郭靖宜 許 剛

（遼寧省地質(zhì)礦產(chǎn)研究院有限責(zé)任公司 遼寧 沈陽(yáng) 110032）

前 言

在很久之前我們的祖先就發(fā)現(xiàn)了砷的化合物，但是一直到上個(gè)世紀(jì)人類(lèi)才開(kāi)始研究砷的化合物，人類(lèi)通過(guò)飲食將食物與飲用水中的砷富集到體內(nèi)，研究表明當(dāng)人類(lèi)長(zhǎng)期飲用砷含量高的水，患皮膚癌與其他內(nèi)臟癌的概率很高，低含量砷暴露能否致癌是科學(xué)家們爭(zhēng)論的焦點(diǎn)[1]。盡管如此砷被各大研究機(jī)構(gòu)定為致癌物[2]。

元素在不同形態(tài)時(shí)，其毒性大小也不相同，在砷的各化合物中，AsB以及AsC對(duì)人類(lèi)沒(méi)有危害，有機(jī)砷形態(tài)存在時(shí)毒性很小，而無(wú)機(jī)砷形態(tài)存在時(shí)毒性最大，因此在研究砷元素在動(dòng)物體內(nèi)的生理與毒理作用，需要分析砷元素各個(gè)形態(tài)[3～5]。單一的儀器或技術(shù)顯然不能滿(mǎn)足要求。

自20世紀(jì)80年代，儀器聯(lián)用被Chesterfield提出，之后儀器聯(lián)用技術(shù)發(fā)展進(jìn)入快車(chē)道，許珺輝等采用高效液相色譜分離樣品，使用氫化物發(fā)生原子熒光光譜法測(cè)定了尿液中砷元素的四種形態(tài)，Ma Ming-sheng等[6]用同樣的方法分析了尿液中砷的四種形態(tài)，并取得了一定的效果，而國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家認(rèn)為元素形態(tài)分離發(fā)展最完善的技術(shù)是HPLC-ICP-MS聯(lián)用，因此本文采用HPLC與ICP-MS聯(lián)用，對(duì)兩種分析樣品中砷元素的各形態(tài)進(jìn)行定性與定量分析[7～8]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑

砷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：三價(jià)砷酸根（AsO33-）、五價(jià)砷酸根（AsO43-）、一甲基砷、二甲基砷、砷甜菜堿（AsB）、砷膽堿（AsC）；四丁基氫氧化氨（TBAH），丙二酸，甲醇（色譜純）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

1.2.1H P L C儀器工作條件

Waters626型高效液相裝置，以μm Kromasil硅膠為填料的反相C18色譜柱（150mm×4.6mm id）用于色譜的分離。

最佳流動(dòng)相組成：18.8mM四丁基氫氧化氨，2mM丙二酸，4%甲醇（PH=5.95），流速：1ml.min-1進(jìn)樣量：25μL。

1.2.2I C P-MS操作條件

采用Thermo公司的Xseries2型ICP-MS系統(tǒng)，配有Scott玻璃同心霧化器，由于用ICP-MS作為檢測(cè)器，砷的檢測(cè)受到所用載氣Ar與Cl原子的干擾，所以要用碰撞反應(yīng)池技術(shù)來(lái)測(cè)定[9]，具體參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 典型的ICP-MS條件Table 1 The typical conditions for ICP-MS

1.3 樣品的采集及前處理

1.3.1 人體尿樣

尿樣是經(jīng)過(guò)ICP-MS測(cè)定后重金屬含量較高的樣品（尤其是總砷的含量），因?yàn)椴杉蟛荒芗皶r(shí)分析，因此加少量酸后于-30℃冷藏。分析前解凍，樣品不用稀釋直接用一次性注射器經(jīng)PhenoIilenex 0.45μm孔徑的有機(jī)濾膜過(guò)濾。

1.3.2 環(huán)境水樣

水樣采自沈陽(yáng)渾河河水，樣品采集時(shí)分六點(diǎn)采樣，每處的樣品首先經(jīng)過(guò)濾膜過(guò)濾，然后集中裝入經(jīng)過(guò)二次水多次洗滌的PE瓶中。因?yàn)椴苫貋?lái)的樣品是直接進(jìn)行分析的，因此不需冷藏，只需加少量酸酸化后用一次性注射器經(jīng)PhenoIilenex 0.45μm孔徑的有機(jī)濾膜過(guò)濾。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及具體操作

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)配制

用購(gòu)買(mǎi)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)配制成1mg/ml的六種砷的儲(chǔ)備液，于棕色容量瓶?jī)?nèi)冷藏。分析前用millpore系統(tǒng)凈化的水（18.2MΩ）將貯備液配制成10ng/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)和六種砷的單標(biāo)，作為建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4.2 砷形態(tài)分析方法

首先用ICP-MS對(duì)砷含量較高的人體尿液進(jìn)行砷總量的測(cè)定。通過(guò)一根PEEK管將Waters626型高效液相色譜的出口端與ICP-MS的進(jìn)樣口相連，采用時(shí)間分辨模式（TRA）來(lái)監(jiān)控被分析物信號(hào)[10～11]。

用混合標(biāo)準(zhǔn)和單標(biāo)來(lái)確定六種砷的保留時(shí)間，然后用微量注射器將經(jīng)過(guò)處理后的人體尿液與渾河河水注入25μl的進(jìn)樣環(huán)，每個(gè)樣品平行3次，并做了兩個(gè)不同濃度的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，同樣重復(fù)3次。最后根據(jù)峰面積積分來(lái)計(jì)算每種形態(tài)的含量和加標(biāo)回收率，從而檢驗(yàn)整個(gè)分析方法可行性。

