張曉磊 章秋艷 熊 煒 沈 平*

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 科技發(fā)展中心，北京 100122； 2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所，哈爾濱 150086； 3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所，天津 300191)

1 轉(zhuǎn)基因植物概述

轉(zhuǎn)基因植物(transgenic plant)是指將帶有目標(biāo)性狀的基因通過基因工程技術(shù)的改良，然后導(dǎo)入到受體植物基因組中的植物。這些外源轉(zhuǎn)入的目的基因不僅能夠在后代中穩(wěn)定遺傳，同時(shí)還可以使轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生新的農(nóng)藝性狀，如抗蟲、耐除草劑、抗逆、抗病、改善作物營養(yǎng)和品質(zhì)等[1]。轉(zhuǎn)基因作物自1996年商業(yè)化以來，種植面積從最初的170萬hm2增加到2018年的1.917億hm2，增長了112倍。目前全球共有70個(gè)國家/地區(qū)的轉(zhuǎn)基因安全監(jiān)管機(jī)構(gòu)允許轉(zhuǎn)基因作物用于糧食、飼料以及商業(yè)化種植。此外，已經(jīng)上市的轉(zhuǎn)基因作物除了大豆、玉米、棉花和油菜以外，還有其他轉(zhuǎn)基因作物如苜蓿、甜菜、木瓜、南瓜、茄子等，因此給全球消費(fèi)者呈現(xiàn)了越來越多的選擇。具有防止褐變、丙烯酰胺含量低等性狀的馬鈴薯以及防褐變的Arctic蘋果已經(jīng)開始在美國和加拿大進(jìn)行種植。此外，巴西還批準(zhǔn)了一種抗蟲甘蔗，并于2018年進(jìn)行商業(yè)化種植[2]。全球轉(zhuǎn)基因作物的種植和進(jìn)口量持續(xù)激增，進(jìn)一步證明了轉(zhuǎn)基因作物帶來了一系列的農(nóng)業(yè)、經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，復(fù)合性的轉(zhuǎn)基因植物不斷增加，因此對其安全監(jiān)管和精準(zhǔn)檢測也有了更高的要求。因此，轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)的開發(fā)和不斷創(chuàng)新顯得格外重要，也能夠?yàn)閲覍D(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全監(jiān)管提供更有力的技術(shù)保障。

2 轉(zhuǎn)基因植物安全評估

轉(zhuǎn)基因植物從實(shí)驗(yàn)室研發(fā)到進(jìn)行安全評估，再到商業(yè)化是一個(gè)比較漫長、投入較大，同時(shí)技術(shù)要求比較高的過程?！皩?shí)質(zhì)等同性”原則是目前國際上公認(rèn)的轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)的可行性原則，指的是轉(zhuǎn)基因生物與自然存在的傳統(tǒng)生物在相同條件下進(jìn)行可行性比較，如果實(shí)質(zhì)相同，就應(yīng)該同樣對待，即認(rèn)為該轉(zhuǎn)基因生物安全[3]。我國在國際上的轉(zhuǎn)基因監(jiān)管經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，建立了適應(yīng)我國國情的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)安全監(jiān)管的法律法規(guī)體系、技術(shù)支撐體系和政府行政管理體系。在建立的轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)監(jiān)管體系中主要分為5個(gè)階段，分別是實(shí)驗(yàn)研究、中間試驗(yàn)、環(huán)境釋放、生產(chǎn)性試驗(yàn)和申請安全證書，而且我國要求對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)施強(qiáng)制標(biāo)識制度。在安全評價(jià)過程中，主要是對轉(zhuǎn)基因植物分子特征方面進(jìn)行分析和鑒定，分子特征的識別主要是從核酸水平和蛋白質(zhì)水平評估外源基因插入片段的整合和表達(dá)情況及其在代際間遺傳穩(wěn)定性，明確外源基因的插入位點(diǎn)、插入的具體堿基序列、表達(dá)的產(chǎn)物及發(fā)揮的特性、穩(wěn)定性等[4]。在確定轉(zhuǎn)基因植物分子特征的基礎(chǔ)上，建立有效的轉(zhuǎn)基因身份確認(rèn)方法，從而用于轉(zhuǎn)基因作物的日常安全監(jiān)管和消費(fèi)者知情權(quán)告知等[3]。轉(zhuǎn)基因植物的分子特征分析過程具體見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)基因植物安全評估的分子特征分析Fig.1 Molecular characteristics analysis of the safety assessment of transgenic plants

