性成分和含量存在較大差異,分布不穩(wěn)定.

由圖2可知,分布圖主要分為4層,相似度分布曲面圖曲面曲折、峰多,說明白花蛇舌草揮發(fā)性分布不穩(wěn)定,整體差異相對較大.

2.3.3 不同產(chǎn)地白花蛇舌草揮發(fā)性成分指紋圖譜的聚類分析

將不同產(chǎn)地白花蛇舌草的峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS19.0中,進行聚類分析,分析結(jié)果見圖3.由圖3可知,不同地區(qū)白花蛇舌草可以分為5類,德宏戶撒鄉(xiāng)為1類,德宏瑞麗為1類,德宏梁河為1類,玉溪新平和普洱文龍為1類,其他地區(qū)為1類,此聚類分析方法可對不同產(chǎn)地白花蛇舌草揮發(fā)性成分樣品的GC-MS指紋圖譜進行有效的化學(xué)模式識別.

2.3.4 不同產(chǎn)地白花蛇舌草揮發(fā)性成分指紋圖譜的主成分分析

將不同產(chǎn)地白花蛇舌草的峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS19.0中,選擇分析-降維-因子分析,在描述中選擇系數(shù)、顯著性水平和行列式,在旋轉(zhuǎn)中選擇最大方差法,輸出載荷圖,使用正交旋轉(zhuǎn)法進行主成分分析,獲得不同產(chǎn)地白花蛇舌草主成分總方差解釋表,見表3.由表3可知,不同產(chǎn)地白花蛇舌草樣品共提取了5個主成分,主成分1(氨基甲酸銨、乙酸、2-已烯醛)、主成分2(2,3-丁二酮、糠醛、羥基丙酮、(E,E)-4-丙基-4′-戊基-1,1′-聯(lián)環(huán)己烷、6,10,14-三甲基-2-十五烷酮、正己醛、正戊醛、乙酸甲酯、5-甲基呋喃醛、糠醇、2,3-戊二酮、氯甲烷、5-羥甲基糠醛、5 -甲基- 2(5H)-呋喃酮、異丁醛、植物醇、異戊醛、乙酸糠酯)、主成分3(硬脂烷醛、異戊醛、2-甲基丁醛、3-羥基-2-丁酮、蟻酸、葉綠醇、3-甲基呋喃、乙醛、2-甲基呋喃、異植物醇、2-十五烷酮、己酸、丙酸、鄰苯二甲酸二異丁酯、十五醛、2-甲基四氫呋喃-3-酮)、主成分4(二十二醇、棕櫚酸甲酯、3-羥基吡啶、異植物醇、正戊醇、二氫獼猴桃內(nèi)酯)、主成分5(2-正戊基呋喃、甲酸異戊酯、乙二醇二乙酸酯 )的累計方差貢獻率為81.62%,因為5個主成分的累計方差貢獻率大于80%,所以能較好的代表白花蛇舌草不同產(chǎn)地23個樣品全部信息,可以用主成分分析來反映樣品的全部信息.

表3 不同產(chǎn)地白花蛇舌草主成分方差解釋表

3 結(jié)語

本文以云南省不同產(chǎn)區(qū)白花蛇舌草為研究對象,利用頂空進樣,氣相色譜質(zhì)譜法測定不同產(chǎn)區(qū)白花蛇舌草揮發(fā)性成分,探究出頂空進樣氣質(zhì)聯(lián)用測定白花蛇舌草的優(yōu)化條件,在此優(yōu)化條件下,測定22個不同產(chǎn)區(qū)樣品中白花蛇舌草揮發(fā)性成分,22個不同產(chǎn)區(qū)白花蛇舌草揮發(fā)性成分整體上具有差異性.利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A版)》軟件,建立不同產(chǎn)地白花蛇舌草揮發(fā)性成分GC-MS指紋圖譜,并對不同產(chǎn)區(qū)揮發(fā)性成分進行相似度分析,得出不同產(chǎn)地白花蛇舌草之間色譜峰的相似度都比較小,說明白花蛇舌草不同產(chǎn)地間的揮發(fā)性成分存在很大差異,其中西雙版納和普洱鎮(zhèn)沅者東、西雙版納和臨滄、文山馬關(guān)和保山施甸、玉溪新平和保山施甸、臨滄和普洱鎮(zhèn)沅者東、玉溪新平和文山馬關(guān)相似度均大于0.9,說明臨滄、保山施甸、西雙版納、玉溪新平、文山馬關(guān)揮發(fā)性成分與含量很相近；各地區(qū)的圖譜與對照圖譜之間的相似度在0.385～0.917之間,說明不同地區(qū)之間白花蛇舌草揮發(fā)性成分和含量存在較大差異,分布不穩(wěn)定.對不同產(chǎn)區(qū)白花蛇舌草進行聚類分析可得,云南白花蛇舌草不同地區(qū)可以分為5類,德宏戶撒鄉(xiāng)為1類,德宏瑞麗為1類,德宏梁河為1類,玉溪新平和普洱文龍為1類,其他地區(qū)為1類,此聚類分析方法可對白花蛇舌草不同產(chǎn)地揮發(fā)性成分樣品的GC-MS指紋圖譜進行有效的化學(xué)模式識別.對云南不同產(chǎn)區(qū)樣品進行主成分分析,共提取了5個主成分,累計方差貢獻率為81.62%,能較好的代表白花蛇舌草不同產(chǎn)地23個樣品全部信息.