2 結(jié)果和討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1T B A H濃度的影響

四丁基氫氧化氨（TBAH）在流動(dòng)相作為離子對(duì)試劑。其濃度的大小決定砷各形態(tài)的分離程度，實(shí)驗(yàn)中逐步增加TBAH的濃度，當(dāng)其濃度增加到18.8mM時(shí)，即可消除As（Ⅲ）和DMA的峰重疊，同樣也可消除As（Ⅴ）與MMA的重疊[12]，因此最終流動(dòng)相中TBAH的濃度18.8mM見(jiàn)圖1。

圖1 TBAH濃度對(duì)砷形態(tài)保留時(shí)間的影響Fig.1 The effect of TBAH concentration on the retention time of arsenic species

2.1.2 丙二酸濃度的優(yōu)化

圖2 丙二酸的濃度對(duì)砷形態(tài)保留時(shí)間的影響Fig.2 The effect of malonic acid concentration on the retention time of arsenic species

流動(dòng)相中的緩沖溶液一般是用來(lái)分離酸性和堿性分析物的，不同的分析物緩沖液的種類(lèi)和濃度也不同[13]。在砷形態(tài)研究中經(jīng)常使用丙二酸作為緩沖液。丙二酸濃度不同，每種砷形態(tài)保留時(shí)間也不相同，在實(shí)驗(yàn)中不斷增加丙二酸的濃度，隨著丙二酸濃度的增加，As（V）的保留時(shí)間顯著的縮短。當(dāng)丙二酸的濃度為1mol/L時(shí)As（V）的保留時(shí)間的變化趨于平和，當(dāng)丙二酸的濃度為2mmol/L可以使As（V）和砷的其他形態(tài)得到有效分離，最終確定丙二酸的濃度為2mmol/L見(jiàn)圖2。

2.1.3 甲醇濃度的影響

在流動(dòng)相中加入少量甲醇可以增強(qiáng)ICP-MS檢測(cè)砷信號(hào)的靈敏度。在實(shí)驗(yàn)時(shí)分別在流動(dòng)相中加入0%～4%（V/V）的甲醇，圖3所示，加入不同量甲醇對(duì)砷各形態(tài)的保留時(shí)間并沒(méi)有顯著的影響。但是，考慮到甲醇濃度會(huì)影響砷各形態(tài)信號(hào)的強(qiáng)度，因此確定甲醇的最佳加入量為4%（V/V）。

圖3 甲醇濃度對(duì)砷各形態(tài)保留時(shí)間的影響Fig.3 The effect of methanol concentration on the retention time of various arsenic species

2.2實(shí)際樣品的分析

2.2.1混合標(biāo)準(zhǔn)中砷形態(tài)的確定

用優(yōu)化好的色譜分離條件對(duì)10ng/mL的單標(biāo)和混合標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析，分別測(cè)定三次來(lái)確定每種砷形態(tài)的出峰時(shí)間，從而根據(jù)峰面積建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖4。

圖4 10ng/mL時(shí)六種砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)的色譜峰（從左至右依次為：AsC,AsB,As（III）,DMA,MMA,As（V）Fig.4 The chromatographic peaks of the mixed standard of six arsenic species with a concentration of 10ng/mL（From left to right：AsC,AsB,As（III）,DMA,MMA and As（V）

2.2.2 尿液中砷形態(tài)的分析

采用優(yōu)化的色譜分離條件對(duì)人體尿液中的砷形態(tài)進(jìn)行分析，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的出峰位置來(lái)確定尿液中所含砷的形態(tài)。首先測(cè)定了樣品中所含砷的總量，而砷各形態(tài)含量的總和相對(duì)于總量的比值為97%；對(duì)樣品平行測(cè)定三次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3%，取其濃度平均值。測(cè)定出樣品中含有三種形態(tài)的有機(jī)砷，其含量列于表2，同時(shí)設(shè)計(jì)了兩個(gè)濃度的加標(biāo)回收率的實(shí)驗(yàn)。圖5是尿液中所含砷各種形態(tài)的色譜峰，圖6則是加入10ng/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)的色譜峰。

圖5 尿液中的砷形態(tài)的色譜峰Fig.5 The chromatographic peaks of the arsenic species in urine

圖6 加標(biāo)為10ng/ml的尿液的色譜峰Fig.6 The chromatographic peaks of the urine with a standard concentration of 10ng/mL

2.2.3 渾河河水中砷形態(tài)的分析

渾河河水屬于環(huán)境水樣，通過(guò)三次平行測(cè)定，樣品中沒(méi)有檢測(cè)出砷的任何形態(tài)。ICP-MS對(duì)渾河和水中砷的總量進(jìn)行測(cè)定同樣未檢出。

2.3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

由于沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，為了驗(yàn)證整個(gè)分析方法的可行性，設(shè)計(jì)了兩個(gè)濃度梯度的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，其回收率都在99.8%～110%之間，這說(shuō)明該分析方法在一定程度上還是具有可信度的。人體尿樣與渾河河水中各形態(tài)砷的含量以及加標(biāo)回收率列于表2。

表2 尿液和渾河河水中各種砷形態(tài)的含量、總砷含量及加標(biāo)回收率Table 2 The contents of various arsenic species,total arsenic content,and the standard recovery rate in urine and water from Hunhe River

3 結(jié)論

嘗試采用反相離子對(duì)高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜（HPLC-ICP-MS）聯(lián)用測(cè)定砷元素的各種形態(tài)，并對(duì)色譜條件進(jìn)行了一系列的優(yōu)化，最終成功地分離了沈陽(yáng)渾河河水樣和尿樣中As（Ⅲ）、As（Ⅴ）、MMA、DMA四種砷化合物，取得了理想的實(shí)驗(yàn)效果。