王慶學(xué) 吳雍真 李 倩 杜海洋 劉春艷 柴藝匯

貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025

2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus;T2DM)是由于胰島素抵抗與胰島β細(xì)胞功能失常導(dǎo)致碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪代謝異常，以高血糖為特征的代謝性疾病[1]。據(jù)統(tǒng)計，我國糖尿病患者數(shù)量位居世界首位，僅在2015年就約有130萬人因糖尿病及其并發(fā)癥死亡，且其中60歲以下占總死亡人數(shù)40.8%，呈逐漸低齡化的趨勢，并且國際糖尿病聯(lián)盟預(yù)測，到2040年我國將有1.51億糖尿病患者[2]。現(xiàn)階段臨床上對T2DM的治療主要為口服傳統(tǒng)降糖藥、注射胰島素等為主，雖可一定程度控制病情，但很難從根本上治愈T2DM[3]。因此，對T2DM的防治急需研發(fā)出安全高效的新方法。T2DM歸屬中醫(yī)“消渴”范疇，與西醫(yī)相比中醫(yī)重視辨證論治、內(nèi)外并重，不僅療效良好、副作用低，還可有效緩解并發(fā)癥的發(fā)生，提高患者的生活質(zhì)量。

中藥黃芪(Astragali Radix)已有2000多年的藥用史，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，具有補(bǔ)氣升陽、斂瘡生肌、利尿消腫、固表止汗、補(bǔ)益腎氣等功效[4-5]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗感染、糖尿病、心血管疾病等方面具有重要作用[6]。通過對臨床上治療T2DM有效的中醫(yī)藥方劑進(jìn)行收集、整理、分析發(fā)現(xiàn)黃芪用藥頻次較高，為治療T2DM的常用藥[7]。研究顯示，黃芪甲苷可通過調(diào)節(jié)糖脂代謝、炎癥反應(yīng)、胰島素抵抗等方面防治糖尿病[8]，同時臨床觀察也顯示中藥黃芪對T2DM的防治顯示出良好的療效[9]。黃芪防治T2DM具有多成分、多靶點等特點，故藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制難以明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可多方位揭示藥物治療疾病的潛在作用機(jī)制，涉及多個學(xué)科的技術(shù)與知識。已有研究表明，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中藥的作用機(jī)制符合中醫(yī)藥整體作用特點，方法準(zhǔn)確可靠[10]。鑒于此，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，篩選藥物的活性成分及黃芪防治T2DM的潛在靶點，構(gòu)建“藥物-活性成分-靶蛋白-疾病”網(wǎng)絡(luò)，對靶點進(jìn)行富集分析，探討其潛在作用機(jī)制，為后續(xù)實驗驗證提供科學(xué)依據(jù)。

1 方法

1.1 篩選黃芪有效活性成分與T2DM靶蛋白 通過TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫搜集黃芪的化學(xué)成分；以口服生物利用度(OB)≥30，藥物相似度(DL)≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)，篩選黃芪有效活性成分，并查詢有效活性成分相對應(yīng)的靶點。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)獲得T2DM相關(guān)靶點。所得化合物的靶點與T2DM靶點取交集，使用Cytoscape v3.7.2軟件構(gòu)建藥物-活性成分-靶蛋白-疾病可視化聯(lián)系。

1.2 構(gòu)建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 將交集得到靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)(PPI)互作網(wǎng)絡(luò)。將Degree從大至小排序，以前30為標(biāo)準(zhǔn)篩選核心靶點。

1.3 GO功能富集分析和KEGG富集分析 將1.2篩選出的核心靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov),以人類為研究對象進(jìn)行GO(gene ontology)注釋和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析，將P值設(shè)為小于0.01。其中GO分析包括生物過程(BP)、細(xì)胞成分(CC)和分子功能(MF)。

