關(guān)學(xué)農(nóng)，張 敏，蘇運(yùn)聰，王 瑤,*，李 飛，李興佳，杜利衛(wèi)，張耀廣，柴艷兵

（1.河北省食品工業(yè)協(xié)會(huì)，河北 石家莊 050021；2.君樂寶乳業(yè)集團(tuán)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部乳品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050021）

激動(dòng)劑也稱興奮劑，是一種能增強(qiáng)分子活性、促進(jìn)某種反應(yīng)的藥物、酶激動(dòng)劑和激素類分子[1]。由于能激活或增強(qiáng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)活性，興奮劑會(huì)對(duì)人的生理、心理產(chǎn)生極大危害，包括心力衰竭、激動(dòng)狂躁、前列腺肥大、糖尿病、心臟病等，嚴(yán)重?fù)p害身心健康[2]。β-興奮劑類藥物俗稱“瘦肉精”，常用的包括鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林等十幾種物質(zhì)，其中以克倫特羅和沙丁胺醇最為常見。

克倫特羅（又名雙氯醇胺、氨哮素、克喘素），是一種人工合成的β-受體激動(dòng)劑，可以松弛支氣管平滑肌?？藖鎏亓_為瘦肉精的主要成分，由于能促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，提高動(dòng)物的瘦肉率而備受關(guān)注[3]。但克倫特羅在動(dòng)物可食性組織中殘留蓄積，導(dǎo)致食用這些動(dòng)物組織的人產(chǎn)生中毒反應(yīng)，進(jìn)一步危害人體健康。沙丁胺醇與克倫特羅的促生長(zhǎng)作用相差不大，將其作為飼料添加劑使用，也可以顯著促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高飼料轉(zhuǎn)化率和瘦肉率，而且在動(dòng)物體內(nèi)的消除時(shí)間更短，毒性較弱，因此沙丁胺醇成為克倫特羅最理想的替代品[4]。但在養(yǎng)殖過程中沙丁胺醇被長(zhǎng)期、超量使用，也會(huì)在動(dòng)物組織中殘留蓄積，仍然對(duì)人們食用動(dòng)物組織的安全性存在極大威脅。

農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告中《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》將克倫特羅、沙丁胺醇、西馬特羅列為所有食品動(dòng)物可食組織的禁用藥物。但2020年1月實(shí)施的農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第250號(hào)公告《食品動(dòng)物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》中把β-興奮劑類及其鹽、酯列為食品動(dòng)物中禁止使用的藥品，因此有必要加強(qiáng)對(duì)興奮劑類物質(zhì)的監(jiān)控。

目前檢測(cè)β-激動(dòng)劑類獸藥殘留的方法主要包括液相色譜法[5-8]、液相色譜-質(zhì)譜法[9-13]、氣相色譜法[14]、氣相色譜-質(zhì)譜法[15-18]和酶聯(lián)免疫分析法[19-20]等。酶聯(lián)免疫分析法易出現(xiàn)假陽(yáng)性，液相色譜與氣相色譜法檢測(cè)靈敏度較低，目前液相色譜-質(zhì)譜法應(yīng)用更廣泛，因此本研究建立采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛乳中β-受體激動(dòng)劑含量的方法，以期為牛乳中興奮劑類物質(zhì)的監(jiān)測(cè)和管控提供科研依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生牛乳 市售。

克倫特羅、沙丁胺醇、西馬特羅、特布他林、非諾特羅、氯丙那林、萊克多巴胺、妥布特羅、噴布特羅、齊帕特羅、西布特羅、溴布特羅、克侖潘特、羥甲基克侖特羅、苯氧丙酚胺、克侖普羅、班布特羅、利托君、馬賁特羅標(biāo)準(zhǔn)品（純度均大于95%）德國(guó)Dr.Eherenstorfer GmbH公司；乙腈、甲醇（均為色譜純）、甲酸（質(zhì)譜級(jí)） 德國(guó)默克公司；甲酸銨（色譜級(jí)） 美國(guó)Sigma公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（18.0 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀、Oasis PRIME H L B柱（5 0 0 m g，6 m L）、B E H C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm） 美國(guó)Waters公司；Milli-Q ZMQS50001超純水機(jī) 美國(guó)密理博公司；LYNX4000高速落地離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；ME203E/02電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

