孫凡童 李瑩 朱秋明

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤一科150001

肺癌是對人類健康威脅最大的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和病死率增長極快[1]。長期大量吸煙與肺癌的發(fā)生關(guān)系密切。此外,接觸環(huán)境致癌物、電離輻射、既往肺部慢性感染及大氣污染等也與肺癌發(fā)生有關(guān)[2]。伴隨基因組學(xué)及現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展,基因治療已成為替代化學(xué)治療的一大熱點和趨勢。成纖維細(xì)胞生長因子 (fibroblast growth factor,FGF)可直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,參與各種內(nèi)分泌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、胚胎發(fā)育、分化的調(diào)控及血管生成,在大多數(shù)惡性腫瘤中存在異常表達(dá)[3-4]。本研究通過RNA 干擾技術(shù)抑制人肺癌A549細(xì)胞中FGF4的表達(dá),觀察其對人肺癌A549細(xì)胞增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌A549細(xì)胞株 (中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫),針對FGF4 siRNA 及陰性對照siRNA (蘇州吉瑪基因股份有限公司),DMSO (北京索萊寶生物公司),胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基 (江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司),Annexin-V/PI試劑盒 (北京索萊寶生物公司),Bcl-2及Bax抗體(北京中杉金橋公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和青霉素100 U/ml、鏈霉素100 ng/L 的DMEM 培養(yǎng)基中,培養(yǎng)箱內(nèi)溫度為37 ℃,CO2體積分?jǐn)?shù)為5%,每3 d傳代1次,更換新鮮培養(yǎng)液,取對數(shù)期生長的細(xì)胞進(jìn)行實驗,細(xì)胞密度達(dá)到80%左右,用胰酶消化進(jìn)行實驗。

1.2.2 免疫熒光法檢測A549細(xì)胞中FGF4表達(dá) 細(xì)胞消化后接種于六孔板中,移液管吸除培養(yǎng)液后PBS 洗3 遍,4%多聚甲醛溶液固定15 min,0.1% Triton X-100作用20 min后用含10%血清的封閉液封閉25 min,加FGF4抗體,24 h后加入帶紅色熒光的二抗,室溫下避光孵育1 h,甘油封片后熒光顯微鏡下觀察FGF4表達(dá)。

1.2.3 siRNA 轉(zhuǎn)染及細(xì)胞分組 按照LipofectamineTM2000試劑轉(zhuǎn)染,PCR 方法檢測轉(zhuǎn)染效率。細(xì)胞分3組：空白對照組(無特殊處理)、siNC組(轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒)和siFGF4組(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染干擾FGF4表達(dá)的siRNA),細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.4 CCK-8檢測細(xì)胞增殖能力 細(xì)胞接種于96孔板中,細(xì)胞密度調(diào)整為5×104個/L,每組設(shè)5個復(fù)孔,同時設(shè)置空白孔 (有培養(yǎng)基,無細(xì)胞),按照上述分組方法孵育24 h 后將培養(yǎng)液吸出,PBS輕輕沖洗3次,每孔分別加入20μl已配置含的10%CCK-8溶液,培養(yǎng)1 h后測定450 nm 各孔的吸光值。

1.2.5 Annexin V/PI檢測凋亡 用不含EDTA的胰酶消化A549細(xì)胞后制備細(xì)胞懸液,離心半徑為10 cm,1 000 r/min離心5 min并收集細(xì)胞,預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次,收集細(xì)胞并用100μl緩沖液重懸細(xì)胞,加入5μl Annexin-V 和10μl PI,輕輕混勻,避光反應(yīng)10 min后再次加入100μl緩沖液,1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 Hoechst 33258染色法檢測凋亡 A549細(xì)胞接種于12孔板中,調(diào)整細(xì)胞密度至5×104/ml,4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min,去固定液并用PBS沖洗2 次,PBS 洗滌時手動晃動數(shù)次。加入Hoechst染色液后室溫避光反應(yīng)10 min,PBS洗滌2次后再超凈臺中避光風(fēng)干,倒置熒光顯微鏡下觀查并拍照。Hoechst 33258染色劑能穿過細(xì)胞膜嵌入細(xì)胞核DNA,使之發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光。非凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)熒光深淺不一的結(jié)構(gòu)樣特征。凋亡的細(xì)胞核染色增強(qiáng),染色質(zhì)濃縮、邊集,呈團(tuán)塊狀,可見核碎片。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法 (Western blot)檢測細(xì)胞內(nèi)Bcl-2 和Bax 的蛋白表達(dá) 提取蛋白質(zhì)后以Brandford法測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳,設(shè)置一抗稀釋濃度為1∶1 000,二抗稀釋濃度為1∶2 000,ECL化學(xué)發(fā)光法顯影,統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果以樣本目的蛋白的光密度比內(nèi)參條帶的光密度計算相對表達(dá)率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù),所有數(shù)據(jù)以x-±s表示,兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗,多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光檢測A549細(xì)胞中FGF4的表達(dá)

FGF4蛋白在細(xì)胞核及細(xì)胞漿中均有表達(dá),如圖1所示 (紅色熒光標(biāo)記)；藍(lán)色熒光標(biāo)記的代表DAPI染色的細(xì)胞核。

2.2 FGF4下調(diào)抑制A549細(xì)胞增殖能力 CCK-8結(jié)果顯示,siFGF4組細(xì)胞增殖能力明顯受到抑制(51.10%±3.51%),與空白對照組 (99.05%±3.11%)和siNC 組 (99.00%±3.59%)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=46.73,P＜0.01),空白對照組與siNC 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (t=0.01,P＞0.05),見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染siFGF4后的A549細(xì)胞增殖率