2 結(jié)果

2.1 黃芪有效成分及靶蛋白分析 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索關(guān)鍵詞“黃芪”獲得成分87個，通過相關(guān)條件篩選得到黃芪有效成分20個(如表1所示)，并查詢獲得有效活性成分相對應(yīng)的靶點，剔除4個未查詢到靶點的活性成分，結(jié)果顯示16個活性成分共對應(yīng)210個靶點。在GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索關(guān)鍵詞“Type 2 diabetes mellitus”，篩選得到相應(yīng)靶點后取并集，刪除重復(fù)項后獲得T2DM相關(guān)靶點。將篩選獲得的有效活性成分對應(yīng)的靶點與T2DM相關(guān)靶點取交集，獲得57個靶點分別對應(yīng)13個活性成分。Degree排前5的有效活性成分為槲皮素(quercetin)、山萘酚(kaempferol)、異鼠李素(isorhamnetin)、刺芒柄花素(formononetin)、毛蕊異黃酮(Calycosin)，這些可能為黃芪治療T2DM的關(guān)鍵有效成分(如表2所示)。利用Cytoscape軟件建立“藥物-活性成分-靶蛋白-疾病”網(wǎng)絡(luò)(如圖1所示)。

表1 TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出黃芪有效成分

表2 關(guān)鍵有效成分

2.2 構(gòu)建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 將重合的57個靶點導(dǎo)入String作PPI網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)共有57個節(jié)點，512條邊(如圖2所示)，根據(jù)Degree大小排列，取前30篩選為核心靶點(如圖3所示)。將核心靶點對應(yīng)的有效成分與2.1所得的5個可能為黃芪治療T2DM的有效成分取交集，結(jié)果顯示交集與之前5個有效成分相同，故推測，槲皮素、山萘酚、異鼠李素、芒柄花黃素、毛蕊異黃酮可能是黃芪治療T2DM的關(guān)鍵有效成分。

2.3 基因功能與通路富集分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫對黃芪治療T2DM的30個潛在作用的核心靶點進(jìn)行分析，根據(jù)P<0.01，共得到116個GO注釋，46條KEGG通路。按P值大小，篩選出前20個GO注釋(如圖4所示)，表中GO注釋12個與BP有關(guān)，7個與MF有關(guān)，1個與CC有關(guān)，GO注釋大多與BP和MF相關(guān)，如轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、酶結(jié)合、基因表達(dá)正調(diào)控、RNA聚合酶II啟動子對轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等。

KEGG結(jié)果顯示，30個核心靶點共富集在46條通路上，主要集中在癌癥信號通路、乙型肝炎、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、病毒性心肌炎、低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)信號通路、人嗜T淋巴細(xì)胞病毒I型感染、軍團(tuán)菌病、p53信號通路、催乳素信號通路、雌激素信號通路等。P值排前20條通路(如圖5所示)。

3 討論

3.1 黃芪發(fā)揮作用的關(guān)鍵有效成分 近年來，眾多實驗及臨床觀察均證實黃芪對T2DM具有良好的療效，但對其有效成分與機(jī)制尚不明確。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，構(gòu)建“藥物-活性成分-靶蛋白-疾病”網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示黃芪13個活性成分對應(yīng)T2DM的57個靶點，并通過分析獲得黃芪治療T2DM的關(guān)鍵活性成分可能為槲皮素、山萘酚、異鼠李素、芒柄花黃素、毛蕊異黃酮，其中，作用最強(qiáng)的兩個化合物均被報道有明顯降糖作用。槲皮素又名槲皮黃素，屬于黃酮類化合物，廣泛存在于植物的果實、花和葉中，具有調(diào)節(jié)血脂和血糖和清除氧自由基、抗腫瘤、抗炎等作用[11]。研究顯示，槲皮素可降低T2DM模型大鼠血糖，并有效減輕其外周胰島素抵抗，并且槲皮素也可改善被高糖抑制的神經(jīng)細(xì)胞增殖活性，減少氧化應(yīng)激損傷[12]。山奈酚又名百蕊草素Ⅲ，屬于黃酮類化合物，具有調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抗氧化等功效。近年研究表明山奈酚在T2DM及并發(fā)癥的防治中具有很大的應(yīng)用前景。山奈酚具有保護(hù)胰島β細(xì)胞功能、改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)血糖血脂的作用，并且對T2DM的并發(fā)癥也具有保護(hù)作用[13]。其余三個關(guān)鍵活性成分與T2DM相關(guān)報道較少，故推測這幾種活性成分與T2DM的研究較少，本研究可為后期深入探討黃芪治療T2DM的有效成分提供理論參考。

