陳 竹

(上海天祥質(zhì)量技術(shù)服務(wù)有限公司，上海 200030)

食品安全逐漸成為最近幾年各行各業(yè)最普遍關(guān)注的話題，增強(qiáng)食品檢驗(yàn)，做好食品分析，在促進(jìn)食品生產(chǎn)、管理和消費(fèi)方面發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。目前萬(wàn)古霉素作為抗生素被一些養(yǎng)殖者和飼料生產(chǎn)企業(yè)在動(dòng)物飼喂過(guò)程中添加，該藥物可通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)人類生命構(gòu)成了極大的威脅。目前萬(wàn)古霉素有多種測(cè)定方法，每個(gè)方法都有自己合適的基質(zhì)以及檢出限。比如色譜分析主要是根據(jù)混合物中不同物質(zhì)的自身特性和相對(duì)運(yùn)動(dòng)來(lái)分離它們，以達(dá)到檢測(cè)的目的和效果。色譜分離法具有分析速度快、選擇性高、靈敏度高的特點(diǎn)，在食品檢測(cè)中普遍應(yīng)用，且檢測(cè)質(zhì)量相對(duì)較高。但是質(zhì)譜法是在色譜分析的基礎(chǔ)上開發(fā)的。它不僅可以檢測(cè)食品中的農(nóng)藥殘留，還可以進(jìn)行色譜分析。這是鑒定純物質(zhì)最有效的方法之一。質(zhì)譜法主要用于確定分子量，確定化學(xué)式和確定物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，并已廣泛用于臨床，食品測(cè)試和藥物生物化學(xué)領(lǐng)域。質(zhì)譜分離效率高，檢測(cè)靈敏度高，非常適合食品檢測(cè)中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。由于對(duì)樣品要求低、選擇性好、分離速度快，可以實(shí)現(xiàn)多組農(nóng)藥的定性和定量分析，可以快速準(zhǔn)確地分析農(nóng)藥殘留的成分和組成，是檢測(cè)農(nóng)藥和食品中的殘留物的好方法。在質(zhì)譜的應(yīng)用中，有許多檢測(cè)儀器。測(cè)試不同的物質(zhì)時(shí)，必須選擇相應(yīng)的儀器以確保測(cè)試的準(zhǔn)確性。在食品檢驗(yàn)中，有必要根據(jù)樣品和檢驗(yàn)?zāi)康拇_定所需的檢驗(yàn)設(shè)備，以使監(jiān)測(cè)儀器的應(yīng)用特性最大化。本實(shí)驗(yàn)主要建立用LCMSMS測(cè)定雞肉豬肉中的萬(wàn)古霉素。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑耗材[1]

Waters TQ-S高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(配有電噴霧離子源)；Eppendorf高速冷凍離心機(jī)(8000 r/min)；分析天平(精確到0.1 mg)；分析天平(精確到0.01 mg)；超聲波清洗器，科導(dǎo)；渦旋混勻器；均質(zhì)器；氮吹濃縮儀；SUPELCO固相萃取裝置；Waters-60 mg/3 mL或等效陽(yáng)離子交換柱(MCX)；Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 μm*100 mm,1.7 μm)；乙腈 HPLC級(jí)；甲醇HPLC級(jí)；氨水AR級(jí)；甲酸AR級(jí)；甲酸HPLC級(jí)；乙酸銨HPLC級(jí)；三氯乙酸AR級(jí)；微孔濾膜0.22 μm有機(jī)濾膜。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品配置及儲(chǔ)存[2]

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)名稱：萬(wàn)古霉素；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)英文名稱；vancomycin；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)CAS號(hào)：1404-92-6。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：市售100 μg/mL，-18 ℃儲(chǔ)存，有效期12個(gè)月；一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)中間液 (1.0 μg/mL)：準(zhǔn)確移取50 μL儲(chǔ)備液于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，4 ℃儲(chǔ)存，有效期6個(gè)月；二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)中間液 (100 ng/mL):準(zhǔn)確移取100 μL一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)中間液于1 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，4 ℃儲(chǔ)存，有效期3個(gè)月。

曲線配置：線性范圍1.0～20.0 ng/mL，用陰性樣品基質(zhì)溶液定容。

1.3 樣品前處理[3]

提取：準(zhǔn)確稱量稱取2 g(精確至0.1 mg)雞肉或豬肉樣品，加入5 mL 5%三氯乙酸：乙腈(4：1)溶液，渦旋混勻2 min，水浴超聲15 min(注意超聲儀水溫不宜過(guò)高)，8000 r/min冷凍離心5 min，重復(fù)上述提取操作，合并提取液于10 mL容量瓶中，用5%三氯乙酸：乙腈(4：1)溶液定容至刻度線，充分渦旋混勻2 min，待凈化。

