鄭瑋才，郝小燕，張宏祥，項斌偉，張文佳，張春香，張建新

（1山西農業(yè)大學動物科技學院，山西太谷 030801；2山西祥和嶺上農牧開發(fā)有限公司，山西右玉037200；3山西省右玉縣畜牧局，山西右玉 037200）

0 引言

【研究意義】益生菌作為飼料添加劑已成為禁抗時代的熱門研究方向，它具有天然、無害、無殘留、無副作用、安全可靠等的特點，主要包括乳酸菌類微生態(tài)制劑、芽孢桿菌類微生態(tài)制劑、酵母菌類微生態(tài)制劑、光合細菌類微生態(tài)制劑及復合微生態(tài)制劑等[1]?！厩叭搜芯窟M展】釀酒酵母和地衣芽孢桿菌作為常用的微生態(tài)制劑，單獨飼喂具有提高反芻動物營養(yǎng)物質利用率、改善瘤胃發(fā)酵、增強免疫力、提高生產性能等作用[2-4]，前期體外試驗結果[5]表明釀酒酵母和地衣芽孢桿菌組合應用可以提高產氣量、穩(wěn)定瘤胃液pH、提高氮的利用以及提高能量利用率，【本研究切入點】但二者組合應用對反芻動物生產性能、瘤胃代謝方面的研究甚少，仍需進一步探索?！緮M解決的關鍵問題】通過飼喂釀酒酵母和地衣芽孢桿菌探究其對綿羊生長性能和瘤胃發(fā)酵的影響作用，旨在為釀酒酵母和地衣芽孢桿菌在肉羊飼糧中的合理應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間及地點

試驗于2018年1月1日至3月16日在山西省晉中市太谷縣山西農業(yè)大學牧站進行。

1.2 試驗設計及飼糧

試驗選用48只4月齡、體重相近（22.96±2.00）kg、健康的杜泊×小尾寒羊雜交F1代公羔，根據(jù)飼喂添加劑不同隨機分為4組：D（對照組，兩種菌均不添加）；D1（釀酒酵母，6×1010CFU/kg）；D2（地衣芽孢桿菌，2×1010CFU/kg）；D3（釀酒酵母6×1010CFU/kg+地衣芽孢桿菌 2×1010CFU/kg）；釀酒酵母購買于安琪酵母股份有限公司的成品顆粒狀制劑，實測活菌數(shù)2×1010CFU/g；地衣芽孢桿菌購于天津坤禾生物科技集團股份有限公司的成品粉狀制劑，實測活菌數(shù) 2×1010CFU/g，飼糧精粗比為60﹕40，參考NRC（2007）綿羊營養(yǎng)需要中體重20 kg、日增重300 g公羔的營養(yǎng)需要配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗羊單欄飼養(yǎng)，每天分別于08:00和18:00進行飼喂，自由采食和飲水，預飼期15 d，正飼期60 d。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平（干物質基礎）Table 1 Composition and nutrient level of diets (DM basis,%)

1.4 生長性能的測定

正飼期內每天準確稱量記錄每只試驗羊的喂料量和剩料量，計算平均日采食重（ADFI，非DM基礎）。在正飼期第1、30、60天晨飼前對試驗羊進行稱重，計算平均日增重（ADG）。根據(jù)ADFI和ADG計算料重比（F/G）=ADFI/ADG。

1.5 樣品采集

于正飼期結束當天08：00正常飼喂試驗羊，3 h后通過口腔插管采集瘤胃液50 mL，經4層紗布過濾后分裝，-80℃保存一份用于瘤胃微生物定量分析；測定pH后，剩余樣品-20℃保存，用于測定瘤胃各發(fā)酵指標。

1.6 樣品測定

1.6.1 飼糧常規(guī)養(yǎng)分測定 參考 AOAC（2000）[6]方法測定飼糧的DM、粗灰分（Ash）、粗脂肪（EE）和粗蛋白質（CP）含量，參考VAN SOEST法[7]測定飼糧的中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）含量，采用原子吸收分光光度計法測定飼糧的鈣（Ca）含量[8]，采用釩鉬黃比色法測定飼糧的磷（P）含量[9]。

1.6.2 瘤胃液指標測定 瘤胃發(fā)酵指標的測定：參考WANG等[10]方法利用氣相色譜儀（Aglient 7890B，美國）測定VFA濃度；采用亞硝基鐵氰化鈉-次氯酸鈉法并利用紫外分光光度計（UV-1800PC，Mapada）測定NH3-N濃度[11]。

