李海泉 趙杰 賈曉民 張衍民 杜永亮 黃建安

1徐州醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科221006；2蘇州大學第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科215005

微小RNA (micro RNA,miRNA)是近幾年來分子生物學和腫瘤學領域的研究熱點。miRNA是一類新發(fā)現(xiàn)的長度為18～24個核昔酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA[1],在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達具有高度的物種保守性[2]。迄今為止已發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種miRNA,廣泛存在于各種生物體中,參與細胞的增值、凋亡、分化、代謝炎癥以及個體發(fā)育和病毒感染等過程[3-4]。

雖然miR-21在腫瘤中具有廣譜性,但是越來越多的文獻表明其更與肺部腫瘤有著明顯的相關性,和肺癌細胞的凋亡、轉(zhuǎn)移和侵襲有著很重要的聯(lián)系[5]。所以本研究將進一步揭示調(diào)控miR-21表達對肺癌細胞A549生長、轉(zhuǎn)移和凋亡的影響,初步探討其腫瘤抑制作用的機制。前期研究表明大多數(shù)肺癌患者中的miR-21相對正常組織偏高,說明miR-21在肺癌中高表達。本實驗研究miR-21對人肺癌細胞株的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力是否有影響,并對相應的機制進行探究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 RPMI 1640培養(yǎng)液、H-DMEM培養(yǎng)基購于美國GIBCO 公司、胎牛血清購于美國Hyclone公司。A549人肺癌細胞株購于武漢博士德生物科技有限公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本Ta KaRa公司,動物總RNA 快速提取試劑盒購于上海Generay 公司,Micro RNA hsa-miR-21-5p mimic 由上海吉瑪公司設計合成。Annexin VFITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒為南京凱基生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品,Transwell小室購于美國Corning公司。PCR 儀為德國Eppendorf公司產(chǎn)品,流式細胞儀為美國Becton Dickinson 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) A549人肺癌細胞株由武漢博士德生物科技有限公司提供。細胞復蘇后,用含10%FBS 與雙抗 (100 U/ml青霉素、100 ng/L鏈霉素)的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng),每隔24 h 更換1次溶液。細胞密度在90%以上時,胰蛋白酶消化進行細胞傳代。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的細胞,接種于24孔板中,每孔的細胞量為5.0×105個并培養(yǎng)24 h,顯微鏡下觀察細胞達約70%～90%,將miRNA 用滅菌無核酶水稀釋至相應濃度,并分裝好,于-80℃保存。按每孔250μl(5μl lipo 2000+245μl Opti-MEM 低血清培養(yǎng)基)稀釋轉(zhuǎn)染試劑lipo2000,室溫孵育5 min；按照每孔250μl(5μl miRNA+245μl Opti-MEM 低血清培養(yǎng)基)稀釋miRNA,將稀釋后的lipo2000 與miRNA 混勻,室溫孵育20 min,形成miRNA-lipo2000混合物。轉(zhuǎn)染之前,棄舊培養(yǎng)基,以4 ℃預冷的PBS 洗3遍,按每孔1.5 ml加入Opti-MEM 低血清培養(yǎng)基,使得miRNA-lipo2000混合物和Opti-MEM 低血清培養(yǎng)基總體積為2 ml。按分組 (空白組、miR-21高表達質(zhì)?？蛰d對照組、miR-21 高表達組、miR-21敲減質(zhì)粒空載對照組、miR-21敲減組)將miRNA-lipo2000混合液加入到相應孔內(nèi),轉(zhuǎn)染完成后將細胞放置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.3 熒光定量qRT-PCR 檢測 離心收集細胞(離心半徑3 cm,1 000 r/min離心8 min),按照Trizol試劑盒說明書提取細胞的總RNA。將提取的總RNA 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將m RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,按照qPCR 試劑產(chǎn)品說明書進行定量PCR。反應體系20μl：2×qPCR Master Mix 10μl,正反向引物(10μmol/L)各0.2μl,ROXI染 料0.4 μl,RT 反 應 液 (cDNA)2 μl,補 充dd H2O 至20 μl。反 應 條 件：擴 增 程 序：95 ℃5 min 1個循環(huán)；95 ℃5 s,60 ℃31 s 40個循環(huán)。熔解程序：95 ℃15 s,60℃30 s,95℃15 s。之后采用Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.1分析軟件及ΔΔCT 法定量分析擴增曲線及溶解曲線。按上述方法分別檢測miR-21 轉(zhuǎn)染效率及PTEN、RECK、Caspase3 m RNA 水平。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞增殖能力 收集細胞,調(diào)節(jié)細胞密度至5 000個/100μl。分別取3塊96孔板,加入細胞懸液,每孔100μl。放入細胞培養(yǎng)箱,37℃,5%CO2培養(yǎng)過夜。第3、4、5天分別取出96孔板,棄上清,每孔加入100μl含0.5%FBS的新鮮培養(yǎng)基,再每孔加入10 μl CCK8,37 ℃孵育4 h。將96孔板放入酶標儀,540 nm 進行讀數(shù)。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法 (Western blot) 將細胞加入裂解液含1μmol/L 的PMSF)重懸細胞后,4 ℃裂解30 min,取上清BCA 法測定測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳后蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜。浸入含5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,在4 ℃下加入一抗過夜,并用二抗在37 ℃下孵育1 h。用TBST 洗膜3次,化學光敏模式曝光顯影。用Image J軟件對目的條帶的灰度值進行半定量分析。

