甄洪濤 王朝亮

膀胱癌是臨床常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，在男性中發(fā)病率居于第6位，女性中居于第16位，近年來(lái)發(fā)病率和致死率均呈上升趨勢(shì)[1]。目前，膀胱癌以手術(shù)切除結(jié)合化療等綜合治療為主，但仍有較高的復(fù)發(fā)率，給患者生命健康造成嚴(yán)重威脅[2]。研究表明，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是上皮細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤獲得侵襲和遷移能力的主要原因之一，與病灶遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及化療耐藥等不良預(yù)后關(guān)系密切[3]。目前關(guān)于膀胱癌細(xì)胞EMT調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明，尋找針對(duì)性干預(yù)靶點(diǎn)，對(duì)改善疾病預(yù)后有重要意義。八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(octamer blinding transcription fator 4，Oct4)B1是胚胎干細(xì)胞干性轉(zhuǎn)錄因子Oct4的主要亞型。近年來(lái)研究表明，Oct4在膀胱癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，且表達(dá)程度與膀胱癌轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)期預(yù)后關(guān)系密切[4]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Oct4B1基因過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力[5]。目前，關(guān)于Oct4B1基因?qū)Π螂装┘?xì)胞EMT過(guò)程的影響研究尚少，本研究應(yīng)用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)沉默膀胱癌T24細(xì)胞Oct4B1基因，觀察對(duì)細(xì)胞EMT過(guò)程的影響，并初步探討其影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人膀胱癌T24細(xì)胞株，購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。

1.1.2 主要試劑和儀器 含綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的Oct4B1-短發(fā)夾RNA(shRNA)質(zhì)粒干擾載體、陰性對(duì)照質(zhì)粒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，蛋白激酶B激動(dòng)劑(胰島素樣生長(zhǎng)因子IGF-I，美國(guó)Abcam公司)，LipofactamineTM2000試劑盒、RNA提取試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)，全蛋白提取試劑盒(上海藍(lán)基生物科技有限公司)，Transwell小室(美國(guó)Corning Incorporated公司)，兔抗人Oct4B1多抗、兔抗人E-cadherin、Vimentin、N-cadherin單抗、兔抗人p-AKT、p-GSK-3β、β-catenin單抗(美國(guó)Abcam公司)，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(北京中山金橋生物技術(shù)有限公司)。Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)，7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI)，CheniDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 取對(duì)數(shù)期T24細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/ml，重新接種于6孔板，細(xì)胞再次融合達(dá)60%時(shí)，按照LipofactamineTM2000試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將Oct4B1-shRNA質(zhì)粒干擾載體、陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)入T24細(xì)胞中，分別設(shè)為shRNA組、shRNA-NC組，每組5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)5 h后，更換培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI1640，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

另取轉(zhuǎn)染至8 h的shRNA組、shRNA-NC組細(xì)胞，分別用AKT激動(dòng)劑IGF-I(100 ng/ml)處理12 h，分別設(shè)為shRNA+AKT激動(dòng)劑組、shRNA-NC+AKT激動(dòng)劑組，每組5個(gè)復(fù)孔，然后更換常規(guī)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 Oct4B1 mRNA表達(dá)檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染至24 h的shRNA組、shRNA-NC組細(xì)胞及shRNA+AKT激動(dòng)劑組、shRNA-NC+AKT激動(dòng)劑組細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明說(shuō)提取總RNA，并用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物序列：Oct4B1：F:5′-CTGATGCTGGAACGTTAGCTG-3′,R:5′-AGTAGCTGTGATGCGTGATGC-3′;β-actin：F:5′-TAGCTGATGCTGTGAAACCT-3′;R:5′-CTATGCTGTAGTGCTGATCG-3′。按照說(shuō)明說(shuō)設(shè)定反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；40個(gè)循環(huán)(94 ℃變性20 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s)；72 ℃延伸5 min。以β-actin為內(nèi)參對(duì)照，2-△△CT為Oct4B1的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。