3 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測方法

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)的研究和開發(fā)成為全球轉(zhuǎn)基因安全監(jiān)管和安全評價(jià)的重要組成部分。目前轉(zhuǎn)基因植物檢測和安全管理工作主要體現(xiàn)在3個(gè)方面：一是出入境檢驗(yàn)檢疫，即進(jìn)出口轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的貨證相符檢驗(yàn)檢疫；二是法律監(jiān)管，即對轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品進(jìn)行市場監(jiān)管與行政執(zhí)法同時(shí)監(jiān)督檢驗(yàn)；三是身份驗(yàn)證，即對轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品安全評價(jià)指定對象的身份確認(rèn)及分子特征信息鑒定[5]。

轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的檢測，主要包括轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)品成分檢測、環(huán)境安全檢測、食用安全檢測3個(gè)方面。

3.1 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測

轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)品成分檢測主要是針對其轉(zhuǎn)入的外源基因的特異性DNA序列及其表達(dá)的蛋白質(zhì)展開的。因此，轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的檢測方法主要是基于核酸水平和基于蛋白質(zhì)水平的檢測。

3.1.1基于PCR技術(shù)的檢測方法

核酸分子，尤其是DNA分子穩(wěn)定性強(qiáng)，加工過程中不易降解，因此基于DNA水平的檢測方法已成為轉(zhuǎn)基因植物檢測的主流手段[6]。PCR方法是目前最準(zhǔn)確的應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物檢測的方法，可用于單重、多重篩選檢測或轉(zhuǎn)基因品系鑒定，也是目前大多數(shù)轉(zhuǎn)基因高通量檢測中靶標(biāo)擴(kuò)增方法之一。基于PCR的檢測方法主要包括定性PCR和定量PCR，定量PCR又包括最常用的定量PCR (quantification PCR)和數(shù)字PCR (digital PCR)。定量PCR是在PCR擴(kuò)增中實(shí)時(shí)收集熒光信號，通過熒光信號-Ct值-靶基因的起始濃度三者之間的關(guān)系，從而確定靶基因的拷貝數(shù)或轉(zhuǎn)基因含量[7]。數(shù)字PCR是近些年發(fā)展起來的一種比較精確的核酸絕對定量方法，該方法是將微量樣品進(jìn)行極度稀釋和分液，直到每個(gè)細(xì)分的待測樣品中所含有的待測分子數(shù)不超過1個(gè)后, 再將所有細(xì)分的待測樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對擴(kuò)增反應(yīng)的樣品逐一計(jì)數(shù)，從而判斷待測樣品的最初濃度[8]。數(shù)字PCR的優(yōu)勢在于不需要依賴Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線，就能夠?qū)崿F(xiàn)對起始樣品的絕對定量。目前，主流的數(shù)字PCR平臺(tái)有3種：第一種是基于集成流體通路(IFC)芯片技術(shù)的數(shù)字PCR (chamber digital PCR)；第二種是微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR)；第三種是基于微流體芯片和通道的數(shù)字PCR平臺(tái)-OpenArray系統(tǒng)。不同的數(shù)字PCR平臺(tái)均已經(jīng)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的檢測，并且在轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量值測定方法中得到了很好的應(yīng)用[9-10]。

轉(zhuǎn)基因植物及產(chǎn)品根據(jù)檢測靶標(biāo)的不同，主要包括篩選元件序列(如CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子)、靶標(biāo)特異性序列(如Cry1Ab、CP4-EPSPS)、構(gòu)建特異性區(qū)域序列(如NOS終止子和NPTII基因之間連接的序列)、品系特異性序列(基因組和外源插入基因整合位點(diǎn)的重組序列)。近年來，已有大量研究報(bào)道了定性PCR、定量PCR以及數(shù)字PCR技術(shù)在不同轉(zhuǎn)基因植物品種、轉(zhuǎn)基因成分檢測上的應(yīng)用，具體信息見表1[11]。