1.2.6 細胞侵襲與遷移 用50 mg/L Matrigel 1∶4稀釋液,取50μl包被Transwell小室底部膜的上室面,37 ℃放置4 h,使Matrigel聚合成凝膠。取細胞懸液200 μl (5×105/ml)加入Transwell小室,下室加入600μl含10% FBS 培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。取出Transwell小室,PBS清洗,甲醇固定,0.1%結(jié)晶紫染色20 min,用棉簽擦除上層細胞。400倍顯微鏡下隨機選擇5個視野,觀察細胞,計數(shù)。評估細胞侵襲能力。取細胞懸液200μl(5×105/ml)加入Transwell小室,下室加入600μl含10% FBS培養(yǎng)基,培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。對小室下室側(cè)細胞進行固定染色。400倍顯微鏡下隨機5個視野觀察細胞,計數(shù)。評估細胞遷移能力。

1.2.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡及細胞周期 收集細胞,取105個重懸的細胞離心 (離心半徑3 cm,1 000 r/min 離心8 min)后,加入100μl反應液(FITC 10μl、碘化丙啶5μl、1×Binding Buffer 85μl)重懸置室溫避光孵育15 min。加入400μl Binding Buffer結(jié)合液輕輕混勻。最后進行流式細胞儀檢測,用Cell Quest等軟件進行分析凋亡情況。同樣方法收集細胞,加入1 ml冰浴預冷70%乙醇中,置4 ℃過夜。離心(離心半徑3 cm,1 000 r/min離心8 min),棄上清,PBS洗滌。加入500μl PI染色工作液,重懸置于37℃避光水浴。用流式細胞儀檢測,軟件分析細胞周期相關數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)。通過兩獨立樣本t檢驗進行樣本的兩兩比較,并通過單因素方差分析進行多組樣本比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量qRT-PCR 驗證miR-21轉(zhuǎn)染A549人肺癌細胞 miR-21高表達組miR-21的含量顯著高于空白組和miR-21高表達質(zhì)?？蛰d對照組(t=48.56、45.25,P值均＜0.01),而miR-21敲減組miR-21的含量較空白組和miR-21敲減質(zhì)?？蛰d對照組表現(xiàn)出較低的趨勢 (t=24.09、24.92,P值均＜0.01),見圖1。

圖1 熒光定量qRT-PCR 驗證miR-21轉(zhuǎn)染A549人肺癌細胞

2.2 miR-21高表達促進A549細胞增殖 miR-21轉(zhuǎn)染48 h及72 h,miR-21高表達組吸光度值均高于其他組,差異均有統(tǒng)計學意義 (F=43.061、74.862,P值均＜0.01),見圖2。