1.2.3 侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)shRNA組、shRNA-NC組、shRNA+AKT激動(dòng)劑組、shRNA-NC+AKT激動(dòng)劑組細(xì)胞侵襲能力。Transwell小室濾膜由RPMI 1640培養(yǎng)基1∶6稀釋的Matrigel包被，將小室放入24孔板，上層小室加入密度為2.0×105/ml各組細(xì)胞懸液200 μl，下層小室加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)24 h，用無(wú)菌棉簽擦去上層小室細(xì)胞，以0.1%結(jié)晶紫染色0.5 h，顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)隨機(jī)視野中的穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.2.4 遷移能力檢測(cè) 采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)shRNA組、shRNA-NC組、shRNA+AKT激動(dòng)劑組、shRNA-NC+AKT激動(dòng)劑組細(xì)胞遷移能力。取各組細(xì)胞以2×104/ml重新接種至24孔板，完全融合為單層細(xì)胞后，用20 μl無(wú)菌槍頭劃直線，PBS輕柔沖洗劃痕邊緣，記為0 h，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，各組細(xì)胞于0 h和48 h分別取3個(gè)不同視野進(jìn)行拍照，Image分析計(jì)算細(xì)胞遷移率(%)=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.5 上皮間質(zhì)標(biāo)記物E-cadherin、Vimentin、N-cadherin及AKT/GSK-3β/β-catenin通路蛋白表達(dá)檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染至24 h的shRNA組、shRNA-NC組細(xì)胞及shRNA+AKT激動(dòng)劑組、shRNA-NC+AKT激動(dòng)劑組細(xì)胞，PBC洗滌后轉(zhuǎn)至離心管，按照全蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總蛋白，并進(jìn)行BCA蛋白定量。取40 μg待測(cè)蛋白進(jìn)行SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳恒壓分離，濕法轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，加入5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，然后加入一抗稀釋液(E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、β-catenin均為1∶1 000，p-AKT、p-GSK-3β為1∶2 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗稀釋液(1∶10 000)，常溫孵育2 h，以目的蛋白與內(nèi)參對(duì)照β-actin灰度值比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率觀察

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后，于光學(xué)顯微鏡和倒置熒光顯微鏡下觀察并計(jì)算shRNA組和shRNA-NC組轉(zhuǎn)染效率均>80%，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 各組Oct4B1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

RT-qPCR結(jié)果顯示，shRNA組、shRNA+AKT激動(dòng)劑組、shRNA-NC組、shRNA-NC+AKT激動(dòng)劑組Oct4B1 mRNA相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。與shRNA組比較，shRNA+AKT激動(dòng)劑組、shRNA-NC組、shRNA-NC+AKT激動(dòng)劑組Oct4B1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均較高(P<0.05)；與shRNA+AKT激動(dòng)劑組比較，shRNA-NC組、shRNA-NC+AKT激動(dòng)劑組Oct4B1 mRNA相對(duì)表達(dá)量較高(P<0.05)，shRNA-NC+AKT激動(dòng)劑組高于shRNA-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組Oct4B1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.3 各組細(xì)胞侵襲能力比較

Transwell結(jié)果顯示，shRNA組、shRNA+AKT激動(dòng)劑組、shRNA-NC組、shRNA-NC+AKT激動(dòng)劑組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(21.20±3.41)個(gè)/視野、(46.80±5.73)個(gè)/視野、(95.40±10.36)個(gè)/視野、(126.60±11.48)個(gè)/視野，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=158.530，P<0.001)。與shRNA組比較，shRNA+AKT激動(dòng)劑組、shRNA-NC組、shRNA-NC+AKT激動(dòng)劑組穿膜細(xì)胞數(shù)均較多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.585、15.212、19.680，均P<0.001)；與shRNA+AKT激動(dòng)劑組比較，shRNA-NC組、shRNA-NC+AKT激動(dòng)劑組穿膜細(xì)胞數(shù)均較多(t=9.179、13.907，均P<0.001)，且shRNA-NC+AKT激動(dòng)劑組多于shRNA-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.02，P=0.002)，見(jiàn)圖1。