瘤胃酶活的測定：參照 AGARWAL等[12]方法測定β-葡萄糖苷酶、果膠酶、羥甲基纖維素酶、木聚糖酶和淀粉酶的活性，胃蛋白酶采用試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定。

瘤胃微生物的測定：采用珠磨-CTAB法提取瘤胃微生物DNA[13]，用核酸蛋白測定儀測定DNA濃度，并用TE buffer將DNA稀釋至100 ng·mL-1。通過文獻查找瘤胃分解菌的 16SrDNA序列，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成引物序列（表 2）。根據(jù)TaKaRa公司SYBR? Primic Ex TaqTM（TliRNaseH Plus）試劑盒說明書以及ABI stepone plus實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀器說明操作，對目的基因進行Real-time PCR。PCR反應體系20.0 μL：10.0 μLSYBR?PrimicExTaqTM（TliRNaseH Plus）（2x），0.3 μLPCR Forward Primer（10 μmol·L-1），0.3 μLPCR Reverse Primer（10 μmol·L-1），0.4 μLROX Reference Dye（50x）×2，7.0 μLdH2O（滅菌蒸餾水），2.0 μLDNA模板。

表2 基因引物序列Table 2 Primer sequences of genes

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)用Excel 2010進行初步整理，采用SPSS 22.0進行單因素方差分析，當差異顯著時用 Duncan氏法進行多重比較，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 飼糧中添加釀酒酵母和地衣芽孢桿菌對綿羊生長性能的影響

由表3可知，添加釀酒酵母和地衣芽孢桿菌對試驗羊終末體重及平均采食量的影響均不顯著（P＞0.05）。D3組的ADG顯著高于D組（P＜0.05）。與D組相比，D3組的F/G顯著降低（P＜0.05），但D1和D2組差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 飼糧中添加釀酒酵母和地衣芽孢桿菌對綿羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

由表4可知，添加釀酒酵母和地衣芽孢桿菌對瘤胃液 pH、丁酸濃度及乙丙比的影響均不顯著（P＞0.05）。D3組的NH3-N濃度顯著低于D組（P＜0.05），TVFA和丙酸濃度顯著高于D組（P＜0.05），且D3組與 D1和 D2組均差異不顯著（P＞0.05）。D3與D2組的乙酸濃度顯著高于D1與D組（P＜0.05），D組乙酸濃度最低。

表3 飼糧中添加釀酒酵母和地衣芽孢桿菌對綿羊生長性能的影響Table 3 Effects of Saccharomyces cerevisiae and Bacillus licheniformis in diets on growth performance of sheep

2.3 飼糧中添加釀酒酵母和地衣芽孢桿菌對綿羊瘤胃液中消化酶活性的影響

由表5可知，D3組的β-葡萄糖苷酶、羥甲基纖維素酶、木聚糖酶及淀粉酶活性均顯著高于其他 3組（P＜0.05）。D組與 D1和 D2組的 β-葡萄糖苷酶、果膠酶、羥甲基纖維素酶及淀粉酶活性均無顯著差異（P＞0.05）。D3組蛋白酶活性顯著高于 D和 D2 組（P＜0.05），與 D1 組差異不顯著（P＞0.05）。D1和 D2組的各消化酶活性差異均不顯著（P＞0.05）。

2.4 飼糧中添加釀酒酵母和地衣芽孢桿菌對綿羊瘤胃功能微生物的影響

由表6可知，添加釀酒酵母和地衣芽孢桿菌對黃色瘤胃球菌、棲瘤胃普雷沃氏菌、嗜淀粉瘤胃桿菌和原蟲數(shù)量的影響不顯著（P＞0.05），D3組的溶纖維丁酸弧菌數(shù)顯著高于其他3組（P＜0.05），白色瘤胃球菌和產琥珀酸絲狀桿菌數(shù)顯著高于D組（P＞0.05），但與D1和D2組差異不顯著（P＞0.05）。與D組相比，試驗組產甲烷菌數(shù)量顯著降低（P＜0.05），其中D3組最低。

表4 飼糧中添加釀酒酵母和地衣芽孢桿菌對綿羊瘤胃發(fā)酵的影響Table 4 Effects of Saccharomyces cerevisiae and Bacillus licheniformis in diets on rumen fermentation of sheep