凈化：將Waters MCX柱安裝好，依次用5 mL甲醇，5 mL 0.1%甲酸水溶液活化，準(zhǔn)確移取2 mL待凈化樣液過(guò)柱，流速控制在0.3 mL/min，樣液滴完后用5 mL甲醇淋洗，6 mL 5%氨化甲醇洗脫，收集洗脫液于40 ℃氮吹至干，用1 mL 0.1%甲酸水溶液復(fù)溶，過(guò)0.22 μm微孔濾膜后，供高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀器測(cè)定。

1.4 高效液相色譜條件[4]

色譜柱：Waters Xbridge BEH C18100 mm×2.1 mm，1.7 μm；

流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為0.1%甲酸5 mmol乙酸銨溶液;

流速：0.3 mL/min；

進(jìn)樣量：5 μL；

柱溫：45 ℃。

表1 液相方法流速及梯度

1.5 質(zhì)譜條件[5]

離子源：電噴霧離子源(ESI)；

檢測(cè)方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)；

掃描方式：正離子模式；

離子源溫度：150 ℃；

噴霧電壓：3.5 kV；

錐孔電壓：38 V；

脫溶劑氣溫度：450 ℃；

脫溶劑氣流速：800 L/Hr。

1.6 監(jiān)測(cè)離子對(duì)參數(shù)[6]

表2 萬(wàn)古霉素質(zhì)譜信息

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)圖譜

圖1為萬(wàn)古霉素標(biāo)品圖，圖2為萬(wàn)古霉素曲線線形圖，圖3為雞肉空白樣品圖，圖4為雞肉檢出限加標(biāo)圖。

圖1 萬(wàn)古霉素標(biāo)品圖

圖2 萬(wàn)古霉素曲線線形圖

圖3 雞肉空白樣品圖

圖4 雞肉檢出限加標(biāo)圖

2.2 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

(1)實(shí)驗(yàn)過(guò)程要有平行試驗(yàn)，空白實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)實(shí)驗(yàn)作為質(zhì)控。

(2)按照確定的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜條件測(cè)定樣品和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍之內(nèi)，以色譜峰面積外標(biāo)法定量，正離子掃描模式。

(3)被測(cè)組分選擇1個(gè)母離子，2個(gè)子離子，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，試樣中待測(cè)物質(zhì)的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間偏差在±2.5%之內(nèi)，且試樣譜圖中各組分定性離子的相對(duì)豐度于標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中定性離子的相對(duì)豐度，其允許偏差不超過(guò)下表規(guī)定的范圍時(shí)，則可確定為樣品中存在這種待測(cè)物。

定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差見表3。

表3 離子豐度比參考表

2.3 討 論

質(zhì)譜法是在色譜分析的基礎(chǔ)上開發(fā)的。它不僅可以檢測(cè)食品中的農(nóng)藥殘留，還可以進(jìn)行色譜分析。這是鑒定純物質(zhì)最有效的方法之一。質(zhì)譜法主要用于確定分子量，確定化學(xué)式和確定物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，并已廣泛用于臨床，食品測(cè)試和藥物生物化學(xué)領(lǐng)域。質(zhì)譜分離效率高，檢測(cè)靈敏度高，非常適合食品檢測(cè)中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。但是在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)按照提取劑比例不同，目標(biāo)物及基質(zhì)被萃取的也不同[2]，此次實(shí)驗(yàn)過(guò)程主要是在降低基質(zhì)干擾提高回收率，例如提取劑的比例，不同比例萃取效果不一樣，比如上樣體積，上樣體積越多，即使我淋洗液再多，它的基質(zhì)干擾很強(qiáng)，本底噪音很高，于是嘗試了減少樣品量，在儀器響應(yīng)能滿足的情況下減少基質(zhì)干擾，從而達(dá)到效益最大化。在保證標(biāo)品的響應(yīng)沒有問(wèn)題的前提下，再優(yōu)化前處理，是此次嘗試減少上樣體積的原因。

3 結(jié) 論

本文參考較多的萬(wàn)古霉素相關(guān)文獻(xiàn)資料建立了適合豬肉、雞肉的萬(wàn)古霉素檢測(cè)方法。所涉及的色譜柱流動(dòng)相為實(shí)驗(yàn)室常見類型這點(diǎn)較為方便，只是對(duì)于提取劑的要求較高，并且適用基質(zhì)不是那么全面。正常實(shí)驗(yàn)條件下，回收率均在75%及以上，回收率穩(wěn)定偏上。實(shí)驗(yàn)前處理簡(jiǎn)單且儀器分析時(shí)間較短，較為適合樣本量較大的實(shí)驗(yàn)室。