19 種β-受體激動(dòng)劑獸藥化合物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（100 μg/mL）：分別稱取適量克倫特羅、沙丁胺醇、西馬特羅、特布他林、非諾特羅、氯丙那林、萊克多巴胺、妥布特羅、噴布特羅、齊帕特羅、西布特羅、溴布特羅、克侖潘特、羥甲基克侖特羅、苯氧丙酚胺、克侖普羅、班布特羅、利托君、馬賁特羅標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，分別配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，-20 ℃條件下保存。

19 種β-受體激動(dòng)劑獸藥化合物混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（100 ng/mL）：分別移取適量19 種獸藥化合物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（100 μg/mL），用甲醇定容，配制成質(zhì)量濃度為100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，-20 ℃條件下保存。

19 種基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液：準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（100 ng/mL）適量，用空白基質(zhì)溶液配制成質(zhì)量濃度分別為0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/mL的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 前處理方法優(yōu)化

考察3 種不同前處理方法對(duì)加標(biāo)牛乳樣品中目標(biāo)化合物回收率的影響。

樣品提取液的制備：取經(jīng)混勻的生牛乳1.00 g于50 mL離心管中，加入5 mL萃取試劑（100 mL乙腈和0.2 mL甲酸混合均勻，現(xiàn)配現(xiàn)用），渦旋振蕩1 min，10 000 r/min條件下離心5 min，得上清液。

方法1：樣品提取液直接上機(jī)檢測(cè)。取上清液經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后上機(jī)檢測(cè)。

方法2：樣品提取液經(jīng)固相萃取柱凈化后上機(jī)檢測(cè)。取Oasis PRIME HLB固相萃取柱，用體積分?jǐn)?shù)80%乙腈水溶液活化后，將上清液過柱，保持1 滴/s的流速，收集全部流出液，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后上機(jī)檢測(cè)。

方法3：樣品提取液經(jīng)固相萃取柱凈化后經(jīng)氮吹濃縮復(fù)溶后上機(jī)檢測(cè)。用體積分?jǐn)?shù)80%乙腈水溶液活化Oasis PRIME HLB固相萃取柱后，將上清液過柱，保持1 滴/s的流速，收集全部流出液，氮?dú)獯蹈桑尤? mL體積分?jǐn)?shù)50%甲醇水溶液溶解，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2.2 提取溶劑優(yōu)化

最常用的提取溶劑為甲醇和乙腈，因此選擇甲醇、乙腈為提取溶劑對(duì)樣品進(jìn)行處理，比較2 種提取溶劑對(duì)19 種β-受體激動(dòng)劑類藥物提取效率的影響。

1.3.3 色譜條件

BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱溫30 ℃，進(jìn)樣量5 μL，流速0.3 mL/min，流動(dòng)相采用甲醇與5 mmol/L甲酸銨-0.1%甲酸水溶液，進(jìn)行梯度洗脫。洗脫梯度見表1。

表1 超高效液相色譜流動(dòng)相梯度洗脫條件Table 1 Mobile phase gradient conditions for UPLC

1.3.4 質(zhì)譜條件

檢測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；離子源控制條件：毛細(xì)管電壓2.00 kV；錐孔反吹氣流速150 L/h；脫溶劑氣溫度450 ℃；脫溶劑氣流速900 L/h；離子選擇參數(shù)參見表2。

表2 19 種β-受體激動(dòng)劑離子選擇參數(shù)Table 2 Selected ion parameters for 19β-agonists

續(xù)表2

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 9繪圖軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的確定