表5 飼糧中添加釀酒酵母和地衣芽孢桿菌對綿羊瘤胃液中消化酶活的影響Table 5 Effects of Saccharomyces cerevisiae and Bacillus licheniformis in diets on rumen digestion enzyme activity of sheep (U/mL)

表6 飼糧中添加釀酒酵母和地衣芽孢桿菌對綿羊瘤胃功能微生物的影響Table 6 Effects of Saccharomyces cerevisiae and Bacillus licheniformis in diets on ruminal functional microbiotaof sheep (%)

3 討論

前人研究表明益生菌可以促進小腸發(fā)育，有利于維持幼齡反芻動物小腸絨毛形態(tài)結構完整，并且可以產生多種酶類和非特異性免疫調節(jié)因子，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和B族維生素等，這些物質能提高動物對飼料的利用率[19-20]。芽孢桿菌可以改善動物腸上皮緊密連接，是保護動物腸道免疫的第一道“防火墻”，同時可以直接作用于腸道黏膜免疫系統(tǒng)，提高腸粘膜sIgA分泌水平，抑制有害菌的繁殖，從而促進腸道健康和機體對營養(yǎng)物質的吸收利用[21]，提高動物的生長速度。耿春銀等[22]和董曉麗[23]的研究表明分別向育肥牛和哺乳期犢牛添加 50g·d-1的酵母制劑和 2.0×108CFU/（h·d）的枯草芽孢桿菌均對ADG影響差異不顯著，但是具有增高的趨勢，這與本試驗中單獨添加釀酒酵母組或地衣芽孢桿菌組較對照組 ADG有改善但差異不顯著的結果相似。但FRANCIA等[24-25]的研究表明添加釀酒酵母和地衣芽孢桿菌均使得 ADG高于對照組，不同研究結果存在一定差異的原因可能是因為添加水平、試驗動物或者試驗飼糧組成等因素。但兩種菌共同作用對綿羊的生長產生了正組合效應，作用效果明顯好于其他3組。

瘤胃作為反芻動物獨特的消化器官，在整個消化過程中起著非常重要的作用，pH、NH3-N濃度和VFA的組成比例等指標，基本反映了瘤胃的內環(huán)境及飼料在瘤胃內的發(fā)酵過程。反芻動物對飼料中碳水化合物的消化吸收是以在瘤胃內生成VFA為主，VFA是反芻動物重要的能量來源，主要由乙酸、丙酸和丁酸組成[26]。動物采食后由于飼料中碳水化合物的發(fā)酵產生大量VFA，導致瘤胃pH下降。機體對VFA的不斷吸收、堿性唾液的不斷輸入以及瘤胃代謝過程堿性產物緩沖作用，使瘤胃 pH在一定范圍內波動，而過高過低的瘤胃pH均會影響瘤胃內環(huán)境的穩(wěn)定。瘤胃pH的變動范圍一般在6.0—7.0，最佳范圍為6.2—6.8，此時瘤胃微生物活性最強。本試驗飼喂不同益生菌對pH的影響雖然不顯著，但都處于最佳pH的范圍內。

在正常的瘤胃pH環(huán)境下，陳亮[27]等研究在黑牛飼糧中添加120和240g·kg-1釀酒酵母，結果表明釀酒酵母對湘中黑牛的瘤胃液TVFA濃度無顯著影響；黃帥[25]的研究結果卻表明添加釀酒酵母組的TVFA高于對照組。芽孢桿菌會促進碳水化合物的消化代謝，丁洪濤等[28]在奶牛飼糧中添加枯草芽孢桿菌可以顯著提高TVFA的含量。一方面可能是益生菌本身代謝產生的酶類促進營養(yǎng)物質的降解，另一方面，益生菌能夠刺激瘤胃中有益菌的生長，提高飼糧瘤胃降解率。乙酸是反芻動物體內脂肪合成的主要前體物，丙酸是唯一能凈生成葡萄糖的VFA，足夠的丙酸能滿足動物對葡萄糖的需要[29]，本試驗中，D3組的乙酸、丙酸、TVFA濃度高于對照組，為機體提供更多的能量物質，本團隊還發(fā)現(xiàn)兩種益生菌的添加降低了糞和尿能的損失（數(shù)據(jù)未呈現(xiàn)），因此D3組能量利用率較高，日增重最高。A/P值常作為評價瘤胃發(fā)酵類型的標志，一般認為A/P值小于3屬于丙酸發(fā)酵類型，而大于3為乙酸發(fā)酵類型[30]。本試驗瘤胃的A/P值均在3以上，說明釀酒酵母和地衣芽孢桿菌沒有改變瘤胃發(fā)酵類型。