表1 已報(bào)道或驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因生物檢測方法Table 1 Reported or validated test methods for genetically modified organisms

3.1.2等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是近些年快速發(fā)展起來的快速核酸檢測技術(shù)，因其擴(kuò)增過程不需要特殊儀器和溫度循環(huán)就能快速、高效地實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，并且還有成本低、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)有很多種，如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)、依賴核酸序列的擴(kuò)增(nucleic acid sequenced-based amplification, NASBA)、滾環(huán)擴(kuò)增檢測技術(shù)(rolling circle amplification, RCA)、重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinase polymerase amplification, RPA)等[28-29]。

在轉(zhuǎn)基因檢測領(lǐng)域中，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP) 已經(jīng)得到較多的應(yīng)用[30]。該方法通過設(shè)計(jì)的引物能特異性地識別靶標(biāo)序列6個(gè)區(qū)域，在鏈置換性聚合酶(Bst酶)作用下，在恒溫(60～65 ℃)條件下大約40～60 min即可完成核酸擴(kuò)增[31]。在轉(zhuǎn)基因植物檢測領(lǐng)域中， LAMP在轉(zhuǎn)基因篩選元件(如P-CaMV35S、T-NOS、P-NOS、P-FMV35S)、特異性基因(如cry1Ab、cry2Ab、cry3A、Phytasegene)、轉(zhuǎn)基因事件特異性(TT51-1、Bt176、BT11、MON863、MON89788、MS8)等方面都有所應(yīng)用[32-37]。Wang等[38]建立了7種常見轉(zhuǎn)基因元件(CaMV35S啟動(dòng)子,FMV35S啟動(dòng)子,NOS終止子,bar,cry1Ac,CP4epsps,pat和nptII)的LAMP檢測方法，并進(jìn)行了國內(nèi)外協(xié)同驗(yàn)證，為建立該方法的國家標(biāo)準(zhǔn)建立了良好的基礎(chǔ)[39]。Chen等[36]用LAMP方法實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品可視化檢測。Kiddle等[40]報(bào)道了一種提高LAMP檢測靈敏度的方法，將一種熒光報(bào)告基團(tuán)BART與LAMP方法結(jié)合，使其在轉(zhuǎn)基因含量檢測中靈敏度可達(dá)到0.1%。

核酸序列依賴性擴(kuò)增(nucleic acid sequenced-based amplification, NASBA)也是一種在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新擴(kuò)增技術(shù)。該反應(yīng)主要依賴3種酶，即AMW逆轉(zhuǎn)錄酶(起到DNA聚合酶的作用)、T7 RNA聚合酶和RNA酶H。除此之外，該方法的關(guān)鍵在于引物的設(shè)計(jì)，其中一條引物的5′端含有T7 RNA多聚酶的啟動(dòng)子，3′末端與靶序列互補(bǔ)，這一引物是用于合成cDNA的。另一條引物的堿基序列與cDNA的5′末端互補(bǔ)。這種方法最初主要用來進(jìn)行RNA擴(kuò)增，但同樣也適用于DNA擴(kuò)增[41]。Dobnik等[42]建立了一種基于NASBA多重?cái)U(kuò)增方法對轉(zhuǎn)基因事件MON810和MON863進(jìn)行定量分析和復(fù)合檢測，同時(shí)能夠跟芯片雜交技術(shù)結(jié)合進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測。于常海等[43-44]發(fā)明了用NASBA方法檢測轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12和MON89788的專利。

滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circle amplification, RCA)是一種效仿自然界中病原微生物環(huán)狀DNA分子滾環(huán)復(fù)制方式而建立的檢測方法[45]。RCA在擴(kuò)增時(shí)由單鏈DNA引物在DNA聚合酶的作用下，沿著環(huán)狀DNA模板由5′端向3′端方向合成一段線狀單鏈DNA產(chǎn)物。徐君怡等[46]發(fā)明的專利，首次探索了鎖式探針RCA技術(shù)與實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)相結(jié)合，即實(shí)時(shí)熒光RCA法，是可以同步檢測10種轉(zhuǎn)基因玉米品系的高通量、高特異性、高靈敏的檢測技術(shù)。郝振明等[47]開發(fā)了一種結(jié)合超分枝滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)的試紙檢測法，能夠?qū)崿F(xiàn)對食品中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行初步的定性檢測。