2.1.1 前處理方法的選擇

考察3 種不同前處理方法對(duì)加標(biāo)牛乳樣品中目標(biāo)化合物回收率的影響。由圖1可知，采用方法1時(shí)，19 種目標(biāo)化合物的回收率均明顯低于60%，可能是由于牛乳中的雜質(zhì)，如脂肪、蛋白質(zhì)等[21]對(duì)樣品檢測(cè)產(chǎn)生干擾，因此需要進(jìn)一步凈化以去除雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)的影響。采用方法2上機(jī)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，19 種目標(biāo)化合物的回收率均有所提高，均大于60%，其中有8 種目標(biāo)化合物的回收率為70%～100%，說明該方法能夠有效去除雜質(zhì)干擾。但由于該方法的樣品體積較大，檢測(cè)濃度低，導(dǎo)致檢測(cè)精密度較差，因此有必要對(duì)樣品進(jìn)行濃縮后再上機(jī)檢測(cè)。采用方法3上機(jī)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，19 種目標(biāo)化合物的回收率均可達(dá)到70%～100%。此外與方法2相比，各物質(zhì)的回收率有了進(jìn)一步提高，樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）均在10%以內(nèi)，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確度。因此最終確定采用HLB固相萃取柱凈化后濃縮復(fù)溶的樣品制備方法。

2.1.2 提取溶劑的選擇

由圖2可知，以甲醇和乙腈為提取溶劑，19 種目標(biāo)化合物加標(biāo)回收率無(wú)明顯差異，均能夠達(dá)到70%～100%。但由圖3～4可知，以甲醇為提取溶劑時(shí)色譜峰較雜亂，說明甲醇提取的樣品中雜質(zhì)較多；乙腈有較好的沉淀蛋白作用，因此綜合考慮，選取乙腈作為提取溶劑。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、回收率和精密度

采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)常出現(xiàn)基質(zhì)干擾現(xiàn)象，本研究采用基質(zhì)曲線進(jìn)行分析。

將配制好的19 種基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液上機(jī)檢測(cè)，以目標(biāo)峰面積為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。對(duì)分別添加0.2、0.5、1.0 μg/kg 19 種目標(biāo)化合物的牛乳樣品進(jìn)行處理，每個(gè)添加量6 份平行試樣，按最優(yōu)方法提取、凈化和測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率，考察方法準(zhǔn)確度。計(jì)算RSD，考察方法精密度。

表3 19 種β-受體激動(dòng)劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)、回收率和精密度Table 3 Calibration equations, correlation coef ficients, recovery rates and precision for 19β-agonists

由表4可知，在0～10.0 ng/mL范圍內(nèi)，19 種β-受體激動(dòng)劑的線性方程均滿足R2≥0.995的要求。牛乳中19 種β-受體激動(dòng)劑的回收率為70.6%～104.5%，準(zhǔn)確度較高。RSD為1.1%～11.7%，精密度較高。

2.3 方法檢出限及定量限

向空白樣品中添加適量的19 種β-受體激動(dòng)劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)最優(yōu)方法測(cè)定，得到特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比（RS/N）和對(duì)應(yīng)的各物質(zhì)質(zhì)量濃度，RS/N=3時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為方法檢出限，RS/N=10對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為方法定量限。當(dāng)取樣量為1.0 g，定容體積為1 mL時(shí)，計(jì)算出本方法的檢出限為0.01 μg/kg，定量限為0.2 μg/kg。

3 結(jié) 論

通過考察2 種常見的提取溶劑和不同提取方法對(duì)牛乳中19 種β-受體激動(dòng)劑提取效率的影響，最終確定以乙腈為提取溶劑，Oasis PRIME HLB固相萃取柱凈化后采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。該方法操作簡(jiǎn)單快捷、靈敏度好、精密度高，可滿足牛乳中19 種β-受體激動(dòng)劑同時(shí)檢測(cè)的要求，同時(shí)也可以為其他類獸藥殘留檢測(cè)提供技術(shù)支持。