穩(wěn)定的瘤胃內環(huán)境有助于微生物蛋白的合成。NH3-N是瘤胃微生物降解飼料蛋白質生成的，是合成菌體蛋白的主要前體物質[27]。有前人的試驗證明，釀酒酵母可以刺激瘤胃微生物菌群利用 NH3-N合成蛋白質[3,31]。PROHASZKA等[32]在豬飼料中添加芽孢桿菌后，發(fā)現(xiàn)腸道內 NH3濃度降低。肖怡[33]研究表明添加 2.4×1010CFU/kg的地衣芽孢桿菌使肉羊瘤胃NH3-N濃度降低，本試驗中僅添加釀酒酵母和地衣芽孢桿菌也降低瘤胃中NH3-N濃度，原因可能是釀酒酵母促進微生物利用氨氮合成微生物蛋白，且這一結果與瘤胃中有益菌數(shù)量增加、試驗羊生長性能提高的結果相吻合。

瘤胃微生物對飼料的降解作用依賴于各種消化酶的活性，瘤胃微生物可以分泌產生各種消化酶以分解飼糧中的營養(yǎng)物質[34]，白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、產琥珀絲狀桿菌和溶纖維丁酸弧菌是反芻動物瘤胃中主要的纖維分解菌，具有很強的纖維降解能力。溶纖維丁酸弧菌和棲瘤胃普雷沃氏菌能夠分泌分解蛋白的酶，尤其是棲瘤胃普雷沃氏菌，在蛋白質和多肽類的代謝中起重要的作用。嗜淀粉瘤胃桿菌只能利用α-葡萄糖作為能量來源，對瘤胃淀粉降解至關重要[35]。有研究表明，酵母菌和芽孢桿菌能夠刺激瘤胃中琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌、溶纖維丁酸弧菌脂解厭氧弧桿菌的生長和繁殖[24,35]。本試驗中，僅飼喂釀酒酵母組和僅飼喂地衣芽孢桿菌組與對照組相比均提高了瘤胃中纖維分解菌的數(shù)量，這與前人的研究結果一致[36-37]，說明這兩種菌可以促進瘤胃有益菌的生長。酶活性反映了瘤胃中各類微生物的數(shù)量和活力[38]，且有研究表明益生菌會提高瘤胃蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶的活性[39]。本試驗中單獨飼喂釀酒酵母和地衣芽孢桿菌組與對照組相比，酶活均有所提高，且組合飼喂組的酶活優(yōu)于單獨添加組，說明兩種菌共同作用時產生正向組合效應，而且酵母菌和芽孢桿菌在消化道內還可以產生蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、木聚糖酶和幾丁質酶等[28,40]，提高飼料的利用率。

反芻動物CH4生成量主要受日糧結構、瘤胃發(fā)酵類型及微生物區(qū)系等因素的影響，瘤胃發(fā)酵趨于丙酸型發(fā)酵或甲烷菌數(shù)量的減少，可降低瘤胃CH4的產量。原蟲和產甲烷菌之間屬于共生關系，瘤胃中原蟲的表面通常有甲烷菌與之結合，甲烷菌以寄生的方式在原蟲體上生存[41]。PLATA[42]報道添加酵母菌能增加原蟲數(shù)，但更多的報道表明酵母菌的添加對原蟲沒有顯著影響[43-44]，與本試驗結果一致。孫鵬[45]研究結果表明日糧添加納豆枯草芽孢桿菌可以降低產甲烷菌，在一定程度上可以減少甲烷的生成，從而提高能量利用率。釀酒酵母和地衣芽孢桿菌共同作用在促進瘤胃細菌優(yōu)勢菌生長、抑制甲烷菌生長方面呈現(xiàn)正組合效應，可能與細菌之間的協(xié)同作用有關，其具體機理還有待進一步研究。

4 結論

飼糧中添加 6×1010CFU/kg釀酒酵母和 2×1010CFU/kg地衣芽孢桿菌均會對綿羊瘤胃發(fā)酵產生積極影響，提高了瘤胃VFA濃度和消化酶的活性，增加了瘤胃有益菌的數(shù)量，從而提高飼料利用率，促進動物消化吸收，且兩種益生菌組合飼喂對瘤胃發(fā)酵和生長性能改善效果更佳。