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinase polymerase amplification,RPA)，主要是是利用重組酶和單鏈結(jié)合蛋白在常溫下共同作用，從而實(shí)現(xiàn)引物與模板的特異結(jié)合，該方法最大的特點(diǎn)是不需要核酸解鏈和退火的過程，只需一對引物，在37 ℃恒溫條件下進(jìn)行模板核酸的擴(kuò)增[48]。目前，鄧婷婷等[49]建立了基于RPA技術(shù)，建立了轉(zhuǎn)基因水稻Cry1Ab/c基因的快速檢測方法，特異性較好，尤其適用在基層實(shí)驗(yàn)室及現(xiàn)場快速檢測轉(zhuǎn)Cry1Ab/c基因水稻及其制品。金蕪軍等[50-51]發(fā)明了轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻華恢一號(TT51-1)、科豐6號品系特異性的RPA檢測方法。徐潮等[52]建立了基于RPA技術(shù)對玉米、水稻、棉花和大豆等作物中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行了檢測。RPA 技術(shù)的優(yōu)勢在于不需要依賴復(fù)雜的儀器設(shè)備，因此即使在經(jīng)濟(jì)條件不好，資源匱乏的區(qū)域也能夠具有很好的應(yīng)用前景，更為以后的現(xiàn)場田間檢測提供了更多的選擇。

3.1.3基于蛋白水平的檢測方法

蛋白質(zhì)水平的檢測是根據(jù)免疫學(xué)的原理，即利用轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中表達(dá)的特定蛋白作為抗原和抗體特異性結(jié)合的原理對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行快速檢測。目前, 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和側(cè)向流動(dòng)免疫測定(lateral flow devices, LFD)是2種最主要的基于蛋白水平的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測方法[53]。

目前已經(jīng)有很多基于不同蛋白的ELISA及LFD檢測方法應(yīng)用在不同的轉(zhuǎn)基因作物中，具體見表2。

表2 轉(zhuǎn)基因植物基于蛋白水平的檢測方法Table 2 Detection method of transgenic plants based on protein level

3.1.4基于二代測序的轉(zhuǎn)基因植物檢測技術(shù)

隨著轉(zhuǎn)基因生物越來越多地出現(xiàn)在人們生活中，快速、高通量、靈敏、自動(dòng)化的轉(zhuǎn)基因檢測方法成為了重要的發(fā)展趨勢，也成為了轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品檢測的重點(diǎn)方向。目前已有的轉(zhuǎn)基因檢測方法主要是基于免疫學(xué)原理及PCR技術(shù)，而且這樣的轉(zhuǎn)基因檢測方法需要提前知道部分轉(zhuǎn)基因生物轉(zhuǎn)入的外源基因的序列信息，否則無法對其進(jìn)行檢測。然而對于某些只知其部分序列或者完全不知道其序列的轉(zhuǎn)基因植物來說，對這樣的轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)行監(jiān)管及檢測仍然存在很大的挑戰(zhàn)。二代測序技術(shù)(next generation sequencing, NGS)是近些年來提出的一種新技術(shù)，它可以大規(guī)模地對DNA片段進(jìn)行測序，從而實(shí)現(xiàn)數(shù)百次的測序讀數(shù)，因此在轉(zhuǎn)基因植物檢測領(lǐng)域有著很好的應(yīng)用前景[62]。相比于傳統(tǒng)的Sanger測序技術(shù)，NGS在測序速度、測序通量及測序規(guī)模上占據(jù)了絕對的優(yōu)勢。目前將二代測序技術(shù)(NGS)應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因植物檢測領(lǐng)域，主要存在2種策略:一種是已知部分序列信息，將其進(jìn)行富集后進(jìn)行測序分析，也稱為靶標(biāo)富集法；另一種是完全不知樣品信息，需要對其進(jìn)行全基因組重測序來進(jìn)行分析，稱為全基因組測序(whole genome sequencing, WGS)方法[63]。隨著近些年NGS的快速發(fā)展，該項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)運(yùn)用在了不同的領(lǐng)域中，轉(zhuǎn)基因植物檢測及鑒別也包括在其中，具體見表3。