3.2 黃芪治療op的核心靶點 對黃芪治療T2DM所涉及的57個靶點進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建并分析，結(jié)果顯示Degree排前30的靶點(圖3)為血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(CASP)3、白介素-6(IL-6)、表皮生長因子受體(EGFR)、絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)等，并推測這些靶點可能在黃芪治療T2DM中發(fā)揮關(guān)鍵作用。VEGF為內(nèi)皮細(xì)胞特異性有絲分裂原，具有強(qiáng)大的促血管形成能力和促血管通透效應(yīng)，對維持微循環(huán)系統(tǒng)功能正常有重要作用，而VEGFA則被認(rèn)為是傳統(tǒng)意義上的VEGF。糖尿病狀態(tài)下，糖基化終末產(chǎn)物及各種細(xì)胞因子的增多、蛋白激酶C的活化等因素均可導(dǎo)致腎臟VEGF的表達(dá)升高[14]。在對T2DM全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)VEGFA基因上的單核苷酸多態(tài)性位點rs9369425與T2DM存在相關(guān)性[15]。IL-6是一種多功能細(xì)胞因子，在免疫、炎癥中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。T2DM患者長期處于低度炎癥的狀態(tài)下，IL-6多存在異常升高。研究顯示，黃芪多糖可調(diào)節(jié)T2DM大鼠IL-6水平，保護(hù)胰島β細(xì)胞，改善機(jī)體糖代謝狀態(tài)[16]。MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是哺乳動物細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的重要信號系統(tǒng)，普遍存在于多種生物。MAPK與T2DM關(guān)系密切，MAPK的激活可促進(jìn)外周胰島素抵抗，抑制胰島素的合成與分泌，增加胰島細(xì)胞的凋亡。

3.3 主要富集通路 GO功能富集分析結(jié)果顯示，黃芪可能在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、酶結(jié)合、基因表達(dá)正調(diào)控、RNA聚合酶II啟動子對轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等過程中起作用，發(fā)揮起防治T2DM的功效。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示黃芪可能調(diào)控癌癥信號通路、乙型肝炎、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、病毒性心肌炎、低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)信號通路、人嗜T淋巴細(xì)胞病毒I型感染、軍團(tuán)菌病、p53信號通路、催乳素信號通路、雌激素信號通路等防治T2DM。這些通路都較為復(fù)雜，包括多個下游通路。例如顯著性最高的癌癥信號通路包括、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)信號通路、Wnt信號通路、MAPK信號通路等[17]。PPAR是調(diào)節(jié)目標(biāo)基因表達(dá)的核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄因子超家族成員，具有多種生物學(xué)效應(yīng)。研究顯示，PPAR在T2DM中具有重要作用，其可增強(qiáng)機(jī)體對胰島素的敏感性、調(diào)節(jié)體內(nèi)糖代謝平衡等[18]。Wnt信號通路是調(diào)控器官生長和分化的重要通路之一，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。Wnt信號通路在糖尿病發(fā)生發(fā)展中的作用已受到廣泛關(guān)注，也有研究證實，Wnt信號通路多個組成成分參與胰島β細(xì)胞的增殖、葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌等[19]。MAPK是一組細(xì)胞內(nèi)廣泛分布的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其可磷酸化靶蛋白來調(diào)控信號通路，抑制肝臟對糖的輸出、降低脂肪生成和三酰甘油合成，從而發(fā)揮能量代謝功能。并且MAPK可通過上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運載體-4的表達(dá)，促進(jìn)糖的吸收與利用，增加胰島素敏感性和改善胰島素抵抗[20]。此外，雌激素、TNF與胰島素具有密切關(guān)系，雌激素可影響胰島素敏感性，并且其水平降低可減弱雌激素抑制TNF釋放的作用，TNF-α抑制脂肪、肌肉細(xì)胞胰島素受體在胰島素刺激后自體硫酸化能力，并顯著降低葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)[21]。

綜上所述，本研究初步驗證和預(yù)測黃芪治療T2DM的有效成分與分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)結(jié)果呈現(xiàn)多成分、多靶點、多通路的特性，可為后續(xù)深入研究其具體機(jī)制提供思路和基礎(chǔ)。