2.3 Western blot法檢測A549細(xì)胞中FGF4蛋白表達(dá) 與空白對照組 (101.35% ±3.41%)及siNC組 (99.80%±2.41%)比較,siFGF4 組的蛋白表達(dá) (40.36%±5.37%)明顯降低 (F=78.37,P＜0.01),見圖3。

2.4 下調(diào)FGF4表達(dá)促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果顯示,siFGF4組細(xì)胞凋亡率為(59.99%±5.52%),高于空白對照組 (2.98%±2.24%)及siNC 組 (4.76%±2.05%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=67.54,P＜0.01),空白對照組與siNC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.43,P＞0.05),見圖4。

圖3 siRNA 轉(zhuǎn)染后FGF4表達(dá)水平變化

2.5 下調(diào)FGF4表達(dá)對A549細(xì)胞凋亡的影響

空白對照組及siNC 組未見亮藍(lán)色凋亡細(xì)胞,siFGF4組有散在亮藍(lán)色凋亡細(xì)胞(圖5)。

2.6 FGF4 表達(dá)下調(diào)影響凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 和Bax的表達(dá) Western blot結(jié)果顯示,與空白對照組及siNC組相比,siFGF4組Bcl-2的蛋白表達(dá)水平明顯降低(F=51.53,P＜0.01),Bax的蛋白表達(dá)水平明顯升高 (F=41.33,P＜0.05,圖6)。

3 討論

圖1 免疫熒光檢測A549細(xì)胞中成纖維細(xì)胞生長因子4的表達(dá) A：成纖維細(xì)胞生長因子4的表達(dá)；B：DAPI染色的細(xì)胞核；C：A與B合并

圖4 流式細(xì)胞技術(shù)檢測siFGF4對A549細(xì)胞凋亡率的影響 A：空白對照組；B：siNC組；C：siFGF4組

圖5 下調(diào)成纖維細(xì)胞生長因子4表達(dá)促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡 A：空白對照組；B：siNC組；C：siFGF4組

手術(shù)治療是肺癌首選治療方法,通過手術(shù)可以完全切除肺癌原發(fā)病灶及有可能轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié),達(dá)到臨床早期診斷與治療[5]。但是對于侵襲性縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者及已有廣泛轉(zhuǎn)移的晚期肺癌者來說,手術(shù)很難完全清除病灶。90%以上的肺癌需要化學(xué)治療,化療藥物通過作用于腫瘤細(xì)胞生長和繁殖的不同階段來抑制或殺死腫瘤細(xì)胞,但常伴有不同程度的不良反應(yīng)[6]。它們在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時,對人體正常的免疫防御系統(tǒng)中的細(xì)胞及組織也有殺傷作用,這些健康屏障破壞后,癌細(xì)胞會進(jìn)一步擴(kuò)散,造成嚴(yán)重后果[7]。因此,除早期手術(shù)切除以外,探求新的治療策略及多途徑治療機(jī)制的藥物日益受到廣大學(xué)者的關(guān)注。

基因靶向治療已經(jīng)成為肺癌治療中的一大熱點,繼續(xù)積極尋找新的靶向基因?qū)γ鞔_肺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制及治療肺癌有重要意義。FGF4主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞上,已經(jīng)被證明是癌基因,參與細(xì)胞衰老調(diào)控、與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[8-9]。研究顯示,FGF4在肺癌中呈高表達(dá)。李江超等[10]通過免疫組織化學(xué)技術(shù)對1例肺癌患者癌組織及癌旁組織進(jìn)行FGF4抗體檢測,發(fā)現(xiàn)癌組織中的FGF4表達(dá)量較癌旁組織高。

本研究選用A549 細(xì)胞中FGF4 表達(dá)較高細(xì)胞,采用siRNA 轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默F(xiàn)GF4的表達(dá)水平,進(jìn)一步觀察FGF4基因?qū)Ψ伟〢549細(xì)胞增殖及凋亡的影響。研究結(jié)果顯示,沉默F(xiàn)GF4 表達(dá)后,A549細(xì)胞增殖率顯著降低,凋亡率顯著增加。此外,本實驗進(jìn)一步對沉默F(xiàn)GF4的表達(dá)抑制人肺癌A549細(xì)胞增殖活性的機(jī)制進(jìn)行初步探討。

圖6 下調(diào)FGF4表達(dá)對A549細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

細(xì)胞凋亡具有復(fù)雜的分子生物學(xué)特征,涉及一系列基因的表達(dá)、調(diào)控及激活。細(xì)胞凋亡過程中清除了異常細(xì)胞,保證了生物體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,為促進(jìn)系統(tǒng)發(fā)育發(fā)揮作用。多種因素如衰老、藥物、氧化損傷、射線等,能夠誘發(fā)凋亡反應(yīng),當(dāng)機(jī)體正常的凋亡過程受到破壞或凋亡過程紊亂時,引發(fā)多種疾病,例如自身免疫性疾病及腫瘤。Bcl-2家族是線粒體凋亡途徑中的重要調(diào)節(jié)因素,其中,Bcl-2屬于抗凋亡基因,Bax屬于促凋亡基因,通過調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究中,Western blot結(jié)果顯示,FGF4 的表達(dá)受抑制后,Bcl-2表達(dá)下調(diào),Bax的表達(dá)上調(diào)。

上述結(jié)果表明,沉默F(xiàn)GF4 表達(dá)可抑制肺癌A549細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡,其機(jī)制與改變凋亡相關(guān)因子表達(dá)有關(guān)。本研究為肺癌基因靶向治療及機(jī)制研究提供新的方法,對改善肺癌預(yù)后具有潛在價值。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突