靶標(biāo)富集策略可以從復(fù)雜基因組中獲得需要的目的基因序列，這點(diǎn)對基因組比較復(fù)雜的植物來說更有意義。因?yàn)榧词怪挥胁糠忠阎蛄校胍东@更多目標(biāo)區(qū)域的序列，二代測序技術(shù)不管在時(shí)間還是成本上，都有絕對的優(yōu)勢和能力。對于靶標(biāo)富集策略主要有2種方法：一種是利用PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物建立DNA文庫；另一種是從整個(gè)基因組文庫中選擇特定DNA片段進(jìn)行測序。Liang等[64]通過富集靶標(biāo)基因vip3Aa20，并用2種不同的二代測序平臺(tái)(Illumina或Pacific Biosciences平臺(tái))對富集產(chǎn)物進(jìn)行測序，研究表明2種不同測序平臺(tái)都能夠?qū)Ξa(chǎn)物進(jìn)行分析。與Illumina技術(shù)相比，Pacific Biosciences系統(tǒng)并不總是對基因組DNA進(jìn)行剪切，因此在許多情況下可以避免從頭組裝。而且，對于不同大小片段的DNA，包括長達(dá)40 kbp片段都有一定的優(yōu)勢。2014年，Song等[65]從不同濃度的玉米及大豆樣本中通過PCR擴(kuò)增子測序鑒定出了是否是玉米或是大豆，不僅鑒定出了不同的轉(zhuǎn)基因Bt11、Bt176，同時(shí)也鑒定出了不同的轉(zhuǎn)基因元件如CP4-EPSPS、p35S啟動(dòng)子和tNOS終止子。

全基因組重測序(whole genome sequencing, WGS)策略能夠在對樣本信息完全未知的情況下對轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行分析。這種測序策略是將基因組DNA剪切成小片段，構(gòu)成DNA文庫，然后連上接頭進(jìn)行測序。將生成的reads通過生物信息工具與已知的轉(zhuǎn)基因生物信息進(jìn)行比對。當(dāng)對外源插入序列未知時(shí)，插入片段及旁側(cè)序列是通過能夠比對上或未比對上植物內(nèi)源參考基因組的contig來鑒別的。WGS方法已經(jīng)應(yīng)用在了轉(zhuǎn)基因水稻LLRICE62事件的分子特征分析中，其以粳稻基因組(Oryzasativassp.Japonica)作為水稻參考基因組進(jìn)行比對，與研發(fā)者提供的信息相一致并找到了未知的插入位點(diǎn)[66]。此外，WGS也同樣應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因亞麻FP967及轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1和T1c-19的分子特征分析中[4,67]。因此，在轉(zhuǎn)基因檢測領(lǐng)域，尤其是對未經(jīng)過認(rèn)證的轉(zhuǎn)基因生物及未知轉(zhuǎn)基因生物，二代測序(NGS)技術(shù)發(fā)揮了極大的優(yōu)勢，可以通過鑒定其序列，直接證明轉(zhuǎn)基因生物在食物/飼料基質(zhì)中的存在。然而在日常的轉(zhuǎn)基因檢測中實(shí)施NGS仍然是困難的，因?yàn)槠涑杀鞠鄬^高，并且需要足夠的計(jì)算機(jī)基礎(chǔ)設(shè)施和專業(yè)的生物信息人員來處理數(shù)據(jù)。盡管如此，二代測序技術(shù)依然能夠在轉(zhuǎn)基因檢測領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景，更為樣本成分復(fù)雜、樣本信息未知的轉(zhuǎn)基因檢測提供了一種可能，更為轉(zhuǎn)基因生物的安全評價(jià)提供了有力的技術(shù)支持和保障。

表3 現(xiàn)有的二代測序技術(shù)在轉(zhuǎn)基因植物檢測上的應(yīng)用Table 3 Application of current second-generation sequencing technology in detection of transgenic plants