注：a為P<0.05，與shRNA組比較；b為P<0.05，與shRNA + AKT激動(dòng)劑組比較；c為P<0.05，與shRNA-NC組比較。

2.4 各組細(xì)胞遷移能力比較

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，shRNA組、shRNA+AKT激動(dòng)劑組、shRNA-NC組、shRNA-NC+AKT激動(dòng)劑組細(xì)胞48 h遷移率分別為(25.41±4.40)%、(33.88±5.87)%、(65.15±6.50)%、(86.64±9.38)%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=87.144，P<0.001)。與shRNA組比較，shRNA+AKT激動(dòng)劑組、shRNA-NC組、shRNA-NC+AKT激動(dòng)劑組細(xì)胞48 h遷移率均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.211、10.622、13.215，P均<0.05)；與shRNA+AKT激動(dòng)劑組比較，shRNA-NC組、shRNA-NC+AKT激動(dòng)劑組細(xì)胞48 h遷移率較高(t=7.984、11.321，P均<0.001)，且shRNA-NC+AKT激動(dòng)劑組高于shRNA-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.582，P=0.033)。見(jiàn)圖2。

注：a為P<0.05，與shRNA組比較；b為P<0.05，與shRNA + AKT激動(dòng)劑組比較；c為P<0.05，與shRNA-NC組比較。

2.5 各組上皮間質(zhì)標(biāo)記物E-cadherin、Vimentin、N-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

E-cadherin、Vimentin、N-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與shRNA組比較，shRNA+AKT激動(dòng)劑組、shRNA-NC組、shRNA-NC+AKT激動(dòng)劑組E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，Vimentin、N-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與shRNA+AKT激動(dòng)劑組比較，shRNA-NC組、shRNA-NC+AKT激動(dòng)劑組E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，Vimentin、N-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；shRNA-NC+AKT激動(dòng)劑組E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量高于shRNA-NC組，Vimentin、N-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量低于shRNA-NC組(P<0.05)。見(jiàn)圖3A，3B。

注：a為P<0.05，與shRNA組比較；b為P<0.05，與shRNA + AKT激動(dòng)劑組比較；c為P<0.05，與shRNA-NC組比較。

2.6 各組AKT/GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較

p-AKT、p-GSK-3β、β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與shRNA組比較，shRNA+AKT激動(dòng)劑組、shRNA-NC組、shRNA-NC+AKT激動(dòng)劑組p-AKT、p-GSK-3β、β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與shRNA+AKT激動(dòng)劑組比較，shRNA-NC組、shRNA-NC+AKT激動(dòng)劑組p-AKT、p-GSK-3β、β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，且shRNA-NC+AKT激動(dòng)劑組低于shRNA-NC組(P<0.05)。見(jiàn)圖4A，4B。

注：a為P<0.05，與shRNA組比較；b為P<0.05，與shRNA + AKT激動(dòng)劑組比較；c為P<0.05，與shRNA-NC組比較。

3 討論

膀胱癌是一種直接威脅患者生命的疾病，目前，膀胱癌早期行手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后藥物灌注治療效果較為理想，但仍面臨病灶復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[6-7]。臨床調(diào)查顯示，膀胱淺表性癌經(jīng)尿道切除術(shù)后仍有10%～60%的患者在12個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)，最終進(jìn)展為肌層浸潤(rùn)性癌，預(yù)后生存期縮短，分析可能與膀胱癌EMT密切相關(guān)[8-10]。EMT是參與腫瘤侵襲和遷移的關(guān)鍵步驟，是指上皮細(xì)胞在外界誘因下向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過(guò)程，該過(guò)程中細(xì)胞失去極性及細(xì)胞間黏附能力，同時(shí)獲得運(yùn)動(dòng)特性，使癌細(xì)胞向遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移能力及抗凋亡能力增強(qiáng)，從而增加治療失敗的風(fēng)險(xiǎn)[11-12]。因此，尋找抑制膀胱癌細(xì)胞EMT過(guò)程的針對(duì)性靶點(diǎn)，對(duì)膀胱癌的治療有重要意義。