圖2 miR-21促進A549細胞增殖

2.3 Western blot檢測A549 細胞中蛋白表達水平 miR-21 高表達組磷酸化AKT、Caspase 3、MMP-9和MMP-2蛋白水平較空白組及miR-21高表達質(zhì)?？蛰d對照組均明顯上升 (P值均＜0.05),3 組AKT 蛋白水平未見明顯變化。miR-21 高 表 達 組 PTEN、Cleaved-Caspase 3、RECK 蛋白水平較空白組及miR-21高表達質(zhì)?？蛰d對照組均明顯下降 (P值均＜0.05)。反之,miR-21敲減組磷酸化AKT、Caspase 3、MMP-9和MMP-2蛋白水平較空白組及miR-21敲減質(zhì)?？蛰d對照組均明顯下降 (P值均＜0.05),3 組AKT 蛋白水平未見明顯變化。miR-21 敲減組PTEN、Cleaved-Caspase 3、RECK 蛋白水平較空白組及miR-21敲減質(zhì)?？蛰d對照組均明顯上升(P值均＜0.05)。見圖3。

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測經(jīng)miR-21轉(zhuǎn)染后A549細胞中蛋白表達水平

2.4 熒光定量qRT-PCR 檢測miR-21 肺癌細胞m RNA 水平 miR-21高表達組PTEN、RECK 的m RNA 水平均較空白組及miR-21高表達質(zhì)?？蛰d對照組低 (t=15.53、14.82,P值均＜0.01),而miR-21高表達組Caspase 3的mRNA 水平較空白組及miR-21 高表達質(zhì)?？蛰d對照組高 (t=35.36,P＜0.01)。miR-21敲減組PTEN、RECK的m RNA 水平均較空白組及miR-21 敲減質(zhì)粒空載對照組高 (t=43.52、42.45,P值均＜0.01),而miR-21敲減組Caspase 3的m RNA 水平較空白組及miR-21 高表達質(zhì)?？蛰d對照組低 (t=24.37,P＜0.01)。

圖4 熒光定量qRT-PCR 檢測miR-21轉(zhuǎn)染A549人肺癌細胞后的mRNA 水平

2.5 miR-21對癌細胞的侵襲及遷移能力的影響 miR-21高表達組侵襲及遷移能力均較空白組及miR-21高表達質(zhì)?？蛰d對照組強；反之,miR-21敲減組侵襲及遷移能力較空白組及miR-21敲減質(zhì)?？蛰d對照組弱(P值均＜0.05,圖5、6)。

圖5 miR-21高表達增加A549人肺癌細胞的侵襲能力 結(jié)晶紫染色 ×400 A：空白組；B：miR-21高表達質(zhì)?？蛰d對照組；C：miR-21高表達組；D：miR-21敲減質(zhì)粒空載對照組；E：miR-21敲減組

圖6 miR-21高表達增加A549人肺癌細胞的遷移能力 結(jié)晶紫染色 ×400 A：空白組；B：miR-21高表達質(zhì)?？蛰d對照組；C：miR-21高表達組；D：miR-21敲減質(zhì)?？蛰d對照組；E：miR-21敲減組

2.6 miR-21轉(zhuǎn)染后的A549細胞凋亡及細胞周期檢測 空白組、miR-21 高表達質(zhì)?？蛰d對照組、miR-21高表達組、miR-21 敲減質(zhì)粒空載對照組、miR-21 敲減組的細胞凋亡比例分別為2.706%、3.133%、1.257%、2.929%、7.267%。經(jīng)由細胞阻滯實驗,以上各組的G1 期百分比分別為48.06%、47.50%、47.41%、55.47%、68.37%,G2 期百分比分別為5.54%、6.03%、2.74%、9.31%、8.77%,S 期百分比分別為46.40%、46.47%、49.86%、35.22%、22.86%。見圖7。