3.2 轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境安全檢測

轉(zhuǎn)基因植物會(huì)影響其周圍的生存環(huán)境，主要表現(xiàn)在：1)對其生長土壤的影響，比如促進(jìn)或妨礙土壤中一些微生物的生長與繁殖，改變土壤中的營養(yǎng)成分等；2)對周圍環(huán)境中生物多樣性的影響，比如實(shí)現(xiàn)自主性授粉的部分轉(zhuǎn)基因植物會(huì)導(dǎo)致該地區(qū)蝴蝶、蜜蜂等昆蟲數(shù)量的減少；3)對周圍植物生存競爭能力的影響，比如由于環(huán)境的選擇性，會(huì)導(dǎo)致最適應(yīng)植物的大量繁殖等[69]。因此，需要對轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境安全進(jìn)行檢測及評估。

目前轉(zhuǎn)基因作物中，抗蟲、耐除草劑的性狀應(yīng)用最多。含有耐除草劑性狀的轉(zhuǎn)基因植物的使用大大減少了草甘膦、草銨膦除草劑的使用，抗蟲轉(zhuǎn)基因作物的應(yīng)用也減少了化學(xué)殺蟲劑的使用。因此，對于目前轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境安全檢測，最主要從以下這些方面進(jìn)行檢測及評估：1)靶標(biāo)除草劑耐受性檢測；2)非靶標(biāo)除草劑耐受性檢測；3)抗蟲性檢測；4)生存競爭能力檢測；5)花粉活力檢測；6)對生物多樣性的影響檢測；7)對非靶標(biāo)生物(如二斑葉螨、家蠶、蚯蚓、蜜蜂等生物)影響檢測。

3.3 轉(zhuǎn)基因植物的食用安全檢測

轉(zhuǎn)基因植物的食用安全性一直是政府、群眾關(guān)心的焦點(diǎn)話題。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，影響轉(zhuǎn)基因食品安全性的主要因素主要包括2類，即轉(zhuǎn)入的基因及外源基因表達(dá)的蛋白，這2個(gè)因素也是評價(jià)轉(zhuǎn)基因食品安全性的主要對象。轉(zhuǎn)基因植物的食用安全檢測主要考慮幾下一些因素：1)該蛋白是不是長期安全食用的；2)該蛋白的結(jié)構(gòu)與功能是否與長期安全食用的蛋白有聯(lián)系；3)該蛋白在生物功能上的安全性；4)在氨基酸序列上評估該蛋白是否與已知過敏原、抗?fàn)I養(yǎng)因子及毒蛋白等具有同源性；5)評估該蛋白在理化特性上是否與過敏蛋白相同；6)該蛋白是否容易被胃、腸道蛋白消化；7)轉(zhuǎn)基因食品的非預(yù)期效應(yīng)[70]。此外，對于轉(zhuǎn)基因安全性檢測及評價(jià)存在的諸多不確定性，為了盡可能最大程度保證轉(zhuǎn)基因植物的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)效益，各國政府組織、科研人員和國際組織秉承著依據(jù)科學(xué)、實(shí)質(zhì)等同性、個(gè)案評估、逐步評估等原則制定出較完善的評價(jià)體系[71]。

基于影響轉(zhuǎn)基因植物食用安全檢測的因素及評估轉(zhuǎn)基因植物安全性的原則，根據(jù)CAC《重組DNA植物及其食品安全性評價(jià)指南》(CAC/GL 45-2003)的規(guī)定，目前對轉(zhuǎn)基因植物的食用安全性評價(jià)主要從如下這些方面進(jìn)行評估：1)營養(yǎng)成分；2)抗?fàn)I養(yǎng)因子；3)毒性；4)過敏性；5)抗生素抗性等。在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的食用安全性評價(jià)中，對其營養(yǎng)價(jià)值的評估是很重要的部分，其次對其關(guān)鍵成分，要利用動(dòng)物喂養(yǎng)試驗(yàn)評估轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因食品的安全性[71]。