Oct4主要有3個(gè)亞型，Oct4A、Oct4B及Oct4B1，研究顯示，Oct4B1在調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞干性方面能力較其他亞型強(qiáng)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Oct4B1在包括膀胱癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[13-15]。Mirzaei等[16]研究認(rèn)為，Oct4B1具有抗凋亡特性，有助于癌細(xì)胞逃避凋亡機(jī)制，可能通過(guò)調(diào)控抗凋亡基因的表達(dá)發(fā)揮作用。Zhou等[17]通過(guò)檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞中Oct4B1基因表達(dá)變化與EMT的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Oct4B1基因可能通過(guò)促進(jìn)癌細(xì)胞EMT過(guò)程促進(jìn)細(xì)胞自我更新，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移過(guò)程。上述研究均說(shuō)明，高表達(dá)的Oct4B1基因有助于促進(jìn)癌細(xì)胞發(fā)生EMT，增強(qiáng)細(xì)胞侵襲和遷移能力。本研究采用RNAi技術(shù)成功敲低膀胱癌細(xì)胞中Oct4B1基因，應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，shRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)少于shRNA-NC組，48 h遷移率及E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于shRNA-NC組，Vimentin、N-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量高于shRNA-NC組，提示沉默Oct4B1基因可抑制T24細(xì)胞侵襲和遷移能力，抑制細(xì)胞EMT過(guò)程。

此外，本研究在RNAi沉默Oct4B1基因表達(dá)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用AKT激動(dòng)劑進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示shRNA-NC+AKT激動(dòng)劑組及shRNA+AKT激動(dòng)劑組Oct4B1 mRNA相對(duì)表達(dá)量、穿膜細(xì)胞數(shù)、48 h遷移率及E-cadherin蛋白表達(dá)均較shRNA-NC組、shRNA組升高，而shRNA+AKT激動(dòng)劑組低于shRNA-NC+AKT激動(dòng)劑組；Vimentin、N-cadherin及p-AKT、p-GSK-3β、β-catenin蛋白表達(dá)與上述結(jié)果相反，提示AKT信號(hào)通路激活有助于促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞EMT過(guò)程，增強(qiáng)其侵襲和轉(zhuǎn)移能力；而靶向沉默Oct4B1可抑制AKT激動(dòng)劑誘導(dǎo)的EMT過(guò)程，降低其侵襲和轉(zhuǎn)移能力，因此，沉默Oct4B1基因可能通過(guò)調(diào)控AKT/GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路抑制癌細(xì)胞EMT過(guò)程。AKT/GSK-3β/β-catenin是誘發(fā)EMT的重要信號(hào)通路[18]。AKT磷酸化激活后，引起下游GSK-3β絲氨酸9(Ser9)磷酸化，從而失去與β-catenin結(jié)合能力，細(xì)胞內(nèi)游離β-catenin增多進(jìn)而轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，該信號(hào)通路被活化[19-20]。β-catenin可與E-cadherin形成復(fù)合體，以維持上皮細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞間黏附作用，β-catenin活化后復(fù)合體穩(wěn)定性降低，導(dǎo)致細(xì)胞間連接松散，有利于細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[21]。

綜上所述，沉默Oct4B1基因可抑制膀胱癌T24細(xì)胞EMT過(guò)程，抑制癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力，沉默Oct4B1基因還能抑制AKT/GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路誘導(dǎo)的EMT轉(zhuǎn)化作用，為臨床抑制膀胱癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移提供了參考靶點(diǎn)。