3 討論

隨著人們對miRNAs研究的不斷深入,近年來有大量的實驗研究數(shù)據(jù)表明miRNA 與人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在著密切相關性,miRNA 異常表達在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用,其中一些miRNA 可能成為腫瘤治療的新靶點和預后的標志物,它們通過抑制靶基因m RNA 翻譯或誘導靶mRNA 降解在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達,具有癌基因或抑癌基因的功能,參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、耐藥及侵襲轉(zhuǎn)移。

目前人們在對腫瘤的研究過程中發(fā)現(xiàn),miR-21在多種腫瘤細胞的表達出現(xiàn)顯著異常,參與調(diào)控多種抑癌基因的表達。人們在應用熒光定量qRT-PCR 和基因芯片等多種技術發(fā)現(xiàn),miR-21在多種腫瘤中,如白血病、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、前列腺癌、膀膚癌、胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌及甲狀腺癌等組織和細胞中發(fā)現(xiàn)miR-21均有上調(diào)表達,并且臨床資料顯示miR-21的高表達與臨床預后不良有關[6-10]。

為了探究miR-21在肺癌中的生物學作用,本研究構(gòu)建了空白組、miR-21高表達質(zhì)?？蛰d對照組、miR-21高表達組、miR-21敲減質(zhì)?？蛰d對照組、miR-21敲減組,隨后采用熒光定量q RT-PCR和Western blot檢測細胞內(nèi)m RNA 和蛋白含量；通過CCK-8法、Transwell實驗、流式細胞儀檢測對不同細胞體外生長增殖能力、侵襲遷移能力、細胞周期及凋亡等進行研究。結(jié)果顯示：miR-21高表達組的A549人肺癌細胞增殖能力更強,miR-21敲減組吸光度值在各組中最低,推測miR-21敲減抑制A549人肺癌細胞增殖。

miR-21高表達組與miR-21高表達質(zhì)?？蛰d對照組比較,其m RNA 和蛋白表達含量顯著增加,細胞增殖、遷移和侵襲能力明顯增強,細胞中AKT 蛋白水平未見明顯變化,而磷酸化AKT 水平明顯上升,PTEN 蛋白水平出現(xiàn)下降趨勢,Caspase 3 蛋白水平顯著上升,與之對應的Cleaved-Caspase 3 蛋白水平明顯下降；RECK 蛋白水平顯著下降,MMP-9和MMP-2 蛋白水平均呈現(xiàn)顯著上升的趨勢。這提示miR-21高表達促進A549 細 胞 增 殖 (miR-21 敲 減 抑 制A549 細 胞 增殖)可能由AKT/P-AKT/PTEN/Caspase3/Cleaved-Caspase通路及RECK/MMP-2、MMP-9通路參與的。這與本研究中Western blot檢測的結(jié)果基本一致,也輔證miR-21 高表達促進A549 細胞增殖(miR-21敲減抑制A549 細胞增殖)可能確實與PTEN/Caspase 3通路及RECK 通路有關。

圖7 miR-21轉(zhuǎn)染后的A549細胞凋亡檢測 A：空白組；B：miR-21高表達質(zhì)?？蛰d對照組；C：miR-21高表達組；D：miR-21敲減質(zhì)?？蛰d對照組；E：miR-21敲減組

miR-21高表達組中G2細胞減少,S期細胞增多,能夠促進人肺癌細胞周期進行,利于增殖,而且抑制細胞凋亡的作用；而miR-21敲減能夠增加G1、G2期細胞,減少S 期細胞,使細胞阻滯在G1期,抑制細胞增殖。本研究證實miR-21 在肺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中起到原癌基因的作用,促進肺癌細胞增殖并抑制肺癌細胞凋亡,并且miRNA-21對人肺癌細胞株的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響是由AKT/P-AKT/Cleaved-Caspsae3/MMP-2/MMP-9細胞信號通路引起的,為肺癌診治及判斷預后提供了一定的實驗基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突