我國對轉(zhuǎn)基因植物的食用安全性檢測，以實(shí)質(zhì)等同性原則為基礎(chǔ)，結(jié)合個(gè)案分析、逐步評估和預(yù)先防范的原則等制定，主要包括4個(gè)部分：1)評估轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的基本信息，包括受體與供體的食用安全情況、實(shí)際外源插入信息及目的基因及載體構(gòu)建圖譜等；2)營養(yǎng)學(xué)評估，包括關(guān)鍵營養(yǎng)成分、抗?fàn)I養(yǎng)因子等；3)毒理學(xué)評估，包括急性毒理實(shí)驗(yàn)、亞慢性及慢性毒性測試等；4)依據(jù)FAO/WHO的過敏原評估標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行過敏性評估；5)其他包括抗生素標(biāo)記基因安全性、非預(yù)期效應(yīng)及其在加工過程中的安全性等。

4 轉(zhuǎn)基因植物檢測技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化

4.1 轉(zhuǎn)基因植物檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化的必要性

轉(zhuǎn)基因植物的安全問題一直以來是全球關(guān)注和爭論的焦點(diǎn)。大多數(shù)國家及國際組織一直都高度重視轉(zhuǎn)基因的安全性問題，不僅制定了相關(guān)法律法規(guī)，實(shí)施轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識制度，同時(shí)不斷加強(qiáng)檢測技術(shù)研究及其標(biāo)準(zhǔn)化，并出臺(tái)一系列檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范[72]。在標(biāo)準(zhǔn)化組織機(jī)構(gòu)的組織下，通過標(biāo)準(zhǔn)化程序及標(biāo)準(zhǔn)化體系制定的轉(zhuǎn)基因植物檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)可以為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的監(jiān)管及轉(zhuǎn)基因管理政策的實(shí)施提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持和依據(jù)。

4.2 國外轉(zhuǎn)基因植物檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化的現(xiàn)狀

目前，世界各國及國際組織也相繼建立了專門的機(jī)構(gòu)或部門負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)工作的制定，我們所熟知的部門主要有聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)、國際食品法典委員會(huì)(CAC)、國際標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(ISO)、歐洲標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CEN)等。不同國家為轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)制定成立專門的工作小組，主要負(fù)責(zé)檢測技術(shù)研究、檢測方法驗(yàn)證、檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)制定及審核發(fā)布等(https:∥www.antpedia.com/standard/sp/633873.html)。例如，歐洲標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)食品分析技術(shù)委員會(huì)(CEN/TC275)成立負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)基因食品檢測標(biāo)準(zhǔn)制定的工作小組。在標(biāo)準(zhǔn)化體系建設(shè)中，歐盟針對轉(zhuǎn)基因植物檢測，從樣品抽取、核酸提取、核酸檢測、蛋白檢測等方面開展了一系列的研究，制定了相對比較完善的檢測方法及技術(shù)體系，并對已建立的檢測方法開展系列驗(yàn)證。目前，國際標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(ISO)已經(jīng)發(fā)布過7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，歐盟也有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)，比如歐洲標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CEN)關(guān)于轉(zhuǎn)基因檢測方法發(fā)布了4項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)，其中德國標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)會(huì)、法國標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)、英國標(biāo)準(zhǔn)學(xué)會(huì)關(guān)于轉(zhuǎn)基因檢測和核酸檢測發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)均與ISO與CE檢測標(biāo)準(zhǔn)一致，具體信息可見表4。

4.3 我國轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化體系的現(xiàn)狀

我國政府也十分重視轉(zhuǎn)基因生物安全管理工作，建立了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》、《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)管理辦法》等配套管理辦法，組織制定了轉(zhuǎn)基因生物安全檢測標(biāo)準(zhǔn)體系框架和標(biāo)準(zhǔn)修制訂規(guī)劃[73]。我國從事轉(zhuǎn)基因檢測機(jī)構(gòu)主要分布在國家質(zhì)檢系統(tǒng)和農(nóng)業(yè)系統(tǒng)，質(zhì)檢系統(tǒng)主要負(fù)責(zé)進(jìn)出口的轉(zhuǎn)基因檢測工作。國內(nèi)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)準(zhǔn)主要是由農(nóng)業(yè)部和質(zhì)檢總局制定和發(fā)布，全國農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)秘書處設(shè)在農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心。質(zhì)檢總局發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)形式為國標(biāo)(GB)及其行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(SN)，農(nóng)業(yè)部發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)形式有農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY)和農(nóng)業(yè)部公告兩種。

表4 國際組織/機(jī)構(gòu)發(fā)布的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)Table 4 Technical standards for genetic modification testing issued by international organizations/institutions

目前我國已制定了關(guān)于轉(zhuǎn)基因生物檢測方法的農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和國家標(biāo)準(zhǔn)有128項(xiàng)，其中農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)有89項(xiàng)，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)有26項(xiàng)和國家標(biāo)準(zhǔn)有13項(xiàng)。這些標(biāo)準(zhǔn)主要分為3類，分別為環(huán)境安全評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)、食用安全評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和產(chǎn)品成分檢測標(biāo)準(zhǔn)(https:∥www.antpedia.com/standard/sp/633873.html)。標(biāo)準(zhǔn)中覆蓋了大部分已經(jīng)商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因大豆、水稻、玉米、油菜、棉花、小麥、苜蓿、甜菜、番茄等含有的抗病毒、抗蟲及耐除草劑基因、報(bào)告基因、內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因等檢測項(xiàng)目，但不足的是，轉(zhuǎn)基因花卉、水果和轉(zhuǎn)基因林木等仍然缺乏相關(guān)的檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，還有待后續(xù)不斷研究和開發(fā)[74]。

與發(fā)達(dá)國家相比，我國轉(zhuǎn)基因生物安全管理、轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)化研究還存在一定的問題和不足，仍有提升的空間[75]。目前我國轉(zhuǎn)基因植物檢測標(biāo)準(zhǔn)常見的問題有：標(biāo)準(zhǔn)中部分引物特異性不高、定性檢測方法中部分?jǐn)U增片段太短、未根據(jù)基因組復(fù)雜性規(guī)定DNA用量、標(biāo)準(zhǔn)制定滯后于轉(zhuǎn)基因植物培育、未商業(yè)化轉(zhuǎn)基因植物缺乏相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)、定量標(biāo)準(zhǔn)未覆蓋大部分商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因植物等。對于上述提出的不足，對于轉(zhuǎn)基因植物檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化的工作來說，還需進(jìn)一步的探討和完善[76]。

為了促進(jìn)我國轉(zhuǎn)基因植物及產(chǎn)品檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程，首先需要在轉(zhuǎn)基因植物安全性和檢測技術(shù)研究上投入更多的人力和財(cái)力；其次整合優(yōu)勢資源，構(gòu)建我國轉(zhuǎn)基因生物檢測技術(shù)網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)，形成與國際接軌的轉(zhuǎn)基因植物檢測技術(shù)研究及其標(biāo)準(zhǔn)化體系；此外，隨著新的轉(zhuǎn)基因植物品種的出現(xiàn)，努力使標(biāo)準(zhǔn)完全覆蓋商業(yè)化轉(zhuǎn)基因品種。

5 總結(jié)與展望

隨著轉(zhuǎn)基因植物新品種的不斷研發(fā)和培育以及新的基因編輯技術(shù)和產(chǎn)品的出現(xiàn)，使得轉(zhuǎn)基因植物及產(chǎn)品的生物標(biāo)識管理和檢測變得日益重要，因此需要科研人員開發(fā)更多、更有效的新技術(shù)、新方法用于轉(zhuǎn)基因檢測?？焖佟⒏咄康臋z測方法在未來將成為轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測技術(shù)研發(fā)的主要方向，為我國甚至世界各國的轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識和監(jiān)管提供強(qiáng)有力的工具。此外，我國仍需完善轉(zhuǎn)基因植物的安全監(jiān)管檢測體系，進(jìn)一步加快檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化研究進(jìn)程。從長遠(yuǎn)角度考慮，轉(zhuǎn)基因植物檢測技術(shù)研發(fā)必須與其標(biāo)準(zhǔn)化及安全管理協(xié)調(diào)進(jìn)行，從而保證轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品在我國長期有效的安全監(jiān)管。有效的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)及安全監(jiān)管可以保障技術(shù)研究快速發(fā)展，研究技術(shù)的發(fā)展有助于促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植物安全監(jiān)管能力的提高，兩者協(xié)同進(jìn)行，能夠更好地為我國轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)及其標(biāo)準(zhǔn)化研究工作提供有力的技術(shù)支持和保障。